范洪臣,辛嘉英,,*,王　艷,夏春谷

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150076;2.中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所羰基合成與選擇氧化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州 730000)

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響應(yīng)面法優(yōu)化甲烷氧化菌3011高產(chǎn)甲烷氧化菌素的研究

范洪臣1,辛嘉英1,2,*,王艷1,夏春谷2

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150076;2.中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所羰基合成與選擇氧化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州 730000)

利用響應(yīng)面方法對(duì)甲烷氧化菌3011發(fā)酵產(chǎn)甲烷氧化菌素(Mb)條件進(jìn)行了優(yōu)化。以Mb產(chǎn)量為考察指標(biāo),利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)對(duì)影響產(chǎn)量的7個(gè)因素進(jìn)行評(píng)價(jià),篩選出具有顯著效應(yīng)的3個(gè)因素,這三個(gè)因素分別為甲醇流加量、銅離子濃度和pH。利用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)顯著因素進(jìn)行優(yōu)化,得到產(chǎn)Mb的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)條件為甲醇流加量54.1 μmol/min,pH6.39,銅17.03 μmol/L,溫度30 ℃,接種量5×106CFU/mL,通氧量30 L/h,攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min,此條件下Mb產(chǎn)量為3300.2 μg/mL。由此可得響應(yīng)面優(yōu)化得到的生產(chǎn)工藝是提高M(jìn)b產(chǎn)量的可行方法。

響應(yīng)面法,甲烷氧化菌,甲烷氧化菌素,Plackett-Burman,Box-Behnken

甲烷氧化菌(Methanotrophicbacteria,methanotrophs),是能夠以甲烷作為唯一碳源和能源進(jìn)行同化和異化代謝的微生物,可以在氧氣的作用下催化甲烷等低碳烷烴或烯烴羥基化或環(huán)氧化[1],其用甲烷生長(zhǎng)的代謝途徑如圖1。甲烷氧化菌生長(zhǎng)代謝過(guò)程中需要大量的銅,為了獲得大量的銅,甲烷氧化菌分泌一種胞外的銅結(jié)合化合物稱(chēng)為甲烷氧化菌素(Mb)[2-3],甲烷氧化菌素不僅是顆粒性甲烷單加氧酶活性所必須,而且是甲烷代謝途徑中不可或缺的一部分[4-5]。Mb結(jié)構(gòu)如圖2,結(jié)構(gòu)中由類(lèi)似氧唑環(huán)雜環(huán)、氨基酸、硫鍵組成,賦予了其特殊的性質(zhì),可廣泛應(yīng)用在抗菌、醫(yī)療和食品抗氧化上。根據(jù)Mb的還原性,近些年還發(fā)現(xiàn)Mb可以制備納米金、銀、鈀、金鈀合金等[6-8],為綠色制備納米貴金屬催化劑提供了良好的材料。

圖1　甲烷氧化甲烷與甲醇、甲醛同化途徑Fig.1　Pathways for the oxidation of methane and assimilation of for maldehyde注:CytC為細(xì)胞色素C,FADH甲醛脫氫酶,FDH甲酸脫氫酶。

圖2　甲烷氧化菌素結(jié)構(gòu)圖Fig.2　The structure of Mb

目前國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)中主要集中在Mb相關(guān)合成基因[9-11]、結(jié)構(gòu)[12]、性質(zhì)[13]和應(yīng)用上[6-8,13-17],單純提高M(jìn)b產(chǎn)量的文章還沒(méi)見(jiàn)報(bào)導(dǎo),且大多數(shù)培養(yǎng)都以甲烷氣體為碳源。在以甲烷為碳源的條件下,由于甲烷在水中溶解度差,菌體生長(zhǎng)相對(duì)緩慢,生成的Mb產(chǎn)量很低,且培養(yǎng)過(guò)程中甲烷氣體屬于危險(xiǎn)氣體而不適合工業(yè)化生產(chǎn),有些甲烷氧化菌也能夠以甲醇、甲基胺,甲基化含硫化合物和鹵代甲烷等一碳化合物作為碳源生長(zhǎng)[18],因此尋找合適的一碳營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是提高M(jìn)b產(chǎn)量可行的方法。本研究利用甲醇替代甲烷為碳源用于甲烷氧化菌3011發(fā)酵生產(chǎn)Mb,并利用響應(yīng)面法對(duì)提高M(jìn)b產(chǎn)量進(jìn)行了探討,克服了甲烷生產(chǎn)Mb的弊端,為發(fā)酵提高M(jìn)b產(chǎn)量和實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供了借鑒。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

