宗方方,譚　俊,邵　雷,陳代杰,張駿梁,錢志祥,3,張素姬,4

(1.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院 創(chuàng)新藥物與制藥工藝國家重點實驗室,上海 201203;2.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海 200234;3.中國藥科大學(xué)工學(xué)院,江蘇南京 211198;4.中國藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇南京 211198)

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長雙歧桿菌優(yōu)勢菌株的高通量篩選

宗方方1,2,譚俊1,*,邵雷1,陳代杰1,張駿梁1,錢志祥1,3,張素姬1,4

(1.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院 創(chuàng)新藥物與制藥工藝國家重點實驗室,上海 201203;2.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海 200234;3.中國藥科大學(xué)工學(xué)院,江蘇南京 211198;4.中國藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇南京 211198)

本文通過96孔深孔板微型化培養(yǎng)和酶標(biāo)儀快速檢測,建立了簡單、快速、準(zhǔn)確且自動化水平較高的雙歧桿菌高通量篩選方法。經(jīng)過高通量篩選獲得長雙歧桿菌優(yōu)勢菌株BL01,其搖瓶發(fā)酵活菌數(shù)由5.4×108CFU/mL提高到1.53×109CFU/mL,與原始菌株相比約提高3倍;7 L罐發(fā)酵活菌數(shù)由3.9×109CFU/mL提高到1.67×1010CFU/mL,約提高4.3倍,且多次傳代均能維持在較高活菌水平。此法簡單且大大降低篩選成本,對其他微生物菌株的大規(guī)模篩選具有重要參考價值。

長雙歧桿菌,96孔深孔板,高通量篩選,自然選育

雙歧桿菌(Bifidobacterium)是1899年由法國學(xué)者Tissier從母乳喂養(yǎng)的嬰兒糞便中分離出的一種厭氧的革蘭氏陽性桿菌[1]。它是人體消化道內(nèi)具有益生作用的優(yōu)勢菌群,在促進(jìn)人體發(fā)育、維持和提高免疫力、延緩機(jī)體衰老、抗腫瘤等方面起著重要的作用[2-7],雙歧桿菌已成為人體健康的重要指標(biāo)之一[8],有關(guān)雙歧桿菌的微生態(tài)制劑的研究成為一大熱點,并廣泛應(yīng)用于食品、保健和醫(yī)療等領(lǐng)域[9]。研究表明,維持益生菌功能的最低活菌濃度應(yīng)高于107CFU/mL[10]。

菌種是發(fā)酵技術(shù)的源頭,菌種發(fā)酵水平是決定企業(yè)產(chǎn)品能否參與市場競爭的技術(shù)保證?，F(xiàn)有國內(nèi)的菌種選育技術(shù)從誘變育種、雜交育種發(fā)展到代謝工程育種和系統(tǒng)生物學(xué)育種,已大大提高了微生物育種的效果,但是,與之配套的高通量篩選技術(shù)還處于滯后狀態(tài),嚴(yán)重制約了菌種選育研究工作的展開[11-12]。高通量篩選(High throughput screening,HTS)技術(shù)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種用于新化合物開發(fā)及目的菌種選育等的高新技術(shù),由于具備微量、高效、靈敏、準(zhǔn)確、可重復(fù)等特點,引起微生物技術(shù)研究者的極大興趣。雙歧桿菌作為用于食品及藥品的益生菌,其優(yōu)勢菌群的獲得不能經(jīng)過誘變,只能通過自然選育,而傳統(tǒng)的搖瓶選育方法工作量大,費時費力,很難篩選到高活力的優(yōu)勢菌株。擴(kuò)大篩選量來有效減少隨機(jī)篩選的盲目性是提高育種效率的一個重要方面,也是菌種選育過程成敗的一個關(guān)鍵步驟[13]。因此,使用現(xiàn)有的通用低成本儀器設(shè)備,自主開發(fā)簡便、快速、精準(zhǔn)、高效的高通量篩選技術(shù)具有重要意義。高通量篩選方法不僅能有效克服傳統(tǒng)篩選中的漏篩問題,更具有簡單、快速、準(zhǔn)確且自動化水平較高的特點,大大降低篩選成本,對其他益生菌等菌株的大規(guī)模篩選同樣具有重要的參考價值。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

