蕭雅一 ，楊莉，牟雁東

(1.南充市中心醫(yī)院口腔科，四川 南充　637000；2.四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都　610041；3.四川省人民醫(yī)院口腔科，四川 成都　610000)

?

復(fù)合多肽溶菌酶在智牙冠周炎治療中的應(yīng)用

蕭雅一1，楊莉2，牟雁東3

(1.南充市中心醫(yī)院口腔科，四川 南充637000；2.四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都610041；3.四川省人民醫(yī)院口腔科，四川 成都610000)

目的：觀察復(fù)合多肽溶菌酶在智牙冠周炎治療中的協(xié)同抑菌效果和臨床療效分析。方法：研究分為兩部分，第一部分為體外抑菌實(shí)驗(yàn)，選擇智牙冠周炎內(nèi)常見(jiàn)的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、變形鏈球菌，以等二倍梯度稀釋法稀釋的人溶菌酶(human lysozyme，hLYZ)液和抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)DP7液，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)平板，經(jīng)37.0 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，測(cè)試hLYZ、AMPs DP7有無(wú)協(xié)同抑菌作用。第二部分為臨床實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)將智牙冠周炎患者分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各69例，實(shí)驗(yàn)組使用復(fù)合多肽溶菌酶漱口水，對(duì)照組使用口泰含漱液。連續(xù)3 d復(fù)診，分別在治療前、治療后第 1天和治療后第2天對(duì)患者冠周分泌物進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)和臨床指標(biāo)評(píng)價(jià)。結(jié)果：AMPs DP7和hLYZ聯(lián)合使用后，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌的標(biāo)準(zhǔn)株和部分耐藥株，變形鏈球菌的標(biāo)準(zhǔn)株產(chǎn)生協(xié)同抑菌作用。協(xié)同系數(shù)FIC=0.5。臨床結(jié)果表明，使用復(fù)合多肽溶菌酶漱口水后，冠周菌落計(jì)數(shù)明顯低于對(duì)照組(Z=-2.109，P=0.035)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)兩組間局部疼痛明顯好轉(zhuǎn)和張口度明顯增大的比較(χ2=5.412，P=0.032)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：AMPs DP7和hLYZ聯(lián)合應(yīng)用對(duì)引起智牙冠周炎的部分細(xì)菌具有良好的協(xié)同抑菌效果，復(fù)配后加入漱口水局部使用能有效減少盲袋和冠周內(nèi)細(xì)菌繁殖、緩解智牙冠周炎的癥狀。

復(fù)合多肽溶菌酶；智牙冠周炎；協(xié)同抑菌；臨床療效

【Abstract】Objective：To observe the synergistic antibacterial effect of composite polypeptide lysozyme in treating opsigenes pericoronitis and evaluate its clinical effect.Methods：This experiment was composed of two parts;the first part is in vitro bacteriostasis experiment,selecting the sensitive bacterium in opsigenes pericoronitis,including staphylococcus aureus,escherichia coli,pseudomonas aeruginosa,streptococcus mutan.Added the dilution of antibacterial peptides and human lysozyme by two times the gradient dilution method into 96 cell culture plate;after 24 hours culture in 37.0 ℃ constant temperature incubator,observed whether antibacterial peptides compound human lysozyme have synergistic antimicrobial effect or not.The second part is clinical experiment.Randomly divided patients into experimental group and control group,69 cases in each,the experimental group used compound lysozyme polypeptide mouthwash;the control group used compound chlorhexidine gargle.After three consecutive days of follow-up,which is before treatment,the first and second day after treatment,counted the colony of periodontal secretions and evaluated clinical indicators.Results：The combined use of antibacterial peptides and human lysozyme have synergistic antimicrobial effects to standard strains of staphylococcus aureus,escherichia coli,pseudomonas aeruginosa,streptococcus mutans,and parts of resistant strains of staphylococcus aureus,escherichia coli,pseudomonas aeruginosa.Conclusion：Antimicrobial peptides complex human lysozyme has good synergistic effect on some bacteria caused opsigenes pericoronitis,compounded as gargle water can effectively reduce the blind pouch bacterial reproduction,alleviate the symptoms of opsigenes pericoronitis.

