高　庭,李利君,2,3,*,王　聳,吳喆瑜,張文靜,倪　輝,2,3

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,福建廈門 361021;2.福建省高校食品微生物與酶工程技術(shù)研究中心,福建廈門 361021;3.廈門市食品與生物工程技術(shù)研究中心,福建廈門 361021)

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塔賓曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中α-L-鼠李糖苷酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)分析

高庭1,李利君1,2,3,*,王聳1,吳喆瑜1,張文靜1,倪輝1,2,3

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,福建廈門 361021;2.福建省高校食品微生物與酶工程技術(shù)研究中心,福建廈門 361021;3.廈門市食品與生物工程技術(shù)研究中心,福建廈門 361021)

α-L-鼠李糖苷酶是一種在食品、藥品中有重要用途的糖苷酶,但其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系尚不明確,限制了優(yōu)良酶制劑的設(shè)計。本文通過硫酸銨分級沉淀、疏水層析和親和層析從塔賓曲霉固態(tài)發(fā)酵柚皮產(chǎn)物中分離純化得到了一種α-L-鼠李糖苷酶,純化倍數(shù)和比活力分別為34和21105 IU/mg,SDS-PAGE測得該酶的分子質(zhì)量為120 ku;純化得到的α-L-鼠李糖苷酶最適反應(yīng)pH為4.0,最適反應(yīng)溫度為50 ℃,pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性好;Fe2+對酶活有促進作用,Mn2+、Ca2+、Cd2+對酶有抑制作用;該酶可水解柚皮苷,但對蕓香苷和對硝基苯酚鼠李糖的轉(zhuǎn)化率較低,不水解楊梅苷和柴胡皂苷C。以上結(jié)果表明純化得到的α-L-鼠李糖苷酶在金屬離子影響特性、底物特異性方面具有新穎性,豐富了α-L-鼠李糖苷酶的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究素材。

塔賓曲霉,固態(tài)發(fā)酵,α-L-鼠李糖苷酶,分離純化,酶學(xué)性質(zhì)

α-L-鼠李糖苷酶[E.C.3.2.1.40]是一種能特異性水解許多物質(zhì)末端的α-L-鼠李糖的糖苷水解酶,例如黃酮類、多糖和糖脂等[1]。它在去除柑橘類果汁苦味、增加釀造酒香氣、制備普魯寧等領(lǐng)域中具有重要的用途[1-2]。

目前,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在一些動植物組織、真菌以及細菌中可以產(chǎn)生α-L-鼠李糖苷酶[3-4]。其中,絲狀真菌是α-L-鼠李糖苷酶發(fā)酵生產(chǎn)的常用菌種[1]。相關(guān)研究表明,大多數(shù)真菌來源的α-L-鼠李糖苷酶最適pH為酸性,比細菌來源的α-L-鼠李糖苷酶更適于在釀酒和柑橘類果汁加工等食品產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用[2]。但是目前發(fā)現(xiàn)的真菌來源的α-L-鼠李糖苷酶熱穩(wěn)定性不好,易于在酶制劑和食品加工過程中受熱失活[1-2]。一些細菌來源的α-L-鼠李糖苷酶對食品中常見底物的作用活性不高,限制了酶的工業(yè)應(yīng)用。因此,研究酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ),改造獲得在酸性環(huán)境中穩(wěn)定性好、活性高、具有一定的熱穩(wěn)定性和高效底物特異性的α-L-鼠李糖苷酶具有重要的應(yīng)用價值。

固態(tài)發(fā)酵(solid state fermentation,SSF)在食品發(fā)和酶制劑生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛。與液態(tài)深層發(fā)酵技術(shù)相比,固態(tài)發(fā)酵技術(shù)在酶的生產(chǎn)方面具有獨特的優(yōu)勢[5]。其中,真菌酶的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)與液態(tài)發(fā)酵相比,生產(chǎn)力較高,產(chǎn)酶具有較高的溫度和pH穩(wěn)定性,且酶被蛋白酶降解的機會降低[6]。Mateos等[7]報道了固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的脂肪酶比液態(tài)發(fā)酵的熱穩(wěn)定性更高,其他一些學(xué)者[5]研究發(fā)現(xiàn)固態(tài)發(fā)酵還有可能產(chǎn)生一些通常在液體培養(yǎng)中不產(chǎn)生的酶和其他代謝產(chǎn)物。

