邢亦明，胡澤平，王邦寧，周 青，汪 淵

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替米沙坦對小鼠巨噬細(xì)胞M1/M2亞型極化的影響

邢亦明1，胡澤平1，王邦寧1，周 青2，汪 淵2

目的 探討替米沙坦對小鼠巨噬細(xì)胞M1/M2亞型極化的影響。方法 分別用脂多糖（LPS）聯(lián)合干擾素-γ（IFN-γ）和白介素-4（IL-4）誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞M1/M2型極化，用免疫熒光法檢測極化結(jié)果。在M1型巨噬細(xì)胞中分別加入0.1、1、10 μmol/L替米沙坦，同時設(shè)立空白對照組及溶劑對照組，Western blot法檢測各組巨噬細(xì)胞亞型標(biāo)志物誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（iNOS）和精氨酸酶Ⅰ（ArgⅠ）的表達情況，ELISA法檢測各組培養(yǎng)液上清中IL-6、IL-10表達情況。結(jié)果 在LPS+IFN-γ誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞中M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS、IL-6的表達水平明顯升高，替米沙坦干預(yù)后，各干預(yù)組M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS、IL-6的表達水平下降（P＜0.05），隨著替米沙坦?jié)舛鹊脑黾佣档?，而代表M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的ArgⅠ和IL-10表達水平上升（P＜0.05）。結(jié)論 替米沙坦可以抑制LPS+IFN-γ誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞M1型極化，促進M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

替米沙坦；巨噬細(xì)胞M1/M2型極化；炎癥

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-6-6 13：52：32 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.030.html

替米沙坦是一種新型血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，廣泛應(yīng)用于臨床冠心病、高血壓等心血管疾病的治療，其不僅有拮抗腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、改善心肌重構(gòu)、改善血管內(nèi)皮功能等心血管保護作用，更有抗炎、抗動脈粥樣硬化作用［1］。動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，巨噬細(xì)胞在其中扮演了重要角色［2］。近年來，通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能影響動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的研究受到廣泛關(guān)注。研究［3］顯示，巨噬細(xì)胞在不同的微環(huán)境下可以分化為M1和M2兩種亞型，稱為巨噬細(xì)胞極化。M1型巨噬細(xì)胞高表達誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthases，iNOS）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）等，有促炎、促動脈粥樣硬化作用；M2型巨噬細(xì)胞高表達精氨酸酶I（arginaseⅠ，ArgⅠ）、白介素-10（interleukin-10，IL-10）等，有抗炎、抗動脈粥樣硬化作用。然而，替米沙坦是否能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞M1/M2型極化，目前尚不清楚。該研究探討替米沙坦對小鼠巨噬細(xì)胞M1/M2型極化的影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)院饋贈。

1.1.2主要試劑和儀器 替米沙坦購于上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購于杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）購于美國Sigma公司；IL-4和干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）均購于美國Peprotech公司；兔ArgⅠ多抗和β-actin單抗購于美國Santa Cruz公司；兔iNOS多抗購于美國Abcam公司；其余相應(yīng)二抗及免疫熒光試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；BCA定量試劑盒、ECL顯色試劑盒均購于美國Pierce公司；IL-6、IL-10 ELISA試劑盒均購于北京四正柏科技有限公司；免疫熒光照片均使用Leica DM4000B拍攝。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和傳代 用含有10%胎牛血清、100 U/ml鏈霉素、100 μg/ml青霉素和2 mmol/L谷氨酰胺的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)瓶置入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞密度為90% ～95%并處于對數(shù)生長期時，用0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2免疫熒光法檢測巨噬細(xì)胞M1/M2亞型極化

將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞接種于 6孔板，設(shè)立M1組和M2組，分別在M1組和M2組加入LPS 200 ng/ml+IFN-γ 20 ng/ml和IL-4 15 ng/ml共培養(yǎng)12 h，同時設(shè)立空白對照組（Mφ組），取出蓋玻片，用預(yù)冷的PBS溶液清洗3遍，4%多聚甲醛固定20 min，PBS溶液清洗3遍；后用0.3%聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）透化細(xì)胞膜10 min，PBS沖洗3遍；用含1%BSA的PBS封閉30 min，棄封閉液，加入iNOS一抗和 ArgⅠ一抗（1∶200，用封閉液配制），4℃過夜，PBS洗3遍；再加入FITC標(biāo)記的兔抗小鼠IgG二抗（1∶100，PBS配制），室溫孵育1 h，棄二抗，PBS沖洗3遍再加入0.5 μg/ml DAPI染核10 min，棄DAPI；PBS沖洗3遍，最后用熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察結(jié)果并拍照。