智牙冠周炎是臨床上常見(jiàn)的口腔頜面部感染性疾病之一，常發(fā)生于18～30歲的青壯年[1]。智牙冠周炎早期局部治療，能有效阻止其向全身感染發(fā)展。目前臨床上常見(jiàn)的局部治療藥物主要以廣譜抗菌素為主，隨著耐藥菌株的出現(xiàn)和增多，新型的抗菌制劑逐漸受到青睞。本研究通過(guò)對(duì)人溶菌酶(human lysozyme，hLYZ)和DP7型抗微生物肽簡(jiǎn)稱(chēng)抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)的聯(lián)合應(yīng)用，觀察其對(duì)智牙冠周炎敏感細(xì)菌的協(xié)同抑制作用和臨床療效。

1　材料與方法

1.1體外抑菌實(shí)驗(yàn)

選擇對(duì)智牙冠周炎敏感的金黃色葡萄球菌6株,其中標(biāo)準(zhǔn)株1株(編號(hào)25923)，耐藥株5株(編號(hào)S2、S4、S5、S7、S8)；大腸桿菌9株,其中標(biāo)準(zhǔn)株1株(編號(hào)25922)，耐藥株8株(編號(hào)E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8)；綠膿桿菌3株，其中標(biāo)準(zhǔn)株1株(編號(hào)27853)，耐藥株2株(編號(hào)Pear1、Pear2)；變形鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株1株(編號(hào)25175)。分別配制菌液后經(jīng)酶標(biāo)儀在595 nm處測(cè)得OD值，根據(jù)OD值稀釋菌液，使其濃度為5×108CFU/L，此濃度即為實(shí)驗(yàn)需要的菌液濃度。

配制母液濃度為5 000 mg/L的hLYZ液和256 mg/L的AMPs液，并以等二倍法分別稀釋hLYZ液和AMPs液，見(jiàn)表1。

表1　hLYZ液和DP7液濃度(mg/L)

細(xì)菌培養(yǎng)：使用96孔平板，第一排分別加入濃度為128 mg/L 、64 mg/L、32 mg/L、16 mg/L、8 mg/L、4 mg/L的DP7液 100 μL作為DP7液對(duì)照組，第八排分別加入濃度為2 500 mg/L、1 250 mg/L、625 mg/L、312.5 mg/L、156.25 mg/L 、78.125 mg/L的hLYZ液100 μL作為hLYZ液對(duì)照組，再分別加入培養(yǎng)好的實(shí)驗(yàn)菌液100 μL；中間的棋盤(pán)格(6×6)分別在橫排加入50 μL的DP7液，濃度依次為64 mg/L、32 mg/L、16 mg/L、8 mg/L、4 mg/L、2 mg/L；豎排加入50 μL的hLYZ液，濃度依次為1 250 mg/L、625 mg/L、312.5 mg/L、156.25 mg/L、78.125 mg/L、39.062 5mg/L；再分別加入培養(yǎng)好的實(shí)驗(yàn)菌液100 μL作為聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)組。在37.0 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè)，測(cè)試hLYZ、DP7有無(wú)協(xié)同抑菌作用。

1.2臨床實(shí)驗(yàn)

1.2.1研究對(duì)象選擇在南充市中心醫(yī)院口腔科診斷為智牙冠周炎的患者138例做為研究對(duì)象，其中男性63例，女性75例，年齡19～45歲，平均年齡25.32歲。采用隨機(jī)、雙盲、平行對(duì)照設(shè)計(jì)方案，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各69例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)下頜第三磨牙阻生，智牙冠周炎急性發(fā)作，冠周牙齦紅腫，冠周、盲袋內(nèi)有食物殘?jiān)胺置谖铮?2)臨床癥狀有局部疼痛、張口度減小、進(jìn)食不方便者，個(gè)別患者有頜下淋巴結(jié)腫大；(3)無(wú)發(fā)熱，無(wú)全身感染癥狀者；(4)近期未使用抗菌素者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)口腔衛(wèi)生習(xí)慣較差，自身維護(hù)不力者；(2)妊娠期及哺乳期婦女；(3)患有內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、循環(huán)系統(tǒng)疾病、代謝疾病、血液疾病、營(yíng)養(yǎng)不良等。

1.2.2冠周、盲袋內(nèi)取樣冠周沖洗前，用微量移液器取冠周、盲袋內(nèi)分泌物1 μL，經(jīng)生理鹽水稀釋1 000倍，震蕩器震蕩30 s，均勻分散細(xì)菌團(tuán)塊后取1 μL樣本。