在前期研究中,本課題組分離鑒定出一株塔賓曲霉(Aspergillustubingensis),并發(fā)現(xiàn)該菌株在固態(tài)發(fā)酵柚皮的過程中能合成α-L-鼠李糖苷酶。本論文的目的是分離純化該塔賓曲霉在固態(tài)發(fā)酵柚皮中合成的α-L-鼠李糖苷酶,并研究其酶學(xué)性質(zhì),豐富酶性質(zhì)與結(jié)構(gòu)關(guān)系研究的材料。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

塔賓曲霉(Aspergillustubingensis)Jmu-TS529集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院食品發(fā)酵與酶工程實驗室選育保存。

柚皮苷(≥98%)西安小草植物科技有限公司;蕓香苷(≥98%),楊梅苷(≥98%),柴胡皂苷C(≥98%)和對硝基苯酚鼠李糖(pNPR)(≥98%)均購自aladdin公司;甲醇(GR)和乙腈(GR)sigma公司;其余試劑均為分析純。

斜面培養(yǎng)基成分[8](g/L):MgSO4·7H2O 1.0,KH2PO41.0,(NH4)2SO41.5,KCl 0.5,KNO31.5,無水CaCl20.1,酵母膏2.0,柚皮苷2.69,瓊脂20,初始pH6.0。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基[9]成分(g/瓶):柚皮粉5,(NH4)2HPO40.5,含水量為5,自然pH。

蛋白純化系統(tǒng)AKTA Purifier、HiTrap Phenyl FF疏水預(yù)裝柱、HiTrap Blue HP親和預(yù)裝柱瑞典Amersham Bioscience公司;Waters 2695/2489 高效液相色譜儀美國Waters公司。

1.2實驗方法

1.2.1α-L-鼠李糖苷酶的固態(tài)發(fā)酵及粗酶液制備參照肖安風(fēng)等[10]的方法,將塔賓曲霉菌株30 ℃活化3 d,用無菌水洗下孢子,然后調(diào)菌懸液OD600至2.0,取1 mL的孢子菌懸液接種于裝有固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,30 ℃發(fā)酵培養(yǎng)8 d。用50 mL 20 mmol/L的pH5.0的檸檬酸鹽緩沖液30 ℃振蕩浸提1 h,所得浸提液用濾紙抽濾,4 ℃保存。參照胡群芳等[9]的硫酸銨沉淀方法,在冰浴情況下,在粗酶液中攪拌加入硫酸銨至飽和度為40%,4 ℃下靜置6 h,離心(4 ℃、10000 r/min、30 min)后,在上清中慢速加硫酸銨至溶液飽和度達到80%,4 ℃下靜置6 h,重復(fù)冷凍離心步驟,收集沉淀,用少量20 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH5.0)溶解,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2α-L-鼠李糖苷酶的分離純化

1.2.2.1疏水柱層析分離參照胡群芳等[9]的疏水柱層析方法,將硫酸銨沉淀制備的α-L-鼠李糖苷酶的粗酶液上樣于含1 mol/L硫酸銨的20 mmol/L Na2HPO4-C4H2O7緩沖溶液(pH7.0)平衡好的HiTrap Phenyl FF層析柱;然后用含有1 mol/L硫酸銨的20 mmol/L Na2HPO4-C4H2O7緩沖溶液(pH7.0)進行流洗,隨后用含有0.7 mol/L硫酸銨的20 mmol/L Na2HPO4-C4H2O7緩沖溶液(pH7.0)進行洗脫,按峰收集洗脫液并測定各管的酶活力和蛋白含量。所有操作的流速均為2 mL/min,收集的速度為2 mL/管。