1.2.3Western blot法檢測iNOS、ArgⅠ的表達復(fù)蘇RAW264.7細(xì)胞，按照上述方法進行培養(yǎng)及傳代，待細(xì)胞穩(wěn)定傳代后，加入LPS 200 ng/ml+IFN-γ 20 ng/ml培養(yǎng)12 h，后加入替米沙坦0.1、1、10 μmol/L（替米沙坦用DMSO溶解），并設(shè)立空白對照組和溶劑對照組。共培養(yǎng)24 h后，PBS洗滌3次，每瓶加入200 μl RIPA蛋白提取液，冰上放置30 min，刮取細(xì)胞，移入1.5 ml預(yù)冷EP管中，反復(fù)凍融3次，14 000 r/min離心30 min，將上清液移入另一個1.5 ml EP管中。BCA法測定總蛋白濃度并將所有樣本調(diào)整至相同濃度，加入4×蛋白上樣緩沖液，混勻后煮沸變性，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｅ渲?2.5% SDS-PAGE，加入等量樣本后電泳，電泳結(jié)束將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗（iNOS、ArgⅠ、β-actin）4℃孵育過夜，PBS洗滌，二抗室溫孵育2 h，洗滌后在暗室內(nèi)加ECL，覆蓋上X線片、顯影、定影。底片掃描后用Quantity One分析灰度值。

1.2.4ELSIA法檢測細(xì)胞上清液IL-6、IL-10水平

收集各培養(yǎng)瓶細(xì)胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)說明書步驟使用ELISA法檢測上清液IL-6、IL-10水平，酶標(biāo)儀檢測吸光度值，標(biāo)準(zhǔn)曲線計算活性。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 19.0軟件進行分析，計量資料以±s表示，兩組間均值比較采用t檢驗，多組間均值比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1體外誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞M1/M2亞型極化結(jié)果 M1組iNOS的表達水平相對于Mφ組和M2組均明顯升高（P＜0.05）（圖1），而M2組ArgⅠ表達水平明顯高于Mφ組及M1組（P＜0.05）（圖2），結(jié)果提示體外巨噬細(xì)胞極化造模成功。

2.2替米沙坦對M1型巨噬細(xì)胞iNOS和ArgⅠ表達的影響 在M1型巨噬細(xì)胞中加入不同濃度（0.1、1、10 μmol/L）替米沙坦干預(yù)24 h后，與空白對照組比較，替米沙坦干預(yù)各組iNOS表達水平明顯下降，隨著替米沙坦?jié)舛鹊脑黾樱琲NOS表達水平明顯降低（F=51.893，P＜0.05）。同時，與空白對照組相比，替米沙坦干預(yù)各組ArgⅠ表達水平明顯上升，隨著替米沙坦?jié)舛鹊脑黾?，ArgⅠ表達水平明顯上升（F=10.090，P＜0.05）。見圖3。

2.3替米沙坦對巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-6水平的影響 與Mφ比較，M1組上清液中IL-6水平明顯增加（P＜0.01）；M1組與M1+DMSO組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與M1組比較，替米沙坦干預(yù)組IL-6水平明顯下降，隨著替米沙坦的濃度增加，IL-6水平進一步降低（F=49.871，P＜0.05）。見圖4。

圖1　M1組、Mφ組、M2組iNOS表達情況 免疫熒光×400

圖2　M1組、Mφ組、M2組iNOS表達情況 免疫熒光×400

圖3　Western blot法檢測iNOS、ArgⅠ蛋白表達

圖4　細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6水平

2.4替米沙坦對巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-10水平的影響 Mφ組、M1+DMSO組和M1組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-10水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與M1組比較，替米沙坦干預(yù)組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-10水平均升高，隨著替米沙坦的濃度增加，IL-10水平進一步升高（F=6 652.236，P＜0.01）。見圖5。

3　討論

動脈粥樣硬化是一種全身性的疾病，是多種心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)，亦是急性心腦血管事件的罪魁禍?zhǔn)?，?yán)重危害人類健康。隨著人民生活水平的提高，動脈粥樣硬化發(fā)病率呈逐年遞增趨勢且呈現(xiàn)年輕化。在動脈粥樣硬化的形成機制中，炎癥反應(yīng)被證實參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸［2］。多種免疫細(xì)胞參與了動脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)，其中單核細(xì)胞募集是動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)中的早期事件，進入內(nèi)皮下的單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，成為粥樣斑塊形成的基礎(chǔ)［4］。然而，巨噬細(xì)胞有異質(zhì)性的特點，即根據(jù)局部微環(huán)境的不同起到促炎或抗炎的作用，稱之為巨噬細(xì)胞極化。最經(jīng)典的分型為通過經(jīng)典途徑激活的M1型和通過選擇性途徑激活的M2型，M1型巨噬細(xì)胞高表達iNOS、IL-6、IL-1β、IL-23、腫瘤細(xì)胞因子-α等，有促炎及促動脈粥樣硬化形成的作用；M2型巨噬細(xì)胞高表達ArgⅠ、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β等，有抗炎和抗動脈粥樣硬化的作用［3］；兩者均存在于粥樣斑塊中，呈現(xiàn)動態(tài)平衡，可以相互轉(zhuǎn)化［5］。研究［6］顯示，巨噬細(xì)胞亞型與斑塊的穩(wěn)定性相關(guān)，在不穩(wěn)定性斑塊中，M1型巨噬細(xì)胞占主導(dǎo)地位；而在穩(wěn)定斑塊中，更多表現(xiàn)為M2型巨噬細(xì)胞；在易損的斑塊肩部，M1型巨噬細(xì)胞個數(shù)遠多于M2型巨噬細(xì)胞，而在相對穩(wěn)定的纖維帽中，M1型巨噬細(xì)胞與M2型巨噬細(xì)胞數(shù)目相似，相對于巨噬細(xì)胞的絕對個數(shù)而言，亞型所占的比例對斑塊的穩(wěn)定性影響更大［7］。