長雙歧桿菌(Bifidobacterium.longum)中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC6187)。

斜面培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏10.0,蛋白胨5.0,酵母粉3.0,D(+)-葡萄糖5.0,可溶性淀粉1.0,氯化鈉5.0,無水乙酸鈉3.0,L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5,瓊脂粉15.0,pH6.8;種子培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏10.0,蛋白胨5.0,酵母粉3.0,D(+)-葡萄糖5.0,可溶性淀粉1.0,氯化鈉5.0,無水乙酸鈉3.0,L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5,pH6.8;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):安琪FP103蛋白胨17.0,安琪FM405酵母粉16.0,D(+)-葡萄糖22.0,氯化鈉5.0,無水乙酸鈉3.0,L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5,低聚異麥芽糖4.0,pH6.8。

電子天平,PB-10酸度計，8道移液器Sartorius;酶標(biāo)儀Thermo Scientific;厭氧培養(yǎng)箱Ruskinn 400M;立式壓力蒸汽滅菌鍋上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2實驗方法

1.2.1高通量篩選流程菌種的自然分離→高通量初篩→平行復(fù)篩→搖瓶驗證→罐發(fā)酵驗證→穩(wěn)定性考察

1.2.2菌種的自然分離96深孔板每孔種子培養(yǎng)基裝液量為1 mL,取1支原始菌株6187的甘油管,等分至96深孔板各孔中。厭氧培養(yǎng)箱中37 ℃靜置培養(yǎng),14 h后檢測各孔OD600,選出OD值最高的孔,梯度稀釋后涂布平板進(jìn)行單菌落分離,厭氧培養(yǎng)24 h后,挑選長勢較好的單菌落進(jìn)行高通量初篩。

1.2.2初篩用牙簽從平皿上挑選盡可能多的單菌落,至96深孔板中,37 ℃靜置厭氧培養(yǎng)14 h,用8道移液槍取樣200 μL/孔,酶標(biāo)儀檢測OD600。

1.2.3復(fù)篩從初篩菌株中挑選OD值較高的24個孔進(jìn)行復(fù)篩。按照5%(v/v)接種量接入已裝有1 mL種子培養(yǎng)基的96孔板中,每組4個平行,37 ℃靜置厭氧培養(yǎng)14 h,用8道移液槍取樣200 μL/孔,酶標(biāo)儀檢測OD600。

1.2.4搖瓶發(fā)酵將優(yōu)勢菌株與原始菌株分別接斜面,37 ℃厭氧活化24 h后,將斜面洗下,接至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,每隔2 h取樣活菌計數(shù),繪制生長曲線。

1.2.5傳代穩(wěn)定性考察將復(fù)篩出的長雙歧桿菌優(yōu)勢菌株在斜面培養(yǎng)基中連續(xù)傳代5次,將不同傳代次數(shù)的菌株分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實驗,并對發(fā)酵液進(jìn)行活菌計數(shù),考察菌種傳代穩(wěn)定性。

1.2.67 L罐發(fā)酵將優(yōu)勢菌株與原始菌株于新鮮斜面上活化24 h后,分別接至種子培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)12 h,按照5%(v/v)接種量接至7 L發(fā)酵罐(裝量5 L)中,設(shè)定轉(zhuǎn)速為200 r/min,溫度為37 ℃,NaOH調(diào)節(jié)pH穩(wěn)定維持在6.0,每2 h取樣進(jìn)行活菌計數(shù)。