1.2.2.2親和柱層析分離參照胡群芳等[9]的方法,上樣于先用含1 mol/L硫酸銨的20 mmol/L Na2HPO4-C4H2O7緩沖溶液(pH7.0)平衡,后用20 mmol/L Na2HPO4-C4H2O7緩沖溶液(pH3.0)平衡的HiTrap Blue HP親和柱;上樣后用20 mmol/L Na2HPO4-C4H2O7緩沖溶液(pH3.0)進行流洗,隨后用含有1 mol/L硫酸銨的20 mmol/L Na2HPO4-C4H2O7緩沖溶液(pH7.0)進行洗脫,按峰收集洗脫液并測定各管的酶活力和蛋白含量。流洗和洗脫的流速為2 mL/min,收集的速度為2 mL/管。

1.2.3α-L-鼠李糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

1.2.3.1pH對α-L-鼠李糖苷酶的影響在濃度為0.05 mol/L的pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的Na2HPO4-C4H2O7的反應(yīng)體系中測定酶活,以最高點酶活為100%,其余與之相比,由相對酶活對應(yīng)pH作圖,即得酶反應(yīng)pH對酶活力影響圖;將100 μLα-L-鼠李糖苷酶與400 μL上述不同pH緩沖液混合后在4 ℃放置24 h測定剩余酶活力,以相對酶活對應(yīng)pH作圖,即得酶的pH穩(wěn)定范圍[9]。

1.2.3.2溫度對α-L-鼠李糖苷酶的影響分別在30、40、50、60、70、80 ℃下測定酶活,以最高點酶活為100%,其余與之相比,由相對酶活對應(yīng)溫度作圖,即得酶反應(yīng)溫度對酶活力影響圖;將相同濃度的α-L-鼠李糖苷酶液在上述不同溫度下保溫1 h后,測定不同溫度下的酶活力,以相對酶活對應(yīng)溫度作圖,即得酶的溫度穩(wěn)定范圍[9]。

1.2.3.3金屬離子對α-L-鼠李糖苷酶的影響將相同濃度的α-L-鼠李糖苷酶分別與終濃度為1 mmol/L和100 mmol/L的Mn2+、Co2+、Fe2+、Ca2+和Cd2+離子混勻,于30 ℃保溫1 h后測定剩余酶活,以未加金屬離子的酶液為對照設(shè)酶活為100%,其余與之相比得相對酶活[11]。

1.2.3.4α-L-鼠李糖苷酶的底物特異性在標準反應(yīng)體系下,α-L-鼠李糖苷酶分別與濃度為300 μg/mL的pNPR、楊梅苷、蕓香苷、柚皮苷和柴胡皂苷C反應(yīng),計算其轉(zhuǎn)化率來研究α-L-鼠李糖苷酶的底物特異性[12]。

1.3分析方法

1.3.1酶活力的測定方法參照Ni等[11]的酶活力測定方法,稍做修改,以柚皮苷為底物測定酶活力。酶活性測定的反應(yīng)體系為0.9 mL檸檬酸鹽緩沖液(pH4.0,20 mmol/L)加1 mL濃度為300 μg/mL的底物,50 ℃保溫5 min后加入0.1 mL酶液,混勻,50 ℃反應(yīng)15 min后隨即100 ℃加熱15 min,過0.22 μm的水膜后用高效液相色譜測定反應(yīng)體系中的柚皮苷和普魯寧,色譜柱為Symmetry C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),流動相:水(A)﹣甲醇(B)﹣乙腈(C),梯度洗脫程序:0～7 min,A/B/C=62/12/26;7～9 min,A/B/C=15/35/50,9～15 min,A/B/C=15/35/50;15～17 min,A/B/C=62/12/26;17～20 min,A/B/C=62/12/26;流速為0.4 mL/min,檢測波長為280 nm,柱溫為35 ℃,進樣量為20 μL。在溫度為50 ℃,pH為4.0的條件下,以每分鐘消耗1 μg柚皮苷所需要的酶量定義為一個α-L-鼠李糖苷酶活力單位(IU)。