1.2.3細(xì)菌培養(yǎng)在生物安全柜內(nèi)，取1 μL樣本接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，在隔水培養(yǎng)箱內(nèi)，35.7 ℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，采用細(xì)菌菌落形成單位計(jì)數(shù)，單位CFU/mL。

1.2.4椅旁沖洗治療在椅旁對(duì)患者行漱口水15～20 mL沖洗冠周、盲袋，沖出食物殘?jiān)?、分泌物，直到?jīng)_出液清亮。囑患者回家后用該漱口水自行含漱，每次10 mL，在口內(nèi)含漱3～5 min，每天4次。漱口后30 min內(nèi)不進(jìn)食、不飲水。同時(shí)指導(dǎo)患者維護(hù)口腔衛(wèi)生，宣教防護(hù)常識(shí)。

1.2.5臨床癥狀評(píng)判(1)患者疼痛分級(jí)：根據(jù)患者主訴，采用疼痛分級(jí)法記錄其疼痛程度，并用數(shù)字0～3記錄：0級(jí)：無(wú)疼痛，記為“0”。I級(jí)：疼痛，可以忍受。生活正常，睡眠無(wú)干擾，記為“1”。II級(jí)：疼痛明顯，不可忍受，要求口服鎮(zhèn)痛藥物，睡眠受干擾，記為“2”。III級(jí)：疼痛劇烈，不可忍受，需服用鎮(zhèn)痛藥物，睡眠嚴(yán)重受干擾，可伴有自主神經(jīng)紊亂或被動(dòng)體位，記為“3”。(2)患者開(kāi)口度：根據(jù)患者開(kāi)口度，記錄初診和復(fù)診情況，以數(shù)字表示，0：開(kāi)口度>3 cm。1：開(kāi)口度2～3 cm。2：開(kāi)口度1～2 cm。3：開(kāi)口度<1 cm。4：完全不能開(kāi)口。

1.2.6復(fù)診治療后第 1天和治療后第2天復(fù)診，重復(fù)前次操作。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

菌落計(jì)數(shù)采用秩和檢驗(yàn)，比較治療后第2天抑菌有效率。臨床癥狀改善情況采用卡方檢驗(yàn)，比較緩解程度。P<0.05，表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

分別測(cè)試DP7液對(duì)照組、hLYZ液對(duì)照組、聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)組的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，DP7型抗菌肽與人溶菌酶聯(lián)合時(shí)，當(dāng)DP7濃度為64 mg/L ，hLYZ濃度為312.5 mg/L 時(shí)，對(duì)25 923的抑菌率為98.34%，對(duì)25 922的抑菌率為97.98%，對(duì)E1的抑菌率為99.51%；當(dāng)DP7濃度為32 mg/L ，hLYZ濃度為156.25 mg/L 時(shí)，對(duì)S5的抑菌率為88.82%，對(duì)S8的抑菌率為100.00%；當(dāng)DP7濃度為16 mg/L ，hLYZ濃度為39.062 5 mg/L 時(shí)，對(duì)E2的抑菌率為98.67%；當(dāng)DP7濃度為32 mg/L ，hLYZ濃度為1 250 mg/L 時(shí)，對(duì)E7的抑菌率為90.30%；當(dāng)DP7濃度為32 mg/L ，hLYZ濃度為625 mg/L 時(shí)，對(duì)27 853的抑菌率為80.92%；當(dāng)DP7濃度為16 mg/L，hLYZ濃度為625 mg/L 時(shí)，對(duì)P1的抑菌率為96.64%；當(dāng)DP7濃度為64 mg/L ，hLYZ濃度為1 250 mg/L 時(shí)，對(duì)P2的抑菌率為93.89%；當(dāng)DP7濃度為32 mg/L ，hLYZ濃度為39.062 5 mg/L 時(shí)，對(duì)25 175的抑菌率為100.00%，具有協(xié)同抑菌意義，F(xiàn)IC指數(shù)=0.5；DP7液對(duì)照組中相應(yīng)的MIC濃度均是聯(lián)合用藥組中DP7液濃度的 2倍；本組實(shí)驗(yàn)中hLYZ對(duì)照組的結(jié)果均為陰性，未表現(xiàn)出抑菌效果，見(jiàn)表2。對(duì)S2、S4、S7、E3、E4、E5、E6、E8沒(méi)有協(xié)同抑菌作用。

表2DP7液對(duì)照組、hLYZ液對(duì)照組、聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)組的MIC(mg/L)