1.2.7活菌計數(shù)將待測樣品經(jīng)梯度稀釋后,選擇合適的稀釋度的菌液,分別取100 μL加到已制備好的固體平板上,然后用無菌涂棒將菌液涂布整個平板表面,每個稀釋度涂三個及以上平板,37 ℃厭氧倒置培養(yǎng),待菌落長出后,計數(shù),并計算出原菌液的含菌數(shù)(CFU/mL):每毫升原菌液活菌數(shù)=同一稀釋度三個平皿菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×10

1.2.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析實驗中每個處理重復(fù)三次,采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計及誤差分析,并作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1長雙歧桿菌生長曲線

要想快速、高效地從龐大的菌種庫中篩選出優(yōu)勢菌株,不僅要通過高通量培養(yǎng),技術(shù)還要建立與之配套的快速、高效的高通量檢測技術(shù)[14]。傳統(tǒng)的活菌計數(shù)方法隨著篩選樣本量的增多,工作量大大增加,費時費力,不能配合高通量培養(yǎng)實現(xiàn)高通量篩選。本文建立了96深孔板菌種高通量培養(yǎng)方法及酶標(biāo)儀高通量檢測方法,選取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的樣品,于600 nm波長快速檢測。OD值反映的是被檢測物所吸收的光密度,死亡的菌體仍然會有吸收值,容易影響篩選結(jié)果,因此首先要確定合適的取樣時間。

圖1顯示了長雙歧桿菌深孔板培養(yǎng)過程中活菌數(shù)與OD值的關(guān)系:0～12 h活菌數(shù)不斷增加,OD值也不斷提高,兩者呈一定對應(yīng)關(guān)系;16 h時活菌數(shù)達(dá)到最大值,此后活菌數(shù)有所下降,但16 h后OD值則處于一個平穩(wěn)的狀態(tài),因此選擇14 h作為高通量檢測時間,高通量檢測方法使得大量樣品可同時檢測,大大減少了檢測誤差。

圖1　長雙歧桿菌生長曲線圖Fig.1　Growth curve of bifidobacterium longum

表1　96孔板OD值Table 1　The Optical Density of the 96-deep MTPs

2.2菌種的自然分離

從表1結(jié)果可以看出菌株生長存在明顯差異,甘油管37 ℃活化16 h后,大部分OD都處于0.4～0.5之間,還有一部分OD值處于0.1～0.2,而長勢最好的C8孔OD達(dá)到0.607,選擇C8孔進(jìn)行稀釋涂布,分離單菌落進(jìn)行高通量初篩。

2.3菌種的高通量初篩結(jié)果

從圖2可以看出,挑選的1056個單菌落的生長情況差別較為明顯,大部分菌株的OD值處于0.5～0.7之間,只有少數(shù)菌株的OD值達(dá)到0.7～1.0。

圖2　高通量初篩Fig.2　High-throughput preliminary screening

2.4菌種的高通量復(fù)篩結(jié)果

從圖3可以看出,7號孔生長最好,OD值最高為0.768。選擇該菌株(編號BL01)進(jìn)行斜面及甘油管保存。

圖3　高通量復(fù)篩Fig.3　High-throughput secondary screening

2.5搖瓶發(fā)酵驗證

從優(yōu)勢菌株BL01與原始菌株6187的生長曲線對比圖可以很明顯發(fā)現(xiàn)(圖4),搖瓶發(fā)酵情況下,長雙歧桿菌在14 h活菌數(shù)達(dá)到最大,BL01菌株與原始出發(fā)菌株6187相比,活菌數(shù)由5.4×108CFU/mL提高到1.53×109CFU/mL,約提高3倍?？梢?此高通量篩選方法具有可行性。

圖4　菌株BL01與菌株6187的搖瓶發(fā)酵對比Fig.4　CFU comparisons between the strain 6187 and strain BL01 in shake flasks