1.3.2蛋白質(zhì)含量的測定酶純化過程中,用紫外檢測器測定280 nm的吸光值,以計算蛋白濃度。純化后酶液中的蛋白含量用考馬斯亮藍法[13]測定,用考馬斯亮藍G-250染色,在595 nm處測定吸光值,以牛血清白蛋白為標準蛋白制作標準曲線,計算蛋白含量。

1.3.3SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)方法對蛋白質(zhì)組分進行分離,以標準蛋白Marker(SM26614)為分子質(zhì)量對照,計算α-L-鼠李糖苷酶的分子質(zhì)量。其中12.5%分離膠,5.0%濃縮膠,電流12 A,時間120 min,電泳結(jié)束后采用硝酸銀染色法染色。

2　結(jié)果與討論

2.1α-L-鼠李糖苷酶的分離純化

如圖1所示,通過HiTrap Phenyl FF疏水柱對40%～80%硫酸銨沉淀的粗酶組分進行分離,出現(xiàn)一個大的蛋白洗脫峰和一個小的蛋白洗脫峰,其中第一個蛋白峰沒有檢測到酶活力,α-L-鼠李糖苷酶主要集中在第二個蛋白峰,酶的比活力較硫酸銨沉淀的酶液約提高至3倍,該結(jié)果說明用疏水柱很好去除了大量雜蛋白。

圖1　α-L-鼠李糖苷酶疏水柱層析Fig.1　Hydrophobic chromatographic purification and analysis of α-L-rhamnosidase

合并疏水分離獲得的各管酶活力,進一步用HiTrap Blue HP親和柱純化,洗脫曲線如圖2所示,先經(jīng)pH3.0的濃度為20 mmol/L Na2HPO4-C4H2O7流洗和洗脫,出現(xiàn)蛋白峰但含酶量很少;而后將洗脫液的pH升至7.0繼續(xù)洗脫此時出現(xiàn)含酶量較高的蛋白洗脫峰,α-L-鼠李糖苷酶比活力較硫酸銨沉淀約提高至34倍。經(jīng)上述整個純化過程,比活力為21105 IU/mg,總回收率為17%,較同類研究[9](總回收率為3.0%)具有更高的純化效率。

圖2　α-L-鼠李糖苷酶親和柱層析圖Fig.2　Affinity chromatographic purification and analysis of α-L-rhamnosidase

將收集到的不同分離階段的α-L-鼠李糖苷酶液進行SDS-PAGE凝膠電泳分析,結(jié)果如圖3所示,經(jīng)硫酸銨沉淀后的酶液有較多的雜蛋白,經(jīng)疏水柱分離后,雜蛋白含量減少,最終通過親和柱之后為單一條帶,說明經(jīng)過上述純化步驟已得到較高純度的α-L-鼠李糖苷酶,經(jīng)計算其分子質(zhì)量大約為120 ku,稍大于表2中相關(guān)文獻報道的一些α-L-鼠李糖苷酶[14-19]。

表1　α-L-鼠李糖苷酶純化參數(shù)表Table 1　Parameters for the purification of α-L-rhamnosidase

圖3　α-L-鼠李糖苷酶SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3　The results of SDS-PAGE of α-L-rhamnosidase注:1.硫酸銨沉淀;2.疏水層析; 3.親和層析;M.標準分子量蛋白。