菌種DP7對(duì)照組hLYZ對(duì)照組聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)組DP7hLYZ25923128陰性結(jié)果64312.5S564陰性結(jié)果32156.25S864陰性結(jié)果32156.2525922128陰性結(jié)果64312.5E1128陰性結(jié)果64312.5E232陰性結(jié)果1639.0625E764陰性結(jié)果3212502785364陰性結(jié)果32625P132陰性結(jié)果16625P2128陰性結(jié)果6412502517564陰性結(jié)果3239.0625

2.2臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1菌落計(jì)數(shù)在35.7 ℃下隔水培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，治療前總菌落計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)組為15 464 CFU/mL，對(duì)照組為17 580 CFU/mL，數(shù)據(jù)不是正態(tài)分布，兩個(gè)獨(dú)立樣本做秩和檢驗(yàn)，n=69，Z=-0.556，P=0.578，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療后第 2天總菌落計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)組為3 337 CFU/mL，對(duì)照組為4 016 CFU/mL，秩和檢驗(yàn)抑菌有效率：n=69，Z=-2.109，P=0.035，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.2臨床癥狀評(píng)判(1)疼痛程度：將治療后第 2天與治療前疼痛記分?jǐn)?shù)值相差1者，記為“疼痛緩解”；將記分?jǐn)?shù)值相差2及以上者，記為“疼痛明顯好轉(zhuǎn)”。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，疼痛明顯好轉(zhuǎn)率實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，χ2=5.412，P=0.032，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。(2)張口度改善情況：治療后第 2天患者的張口度增大<2 cm者，記為“緩解”；增大2 cm及以上者，記為”明顯增大”。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，χ2=5.412，P=0.032，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3　實(shí)驗(yàn)藥物對(duì)疼痛治療的療效比較(n=69)

3　討論

智牙冠周炎發(fā)作時(shí)，細(xì)菌大量繁殖，需氧菌和厭氧菌并存，本實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)智牙冠周炎敏感的部分細(xì)菌，如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌的標(biāo)準(zhǔn)株和部分耐藥株以及變形鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株，通過(guò)不同濃度AMPs和hLYZ復(fù)配，對(duì)上述細(xì)菌產(chǎn)生的抑制作用進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩種藥物聯(lián)合使用后對(duì)部分菌株有協(xié)同抑菌作用，并且復(fù)配的比例因菌種不同而不同，在最大濃度組合即當(dāng)DP7濃度為64 mg/L，hLYZ濃度為1 250 mg/L 時(shí)，對(duì)于敏感菌株都有協(xié)同抑菌作用；當(dāng)DP7濃度為64 mg/L，hLYZ濃度為312.5mg/L時(shí)，對(duì)絕大部分菌株有協(xié)同抑菌作用。本組實(shí)驗(yàn)中hLYZ對(duì)照組的結(jié)果均為陰性，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中考慮加大樣本量、加大實(shí)驗(yàn)濃度觀察。臨床實(shí)驗(yàn)選擇的復(fù)合多肽溶菌酶漱口水，主要由重組hLYZ100 U/L及DP7型AMPs 0.1 g/L復(fù)配而成，已開(kāi)展對(duì)于口腔黏膜病的研究，其濃度配比與本組體外抑菌實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)存在差異，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將考慮此因素，對(duì)于不同口腔疾病選擇更合適的濃度配比。

hLYZ是一種堿性球蛋白，廣泛存在于人體的細(xì)胞、組織器官和體液中。它通過(guò)水解肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄胺中的β-1,4-糖苷鍵，在滲透壓作用下導(dǎo)致革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁破裂，直接溶解G+細(xì)菌[2]。在分泌性免疫球蛋白A和補(bǔ)體協(xié)同作用下，也能間接溶解革蘭氏陰性細(xì)菌。溶菌酶已在醫(yī)療、食品、生物學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，用于口腔潰瘍、急慢性咽炎、燒傷創(chuàng)面、食品防腐與保存等[3-5]。hLYZ不易產(chǎn)生耐藥性，是新一代抗菌劑的理想選擇，它還能和抗生素、乳鐵蛋白、溶菌酶等發(fā)生協(xié)同作用從而提高活性[6]。通過(guò)DNA重組技術(shù)獲得了重組hLYZ，其純度高，制備相對(duì)容易[7-8]。AMPs廣泛存在于生物體內(nèi)，在宿主天然免疫和獲得性免疫中有很重要的作用[9]。其水脂雙親性、陽(yáng)離子性、疏水性、a-螺旋結(jié)構(gòu)、β-折疊、肽鏈長(zhǎng)度、端基結(jié)構(gòu)等都可影響其功能的發(fā)揮[10-12]，其主要抗菌機(jī)理是通過(guò)細(xì)胞膜滲透作用和直接作用于胞內(nèi)不同靶點(diǎn)發(fā)揮抗菌作用,既能在細(xì)胞內(nèi)部起作用，也能激活致死途徑，誘導(dǎo)水解作用使細(xì)胞壁降解[13]。