甲烷氧化菌MethylosinustrichosporiumIMV3011由俄羅斯科學(xué)院催化研究所提供;NMS培養(yǎng)基按文獻(xiàn)配制[8];實(shí)驗(yàn)室所有試劑均為分析純。

UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)日本島津公司;2-16K高速冷凍離心機(jī)美國(guó)Sigma公司;RV8V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀德國(guó)IKA公司;5BG-生化發(fā)酵罐上海保興生物設(shè)備工程公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1發(fā)酵方法將MethylosinustrichosporiumIMV3011按3×106CFU/mL接入到NMS培養(yǎng)基中,甲醇流加量42 μmol/min,培養(yǎng)溫度30 ℃,pH6.6,通氧量40 L/h,攪拌速度300 r/min,銅離子濃度12 μmol/L,培養(yǎng)時(shí)間96 h。

1.2.2Mb制備方法Mb分離純化采用將菌體離心,發(fā)酵液用大孔樹(shù)脂HP-20吸附,70%乙醇洗脫,洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后冷凍干燥,其實(shí)驗(yàn)操作見(jiàn)文獻(xiàn)[5]。

1.2.3Mb測(cè)定方法在25 mL容量瓶中加入2 mL濃度為0.02 mmol/L的鉻天青(CAS)溶液,1 mL濃度為0.02 mmol/L的CuSO4溶液,4 mL濃度為0.02 mmol/L的HTDMA溶液,3 mL的Mb溶液,15 min后比色,測(cè)定605 nm波長(zhǎng)處的吸光值(As),以同樣方法測(cè)定未加Mb溶液的吸光值(Ar)作為參比值。按Ar-As值表示Mb含量。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

1.3.1Plackett-Burman設(shè)計(jì)根據(jù)培養(yǎng)條件中對(duì)響應(yīng)值的影響因素,選取甲醇流加量、通氧量、銅含量、pH、溫度、接種量、攪拌轉(zhuǎn)速7個(gè)因素另添加4個(gè)虛擬因素,每個(gè)因素取高(+1)低(-1)2個(gè)水平,選用N=11的Plackett-Burman設(shè)計(jì)各因素,因素水平及編碼見(jiàn)表1。

表1　Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table 1　Plackett-Burman test design factors and encoding

1.3.2Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在Plackett-Burman設(shè)計(jì)研究基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken設(shè)計(jì)法,對(duì)Mb影響的關(guān)鍵因素作進(jìn)一步研究和探討,以獲得其最佳發(fā)酵水平。將Plackett-Burman設(shè)計(jì)確定的3個(gè)重要因素甲醇、銅離子含量和pH,分別記為A、B、C,以Mb產(chǎn)量作為響應(yīng)值,記為變量Y,進(jìn)行因素、水平編碼,其具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2　Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平和編碼Table 2　Response surface design test factor level and encoding in the design of Box-Behnken

2　結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵因素對(duì)Mb產(chǎn)量的影響

甲烷氧化菌3011產(chǎn)Mb受甲醇流加量、溫度、pH、通氧量、攪拌速率、接種量、銅離子密度的影響,其影響情況如下。

2.1.1甲醇濃度對(duì)菌體密度及甲醇流加量對(duì)Mb產(chǎn)量的影響從圖3可以看出,菌體密度隨著甲醇濃度的升高呈先升高后降低的趨勢(shì),當(dāng)發(fā)酵液中甲醇濃度達(dá)到9 mmol/L時(shí)菌體密度達(dá)到最大,再增大甲醇濃度菌體密度下降。從甲醇濃度對(duì)菌體密度影響看,發(fā)酵液中甲醇濃度超過(guò)9 mmol/L時(shí),甲醇濃度對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了毒性,菌體生長(zhǎng)受到抑制從而降低了Mb產(chǎn)量,因此考慮流加甲醇的方式。從圖4可以看出,隨著甲醇流加量的增大,Mb產(chǎn)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì),當(dāng)甲醇流加量達(dá)到120 μmol/min時(shí)Mb產(chǎn)量最大,甲醇流加量再增大時(shí)Mb產(chǎn)量下降。從甲醇流加量對(duì)Mb影響看,在合適的甲醇流加量范圍內(nèi),增大甲醇流加量,Mb產(chǎn)量是增大的,但流加量超過(guò)120 μmol/min時(shí)Mb產(chǎn)量降低,有可能流加量過(guò)大造成甲醇濃度過(guò)高對(duì)菌體細(xì)胞產(chǎn)生了毒性從而對(duì)Mb產(chǎn)量有了較大影響。