圖5　細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-10水平

本研究就經(jīng)典的巨噬細(xì)胞極化分型為理論基礎(chǔ)，采用小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7進行細(xì)胞培養(yǎng)，分別給予LPS+IFN-γ、IL-4進行極化造模，在誘導(dǎo)極化的同時加入不同濃度替米沙坦進行干預(yù)，研究結(jié)果可見替米沙坦對M1型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物iNOS、IL-6的表達有抑制作用，隨著替米沙坦?jié)舛鹊脑黾樱琲NOS、IL-6的表達水平進一步下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。同時檢測ArgⅠ、IL-10，與M1組比較，替米沙坦干預(yù)組ArgⅠ、IL-10的表達水平明顯增加，隨著替米沙坦?jié)舛鹊脑黾?，Arg I、IL-10的表達水平進一步增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。提示，替米沙坦有抑制巨噬細(xì)胞向M1型分化的作用，隨著濃度的增加，其抑制作用進一步增強，有誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化的趨勢。

巨噬細(xì)胞極化受多種信號通路及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控［8］。其中，過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ）是一種在巨噬細(xì)胞中高表達的核受體，參與脂質(zhì)代謝和阻止動脈粥樣硬化的進程。PPAR-γ在IL-4誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中通過STAT-6途徑高表達，可通過抑制NF-κB途徑和AP-1途徑表達抗炎物質(zhì)，是一種影響M2型巨噬細(xì)胞極化的重要轉(zhuǎn)錄因子［9］。M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達與PPAR-γ呈正相關(guān)，PPAR-γ的活化可以促使單核細(xì)胞向M2巨噬細(xì)胞的分化［10］。替米沙坦有選擇性激活PPAR-γ作用。本課題組前期研究［11］表明替米沙坦通過促進PPAR-γ的表達保護血管內(nèi)皮，抑制動脈粥樣硬化進展。推測替米沙坦可能通過促進PPAR-γ表達，促進M1型巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化。

綜上所述，替米沙坦對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264. 7的M1型極化有著抑制作用，促進M1型巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化，為替米沙坦的抗動脈粥樣硬化作用提供了可能的新機制。

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Effect of Telmisartan on mice macrophage M1/M2 polarization

Xing Yiming，Hu Zeping，Wang Bangning，et al
（Dept of Cardiology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To investigate the effect of Telmisartan on the M1/M2 polarization of mice macrophage. Methods Mice macrophage was induced to M1/M2 polarization by LPS+IFN-γ and IL-4 respectively，and tested by immunofluorescence.Meanwhile cells were treated with 0.1，1，10 μmol/L Telmisartan，blank control group and vehicle control group were established at the same time.The biomarkers iNOS and ArgⅠwere tested by Western blot，and the cytokines IL-6 and IL-10 were tested by ELISA assay.Results The biomarker iNOS and IL-6，secreted by M1 macrophage，were apparently increased in the macrophages induced by LPS+IFN-γ.However，after being treated with Telmisartan，the expressions of iNOS and IL-6 were obviously decreased（P＜0.05），as the concentration higher the expression lower.While，the expression of Arg I and IL-10，which represented the M2 macrophage，increased（P＜0.05）.Conclusion Telmisartan can inhibit the M1 polarization of mice macrophage RAW264.7 induced by LPS and IFN-γ and transform M1 macrophage polarization to M2 macrophage polarization.

Telmisartan；macrophage M1/M2 polarization；inflammation

R 392

A

1000-1492（2016）07-0989-05

2016-04-21接收

高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金（編號：20123420120005）；安徽高校省級自然科學(xué)研究重點項目（編號：KJ2012A147）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，合肥 2300222安徽醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)實驗室，合肥 230032

邢亦明，女，碩士研究生；王邦寧，女，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wangbangning@medmail.com.cn；胡澤平，男，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：1431318679@qq.com