圖4　牛血清蛋白標準曲線Fig.4　Standard curve of bovine serum albumin

2.2α-L-鼠李糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)分析

2.2.1pH對酶活力的影響pH對酶活力及穩(wěn)定性的影響如圖5所示,pH在4.0～5.0之間,α-L-鼠李糖苷酶具有較大的酶活力,其最適pH為4.0,該結(jié)果與表2中相關(guān)學(xué)者報道曲霉屬中α-L-鼠李糖苷酶的性質(zhì)類似[14-19]。在pH3.0～pH8.0范圍內(nèi)放置24 h后,酶活損失小于20%,尤其在pH3.0～pH5.0之間穩(wěn)定性最好,與A.niger來源的α-L-鼠李糖苷酶[14](pH3.0～pH5.0之間最好)類似,比A.nidulans[15]和A.terreus[16]來源的α-L-鼠李糖苷酶穩(wěn)定區(qū)間(分別為pH4.0～pH7.0和pH4.0～pH6.5)更寬,這種性質(zhì)可能與酶本身的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)差異有關(guān)之外,還可能與固態(tài)發(fā)酵過程糖基化修飾可獲得高pH穩(wěn)定性的酶有關(guān)[7]。

圖5　pH對α-L-鼠李糖苷酶的影響Fig.5　Effect of pH on the α-L-rhamnosidase

2.2.2溫度對酶活力的影響如圖6所示,α-L-鼠李糖苷酶在pH為4.0時的最適反應(yīng)溫度為50 ℃,在30、40 ℃的酶活只有最大酶活的50%,反應(yīng)溫度升高到70～80 ℃時酶活急劇喪失。這與學(xué)者[17-20]報道的大多數(shù)α-L-鼠李糖苷酶的最適反應(yīng)溫度相類似。該酶在60 ℃放置1 h還可保持60%以上的酶活力,顯著高于A.terreus[16]和A.nidulans[18]中的α-L-鼠李糖苷酶的熱穩(wěn)定性(同樣處理條件下剩余酶活分別為0%和10%),具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖6　溫度對α-L-鼠李糖苷酶的影響Fig.6　Effect of temperature on the α-L-rhamnosidase

來源最適pH最適溫度(℃)分子質(zhì)量(ku)參考文獻A.niger4.56585[14]A.nidulans4.5～6.060102[15]A.terreus4.04496[16]A.kawachii4.05090[19]P.angusta6.04090[17]A.nidulans4.5～8.040～5090[18]

2.2.3金屬離子對酶活力的影響金屬離子對α-L-鼠李糖苷酶的影響如表3所示,5種二價金屬陽離子在濃度為1 mmol時對酶活幾乎沒有影響;當濃度升高到100 mmol時,Mn2+和Ca2+對α-L-鼠李糖苷酶有顯著抑制作用,Cd2+抑制了90%以上的酶活力,這與Gallego[16]報導(dǎo)的10 mmol 的Cd2+的酶活只有10%類似,而Fe2+對α-L-鼠李糖苷酶酶活有促進作用,與Wataru等[21]和Puri等[22]報道的顯著抑制作用不同(剩余酶活分別為0和35%),這與金屬離子通過使底物直接結(jié)合到活性部位或間接地使酶的結(jié)構(gòu)保持在適合的特殊構(gòu)象下控制催化作用密切相關(guān)[23]。

2.2.4α-L-鼠李糖苷酶的底物特異性一些植物來源的黃酮類物質(zhì),例如柚皮苷、蕓香苷、柴胡皂苷C和楊梅苷,可以被α-L-鼠李糖苷酶水解。從表4可以看出,塔賓曲霉α-L-鼠李糖苷酶可以高效水解柚皮苷,但對蕓香苷以及pNPR的轉(zhuǎn)化率很低。即該酶水解以α-1,2糖苷鍵連接鼠李糖與β-D-葡萄糖苷的柚皮苷的能力明顯高于α-1,6糖苷鍵連接的蕓香苷。但是該酶并不能水解糖苷鍵為α-1,3的楊梅苷和α-1,4的柴胡皂苷C,表現(xiàn)出對柚皮苷更高的專一性,這與大多數(shù)學(xué)者報道的α-L-鼠李糖苷酶的底物特異性并不相同[1-4,14-15]。