圖3　甲醇濃度對(duì)菌體密度的影響Fig.3　Effect of methanol on cell density

圖4　甲醇流加量對(duì)Mb產(chǎn)量的影響Fig.4　Effect of methanol flow on the yield of Mb

2.1.2溫度對(duì)Mb產(chǎn)量的影響由圖5可以看出,Mb產(chǎn)量隨著溫度升高而升高,當(dāng)溫度達(dá)到32 ℃時(shí),Mb產(chǎn)量達(dá)到最高,溫度再升高時(shí),產(chǎn)量基本恒定。從溫度對(duì)Mb產(chǎn)量影響看,溫度可能影響了合成Mb相關(guān)酶的活性及合成這些酶相關(guān)基因的開(kāi)啟[18]。

圖5　溫度對(duì)Mb產(chǎn)量影響Fig.5　Effect of temperature on the yield of Mb

2.1.3pH對(duì)Mb產(chǎn)量的影響從圖6可以看出pH6～7范圍內(nèi),Mb產(chǎn)量隨著pH的升高先升高后降低,pH6.5時(shí)Mb產(chǎn)量最大。從pH對(duì)Mb產(chǎn)量影響看,pH可能影響了合成Mb相關(guān)酶的活性[18],在低于和高于pH6.5條件下都不利于酶合成Mb。

圖6　pH對(duì)Mb產(chǎn)量的影響Fig.6　Effect of pH on the yield of Mb

2.1.4通氧量對(duì)Mb產(chǎn)量的影響甲烷氧化菌3011在以甲烷為碳源的代謝途徑中氧氣是必不可少的[18],從圖1代謝途徑中可以看出,甲烷和氧氣在菌體相關(guān)酶的作用下合成甲醇,從而為菌體提供了更易于生長(zhǎng)代謝的碳源。甲烷氧化菌3011直接添加甲醇生產(chǎn)Mb時(shí)氧氣對(duì)產(chǎn)Mb影響也是比較大的,從圖7可以看出,Mb產(chǎn)量隨著通氧量增大而升高,通氧量達(dá)到30 L/h時(shí)Mb達(dá)到最大,再增大通氧量Mb產(chǎn)量變化并不大,有可能在30 L/h供氧量的條件下培養(yǎng)基中溶解的氧滿(mǎn)足了菌體代謝需要。

圖7　通氧量對(duì)Mb產(chǎn)量的影響Fig.7　Effect of Oxygen content on the yield of Mb

2.1.5攪拌速率對(duì)Mb產(chǎn)量的影響從前面所得結(jié)果看甲烷氧化菌3011以甲醇為碳源產(chǎn)Mb,氧氣的供給是必不可少的,發(fā)酵罐的攪拌速度能促進(jìn)氣液間傳質(zhì),提高溶氧濃度有利于發(fā)酵[19],提高M(jìn)b產(chǎn)量。從圖8可以看出,Mb產(chǎn)量隨著攪拌速度的增加而升高,攪拌速度達(dá)到400 r/min時(shí),Mb產(chǎn)量達(dá)到最大,再增加攪拌速度,Mb產(chǎn)量保持恒定。從攪拌速度對(duì)Mb產(chǎn)量的影響看,在一定的通氧量下,增加攪拌轉(zhuǎn)速提高了發(fā)酵液中溶解氧含量,并且使流加的甲醇快速分散到整個(gè)發(fā)酵液中,從而有利于菌體產(chǎn)Mb。

圖8　攪拌速度對(duì)Mb產(chǎn)量的影響Fig.8　Effect of Stirring speed on the yield of Mb

2.1.6接種密度對(duì)Mb產(chǎn)量的影響從圖9可以看出,隨著接種量的增大,Mb產(chǎn)量也在增大,接種量達(dá)到5×106CFU/mL時(shí)Mb產(chǎn)量達(dá)到最大,再增加接種量對(duì)Mb產(chǎn)量無(wú)較大影響。從接種量對(duì)Mb產(chǎn)量的影響看,在甲醇流加量恒定條件下,當(dāng)接種量少時(shí),由于菌體開(kāi)始階段數(shù)量較少所以消耗甲醇也少,隨著時(shí)間的增加,甲醇的累積量過(guò)早的達(dá)到了菌體耐受甲醇的范圍,對(duì)菌體產(chǎn)生了毒性,從而影響了Mb產(chǎn)量。