綜上所述，AMPs -DP7和hLYZ聯(lián)合應(yīng)用對(duì)引起智牙冠周炎的部分細(xì)菌具有良好的協(xié)同抑菌效果，對(duì)智牙冠周炎臨床癥狀的改善有積極影響。由于本研究選擇菌種有限，在后續(xù)研究中會(huì)繼續(xù)增加其他常見(jiàn)冠周炎致病菌群，充實(shí)樣本量，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)更適宜的濃度比。在沖洗和含漱過(guò)程中，患者反映復(fù)合多肽溶菌酶漱口水口味過(guò)于濃烈，需待改進(jìn)配方，減少刺激性。

[1]張志愿，俞光巖．口腔頜面外科學(xué)[M].第7版，北京:人民衛(wèi)生出版社,2013:184-186.

[2]王佃亮．重組人溶菌酶研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程雜志,2003,23(9):59-63.

[3]董世華,曲耿.復(fù)合溶菌酶治療兒童燒傷的臨床分析[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)刊，2014,16(5):878-879.

[4]靳立新,朱新英,石娜.復(fù)合溶菌酶殺菌紗布濕敷治療化療性靜脈炎療效觀察[J].現(xiàn)代臨床護(hù)理，2015，14(2):50-52.

[5]高景.溶菌酶與口腔常見(jiàn)疾病關(guān)系研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)用口腔科雜志，2012,5(9):570-573.

[6]艾麗斯,張宇,林莉.抗菌肽及其在口腔領(lǐng)域應(yīng)用前景[J].中國(guó)實(shí)用口腔科雜志,2014,7(4):204-207.

[7]陳艷,江明鋒,葉煜輝.溶菌酶的研究進(jìn)展[J].生物學(xué)雜志,2009,26(2):64-66.

[8]呂秋軍,卞光興.抗感染新藥重組人溶菌酶及其抑菌活性的研究[J].中國(guó)新藥雜志,2006,15(17):1436-1439.

[9]孫紅,薛越,黃寧.抗菌肽抗菌機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國(guó)抗生素雜志,2013,38(8):568-571.

[10]Taylor PW.Alternative natural sources for a new generation of antibacterial agents[J].Int J Antimicrob Agents,2013,42(3):195-201.

[11]Nan YH,Park KH,Park Y,et al.Investigating the effects of positive charge and hydrophobicity on the cell selectivity,mechanism of action and anti-inflammatory activity of a Trp-rich antimicrobial peptide indolicidin[J].FEMS Microbiol Lett,2009,292(1):134-140.

[12]Zasloff M.Antimicrobial peptides of multicellular organisms[J].Nature,2002,415(6870):389-395.

[13]蔡菁.抗菌肽-潛在的抗生素替代品[J].上海醫(yī)藥,2013,34(19):55-58.

(學(xué)術(shù)編輯：劉英)

The application of composite polypeptide lysozyme on treatment of opsigenes pericoronitis

XIAO Ya-yi1,YANG Li2,MOU Yan-dong3

(1.Department of Stomatology,Nanchong Central Hospital,Nanchong 637100;2.State Key Laboratory of Biological Treatment,Sichuan University,Chengdu 610041;3.Department of Stomatology,Sichuan Provincial People’s Hospital,Chengdu 610000,Sichuan,China)

Composite polypeptide lysozyme；Opsigenes pericoronitis；Synergistic antibacterial；Clinical curative effect

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.04.010論著

四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015SZ0013)

2016-01-19

蕭雅一(1981-)，女，主治醫(yī)師。E-mail：3138991746@qq.com

牟雁東，E-mail：995448060@qq.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-8-217∶48網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160802.1748.018.html

1005-3697(2016)04-0486-04

R276.8

A