表3　金屬離子對α-L-鼠李糖苷酶酶活力的影響Table 3　Effects of metal ions on the activity of α-L-rhamnosidase

表4　α-L-鼠李糖苷酶的底物特異性Table 4　Substrate specificity of α-L-rhamnosidase

注:NA表示α-L-鼠李糖苷酶對其不水解。

3　結(jié)論

本文從塔賓曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化得到了一種性質(zhì)新穎的α-L-鼠李糖苷酶。其分子質(zhì)量約為120 ku,最適反應(yīng)pH為4.0,最適反應(yīng)溫度為50 ℃,具有較寬的pH穩(wěn)定范圍和良好的熱穩(wěn)定性。該酶對柚皮苷良好的專一水解能力和Fe2+對酶活有顯著促進的特性明顯區(qū)別于其他的α-L-鼠李糖苷酶,為α-L-鼠李糖苷酶結(jié)構(gòu)認識和性質(zhì)改造提供了數(shù)據(jù)。

[1]Manzanares P,Vallés S,Ramòn D,et al.α-L-Rhamnosidases:Old and New Insights[M].Industrial Enzymes. Springer Netherlands,2007:117-140.

[2]Yadav V,Yadav P K,Yadav S,et al.α-L-Rhamnosidase:a Review[J]. Process Biochemistry,2010,45(8):1226-1235.

[3]Yadav S,Yadava S,Yadav K D S. Purification and Characterization ofα-L-rhamnosidase fromPenicilliumcorylopholumMTCC-2011[J]. Process Biochemistry,2013,48(9):1348-1354.

[4]Gerstorferová D,Fliedrová B,Halada P,et al. Recombinantα-L-rhamnosidase fromAspergillusterreusin Selective Trimming of Rutin[J]. Process Biochemistry,2012,47(5):828-835.

[5]汪小鋒,閆云君. 固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)微生物脂肪酶[J]. 中國生物工程雜志,2009,29(1):105-110.

[6]H?lker U,Lenz J. Solid-state fermentation-are there any biotechnological advantages?[J]. Current Opinion in Microbiology,2005,8(3):301-306.

[7]Diaz J C M,Rodríguez J A,Roussos S,et al. Lipase from the thermotolerant fungus Rhizopus homothallicus is more thermostable when produced using solid state fermentation than liquid fermentation procedures[J]. Enzyme and Microbial Technology,2006,39(5):1042-1050.

[8]丁濤. 柚苷酶發(fā)酵放大技術(shù)及酶制劑的研究[D]. 廈門:集美大學(xué),2011.

[9]胡群芳,李利君,陳艷紅,等. 從黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中純化α-L-鼠李糖苷酶及酶法制備普魯寧[J]. 現(xiàn)代食品科技,2015,31(1):107-114.

[10]肖安風(fēng),倪輝,吳升山,等. 黑曲霉產(chǎn)柚苷酶的發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 中國食品學(xué)報,2011,11(6):89-97.

[11]Ni H,Xiao A F,Cai H N,et al. Purification and characterization ofAspergillusnigerα-L-rhamnosidase for the biotransformation of naringin to pruning[J]. African Journal of Microbiology Research,2012,6(24).

[12]陳月龍. 棘孢曲霉JMUdb058柚苷酶的結(jié)構(gòu)及其水解柚皮苷的特性研究[D]. 廈門:集美大學(xué),2012.

[13]林加涵,魏文鈴,彭宣憲. 現(xiàn)代生物學(xué)實驗[M]. 北京:高等教育出版社,2001.

[14]Manzanares P,de Graaff L H,Visser J. Purification and characterization of anα-L-rhamnosidase fromAspergillusniger[J]. FEMS Microbiology Letters,1997,157(2):279-283.

[15]Manzanares P,Orejas M,Ibanez E,et al. Purification and characterization of anα-L-rhamnosidase fromAspergillusnidulans[J]. Letters in Applied Microbiology,2000,31(3):198-202.