2.6傳代穩(wěn)定性的考察

將長雙歧桿菌優(yōu)勢菌株BL01在斜面培養(yǎng)基中連續(xù)傳代5次,分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實驗,活菌數(shù)計算分別為1.33×109、1.39×109、2.38×109、1.09×109,1.12×109CFU/mL,表明該優(yōu)勢菌株具有比較穩(wěn)定的遺傳性。

2.77 L罐發(fā)酵

從7L罐發(fā)酵對比圖可以很明顯看到(圖5),長雙歧桿菌在14 h活菌數(shù)達(dá)到最大,BL01菌株與原始出發(fā)菌株6187相比,活菌數(shù)由3.9×109CFU/mL提高到1.67×1010CFU/mL,約提高4.3倍。進(jìn)一步證實此高通量篩選方法具有可行性。

圖5　菌株BL01與菌株6187的7 L罐發(fā)酵對比Fig.5　CFU comparisons between the strain 6187 and strain BL01 in 7 L bioreactor

3　結(jié)論

益生菌產(chǎn)品的優(yōu)劣與其制備過程中的各個環(huán)節(jié),如菌種的選擇、發(fā)酵過程、凍干過程、保存方法等息息相關(guān),每一環(huán)節(jié)都要盡量減少活菌數(shù)的損失。好的菌株是制備產(chǎn)品的第一步,尤為關(guān)鍵。然而,傳統(tǒng)的搖瓶篩選方法,不僅操作繁瑣,工作量大,且因通量限制,大部分菌株由于沒有篩選機(jī)會而流失。本文采用96深孔板微型化培養(yǎng)和酶標(biāo)儀檢測,建立了一種快速有效的雙歧桿菌優(yōu)勢菌株的高通量篩選方法:將傳統(tǒng)的初篩和復(fù)篩縮小在微孔板中進(jìn)行,先篩選出具有生長優(yōu)勢的混合菌群,再進(jìn)一步從中分離純化,高通量檢測可快速篩選出優(yōu)勢菌株,很大程度上降低了篩選工作量,給育種工作者減輕了負(fù)荷。本文經(jīng)高通量篩選方法獲得的優(yōu)勢菌株,大大提高了發(fā)酵活菌數(shù),經(jīng)過傳代實驗證明其具有良好的穩(wěn)定性,為之后的凍干、保存等環(huán)節(jié)打好堅實的基礎(chǔ)。

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Developing a high-throughput screening method for dominant strains ofBifidobacterium.longum

ZONG Fang-fang1,2,TAN Jun1,*,SHAO Lei1,CHEN Dai-jie1,ZHANG Jun-liang1,QIAN Zhi-xiang1,3,ZHANG Su-ji1,4

(1.State Key Laboratory of New Drug and Pharmaceutical Process,Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry,China State China Pharmaceutical University,Nanjing 211198,China;2.College of Life and Environment Science,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China;3.College of Engineering,China Pharmaceutical University,Nanjing 211198,China;4.College of Life Science and Technology,China Pharmaceutical University,Nanjing 211198,China)

A simple and rapid high-throughput screening(HTS)method was developed through 96-deep MTPs and microplate reader. This new screening approach greatly increased the efficiency of obtaining the dominant strain compared with the conventional method. As a result,the dominant strain BL01 was successfully screened out and the Colony Forming Units was nearly 3-fold higher than that of the original strain in shake flasks,4 times higher than that of the original strain in 7 L bioreactor. The strain BL01 was stable enough for many generations. High-throughput screening method was valuable for many other microbial strains. It is believed that the HTS field continues to be promising and dynamic in the future.

Bifidobacterium.longum;96-deep MTPs;high-throughput screening;natural selection

2016-01-27

宗方方(1991-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：微生物藥物，E-mail:elvazong@163.com。

譚俊(1983-)，女，助理研究員，研究方向：微生物藥物，E-mail:baiyuge1113@163.com。

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2013ZX09301302，2014ZX09507009-025)；國家自然科學(xué)基金(81573329)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)15-0150-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.021