表3　Plackett-Burman設(shè)計(jì)因素編碼水平實(shí)驗(yàn)安排表及響應(yīng)值Table 3　Design factors level test schedule and response values of Plackett-Burman

圖9　接種量對(duì)Mb產(chǎn)量的影響Fig.9　Effect of inoculum density on the yield of Mb

2.1.7銅離子濃度對(duì)Mb產(chǎn)量的影響由圖10可以看出,隨著銅離子含量增加,Mb產(chǎn)量先升高后降低,在銅含量30 μmol/L時(shí)Mb產(chǎn)量達(dá)到最大。從銅含量對(duì)Mb產(chǎn)量的影響看,銅離子的加入在低濃度范圍內(nèi)起調(diào)控作用,尤其是在亞適量銅存在下可以誘導(dǎo)Mb的產(chǎn)生[20],隨著銅離子濃度加大,過(guò)多的銅離子對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定毒性,Mb產(chǎn)量有所降低。

圖10　銅含量對(duì)Mb產(chǎn)量的影響Fig.10　Effect of Cu2+ content on the yield of Mb

2.2Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選影響液體發(fā)酵的顯著因素

2.2.1Plackett-Burman分析根據(jù)Plackett-Burman設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)所得響應(yīng)值見(jiàn)表3。

由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合通過(guò)Design-Expert得到線(xiàn)性回歸方程:

R1=2664.58-28.25X1+32.75X2+6.42X3-8.92X4+0.75X5-13.92X6+24.75X7+16.92X8+10.25X9-13.92X10+10.75X11

其顯著性分析見(jiàn)表4。由表4看出,實(shí)驗(yàn)因素甲醇、銅離子含量和pH對(duì)響應(yīng)值Y有顯著影響。因此,選取這三個(gè)顯著影響Mb的關(guān)鍵因素,并進(jìn)一步作響應(yīng)面分析,以確定它們所對(duì)應(yīng)的最優(yōu)水平。

表6　回歸模型1的方差分析Table 6　Variance analysis of regression model 1

表4　Plackett-Burman設(shè)計(jì)中各因素的顯著性分析Table 4　The significance of each factor in the design of Plackett-Burman

注：“+”表示顯著性，p<0.05。

2.2.2Box-Behnken響應(yīng)面分析利用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),設(shè)計(jì)3因素3水平共17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)方案,其結(jié)果見(jiàn)表5。

表5　Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案及響應(yīng)值Table 5　Design test and response value in the design of Box-Behnken

運(yùn)用Design-Expert軟件,按表5中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合得到多元二次回歸方程如下:R1=3273.60-33.37A-10.62B+53.50C+9.00AB-11.75AC-28.25BC-68.05A2-59.05B2-77.30C2,對(duì)模型進(jìn)行方差分析,分析結(jié)果見(jiàn)表6及表7。

由表6可看出,本實(shí)驗(yàn)所選用模型具有高度的顯著性(p=0.0002);模型中,單個(gè)因素中A、C對(duì)響應(yīng)值的影響顯著,交互項(xiàng)B與C的影響較顯著,二次項(xiàng)A2、B2及C2的影響也都非常顯著。模型的失擬概率僅為0.0063,說(shuō)明擬合的回歸方程符合實(shí)際情況,可用此模型對(duì)發(fā)酵水平進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表7　回歸模型2的方差分析Table 7　Variance analysis of regression model 2

由表7看出,相關(guān)系數(shù)R2=0.9681,校正系數(shù)R2=0.9270,即只有7.3%的降解率總變異不能由此模型進(jìn)行解釋,表明模型與實(shí)際情況擬和較好。變異系數(shù)Cv=0.69%,說(shuō)明模型能很好地反映真實(shí)的實(shí)驗(yàn)值,即實(shí)驗(yàn)的可靠性較高。