[16]Gallego M V,Pinaga F,Ramón D,et al. Purification and Characterization of anα-L-Rhamnosidase fromAspergillusterreusof Interest in Winemaking[J]. Journal of Food Science,2001,66(2):204-209.

[17]Yanai T,Sato M. Purification and Characterization of anα-L-Rhamnosidase fromPichiaangustaX349[J]. Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2000,64(10):2179-2185.

[18]Orejas M,Ibanez E,Ramón D. The filamentous fungusAspergillusnidulansproduces anα-L-rhamnosidase of potential oenological interest[J]. Letters in Applied Microbiology,1999,28(5):383-388.

[19]Koseki T,Mese Y,Nishibori N,et al. Characterization of anα-L-rhamnosidase fromAspergilluskawachiiand its gene[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2008,80(6):1007-1013.

[20]Rojas N L,Voget C E,Hours R A,et al. Purification and characterization of a novel alkalineα-L-rhamnosidase produced byAcrostalagmusluteoalbus[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,2011,38(9):1515-1522.

[21]Hashimoto W,Miyake O,Nankai H,et al. Molecular identification of anα-L-rhamnosidase fromBacillussp. strain GL1 as an enzyme involved in complete metabolism of gellan[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics,2003,415(2):235-244.

[22]Puri M,Kalra S. Purification and characterization of naringinase from a newly isolated strain ofAspergillusniger1344 for the transformation of flavonoids[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology,2005,21(5):753-758.

[23]王鏡巖,朱圣庚,徐長法. 生物化學(xué):上冊[M]. 北京:高等教育出版社,2002.

Purification and characterization of anα-L-rhamnosidase from the solid-state fermentation product ofAspergillustubingensis

GAO Ting1,LI Li-jun1,2,3,*,WANG Song1,WU Zhe-yu1,ZHANG Wen-jing1,NI Hui1,2,3

(1.College of Food and Bioengineering,Jimei University,Xiamen 361021,China；2.Fujian Provincial Key Laboratory of Food Microbiology and Enzyme Engineering,Xiamen 361021,China；3.Research Center of Food Biotechnology of Xiamen City,Xiamen 361021,China)

α-L-rhamnosidase is a kind of glycosidase that is of great significance in food and pharmaceutical industry,however,the function-structure relationships is unclear,which hinders the design and production of excellentα-L-rhamnosidase for industrial use. In this study,α-L-rhamnosidase was separated and purified by ammonium sulfate precipitation,hydrophobic interaction chromatography and affinity chromatography from a solid-state fermentation broth ofAspergillustubingensison the matrix of pomelo peel powder. The purification factor and specific activity were 34 and 21105 IU/mg,respectively. SDS-PAGE revealed an apparent molecular weight of 120 ku. The pH and temperature optima were 4.0 and 50 ℃,respectively. The enzyme had good thermal and pH stability. Divalent cations Fe2+stimulated theα-L-rhamnosidase activity,whereas Mn2+,Ca2+and Cd2+inhibited the activity. This enzyme showed the capacity to hydrolyze naringin,but showed little capacity to hydrolyze rutin and p-nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside and couldn’t hydrolyze myricetrin and saikosaponin C. These results indicated the enzyme had the metal ionic affecting property and substrates specificity different from those of previous studies,providing a new type of enzyme for investigating function-structure relationship ofα-L-rhamnosidase.

Aspergillustubingensis;solid-state fermentation;α-L-rhamnosidase;purification;enzymatic properties

2015-12-10

高庭(1992-),男,在讀碩士研究生,研究方向:食品酶學(xué),E-mail:gaoting2024@163.com。

李利君(1973-),女,博士,副教授,研究方向:分子生物學(xué)與酶學(xué),E-mail:ljli@jmu.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金資助項目(31371751)；廈門科技計劃項目(3502Z20153008)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)15-0165-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.024