2.2.3優(yōu)化為了進(jìn)一步研究相關(guān)變量之間的交互作用和確定最優(yōu)點(diǎn),通過(guò)Design-Expert軟件做了三個(gè)關(guān)鍵影響因素對(duì)發(fā)酵水平交互影響的曲面圖(圖11～圖13),從圖可以直觀(guān)地反映出兩變量交互作用的顯著程度,結(jié)果表明B和C兩因素交互作用顯著。

圖11　因素A和B交互作用的響應(yīng)面Fig.11　The interaction of response surface on the factors of A and B

圖12　因素A和C交互作用的等高線(xiàn)和響應(yīng)面Fig.12　The interaction of response surface on the factors of A and C

圖13　因素B和C交互作用的等高線(xiàn)和響應(yīng)面Fig.13　The interaction of response surface on the factors of B and C

由圖11～圖13中的響應(yīng)面立體圖可以看出,響應(yīng)值Y存在最大值。對(duì)應(yīng)于響應(yīng)值Y越大說(shuō)明Mb發(fā)酵水平越高,其優(yōu)化要求取最大值,因而在優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)上可以對(duì)Y項(xiàng)選取最大值,由Design-Expert軟件得到優(yōu)化結(jié)果,其結(jié)果見(jiàn)表8。

表8　響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果Table 8　Optimization results of response surface method

根據(jù)計(jì)算,可得A、B、C對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)值A(chǔ)=54.1 μmol/min,B=6.39,C=17.03 μmol/L此時(shí)響應(yīng)值Y取最大值,Ymax=3290.5 μg/L。由回歸方程根據(jù)效應(yīng)的正負(fù),其他因素可以取值為:溫度30 ℃,接種量5×106CFU/mL,通氧量30 L/h,攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min。為驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性,按照優(yōu)化后的條件,并考慮到實(shí)際情況,按照甲醇流加量54.1 μmol/min,pH6.39,銅17.03 μmol/L,溫度30 ℃,接種量5×106CFU/mL發(fā)酵液,通氧量30 L/h,攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),所得結(jié)果為3300.2 μg/L,實(shí)驗(yàn)值與模型預(yù)測(cè)值3290.5 μg/L非常接近(與模型計(jì)算值相差0.3%),表明該模型能很好地預(yù)測(cè)實(shí)際表達(dá)情況。

3　結(jié)論

將響應(yīng)面分析法用于甲烷氧化菌3011提高M(jìn)b產(chǎn)量工藝參數(shù)的優(yōu)化,確定的最佳工藝為甲醇流加量54.1 μmol/min,pH6.39,銅17.03 μmol/L,溫度30 ℃,接種量5×106CFU/mL,通氧量30 L/h,攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min,進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),所得結(jié)果為3300.2 μg/L,實(shí)驗(yàn)值與模型預(yù)測(cè)值3290.5 μg/L非常接近。優(yōu)化得到的最佳發(fā)酵工藝是甲烷氧化菌3011利用甲醇提高M(jìn)b產(chǎn)量的有效途徑,為進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)提供了可靠依據(jù)。

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Application of response surface methodology on high yield methanobactin byMethylosinustrichosporiumIMV3011

FAN Hong-chen1,XIN Jia-ying1,2,*,WANG Yan1,XIA Chun-gu2

(1.Key Laboratory for Food Science & Engineering,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China;2.State Key Laboratory for Oxo Synthesis & Selective Oxidation,Lanzhou Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China)

To optimize Methanobactin(Mb)fermentation conditions forMethylosinustrichosporium3011,Response Surface Methodology(RSM)were applied. The methanol flow,copper ion content and pH of seven factors were determined by Plackett-Burman design. The optimum condition was as follows:the methanol flow rate of 54.1 μmol/min,the pH of 6.39,the copper content of 17.03 μmol/L,the incubation temperature of 30 ℃,the inoculation amount of 5×106CFU/mL,the dissolved oxygen of 30 L/h,the stirring speed of 400 r/min. The optimum Mb production was 3300.2 μg/L. The RSM was feasible for high Mb production and this would improve the Mb production.

Response Surface Methodology;Methanobactin;methanotrophs;Plackett-Burman;Box-Behnken

2016-02-02

范洪臣(1978-)，男，博士，研究方向：食品科學(xué)，E-mail:fanhongchen1@sina.com。

辛嘉英(1966-)，男，博士，研究方向：生物催化，E-mail:xinjiayingvip@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21073050,21573055)。

TS201.3

B

1002-0306(2016)15-0187-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.028