楊鳳田,張雅瑋,李　順,劉成花,黃孝闖,劉世欣,彭增起

(南京農(nóng)業(yè)大學食品科學與技術學院,食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京 210095)

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油菜蜂花粉黃酮提取物抗氧化性測定及在色拉米中的應用

楊鳳田,張雅瑋,李順,劉成花,黃孝闖,劉世欣,彭增起*

(南京農(nóng)業(yè)大學食品科學與技術學院,食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京 210095)

利用超聲波輔助提取油菜蜂花粉黃酮類化合物,以總抗氧化能力、DPPH自由基清除能力和羥基自由基清除能力為指標評價體外抗氧化能力,并將其應用到色拉米腸中評價對脂肪氧化的影響。結果表明,油菜蜂花粉黃酮得率為3.02%,油菜蜂花粉提取物中黃酮含量為604 mg/g。黃酮含量為250 μg/mL的油菜蜂花粉提取物的總抗氧化能力、DPPH自由基清除能力和羥基自由基清除能力分別是維生素E(250 μg/mL)的1.62倍、1.18倍和3.11倍。0.05%油菜蜂花粉黃酮提取物能顯著降低色拉米的過氧化值(POV)和硫代巴比妥酸值(TBARS)(p<0.05)。

油菜蜂花粉,黃酮提取物,抗氧化,色拉米,應用

油菜蜂花粉是細小的顆粒狀物質,是由蜜蜂采集開花植物的雄性生殖細胞,將其收集到蜂巢中,作為蜂食[1]?；ǚ壑泻胸S富的營養(yǎng)物質,包括蛋白質、脂類、維生素、糖類和黃酮類化合物,被稱為“微型營養(yǎng)庫”[2]。其中的黃酮類化合物具有抗氧化、增強免疫力、防止前列腺疾病、降血脂、保肝護肝、促進睡眠、美容養(yǎng)顏、防止貧血等作用[3-5]。國內外對油菜蜂花粉中的黃酮類化合物研究多集中在提取方法[6]和化學成分的定性分析上[7],而對它的應用性研究較少。

色拉米腸作為一種典型的發(fā)酵香腸,由于脂肪含量較高,易發(fā)生過氧化[8],因此有必要采用抗氧化劑來抑制其氧化作用。目前使用的化學合成抗氧化劑因存在潛在毒性,其安全性倍受質疑[9]。在追求健康飲食的今天,尋找天然的抗氧化劑成為新的研究趨勢[10]。本實驗研究油菜蜂花粉黃酮提取物的體外抗氧化活性,同時應用到色拉米中對其抗氧化性進行評價以開發(fā)新的植物源抗氧化劑,為油菜蜂花粉的有效利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

油菜蜂花粉南京老山藥業(yè)股份有限公司(產(chǎn)地:南京溧水區(qū)),50 ℃烘干,粉碎后過60目篩后備用;D101大孔吸附樹脂上海源葉生物科技有限公司;原料肉(豬瘦肉、牛肉和豬背膘)和香辛料南京蘇果超市有限公司;乳酸菌發(fā)酵劑科漢森食品添加劑有限公司;總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒南京建成生物工程研究所;1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)美國sigma公司;無水乙醇,石油醚(30～60 ℃),碘化鉀,硫代硫酸鈉,硫代巴比妥酸等試劑為分析純。

中草藥粉碎機河北省黃燁科學儀器廠;KQ2200DE型超聲波清洗機昆山市超聲儀器有限公司;DGG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱上海森信實驗儀器有限公司;MS104TS電子分析天平上海Mettler-Toledo儀器有限公司;DU730型紫外-可見分光光度計美國Beckman Coulter有限公司;RE-52A型旋轉蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器有限公司;Scientz-50N冷凍干燥機寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1提取物樣品的制備精確稱取油菜蜂花粉2 g加80%的乙醇100 mL,超聲提取油菜蜂花粉總黃酮,150 W,30 min,抽濾,石油醚萃取兩到三次后旋轉蒸發(fā)得到粗提物[6]。粗提物加入到D101大孔吸附樹脂中做吸附純化[11]。得到的解析液真空冷凍干燥得到提取物粉末,置于干燥器中備用。

1.2.2色拉米的制作色拉米配方:豬瘦肉50%,牛肉25%,豬背膘25%,亞硝酸鈉0.012%,3.5%香辛料(鹽、葡萄糖、生姜粉、辣椒粉等)、乳酸菌菌種0.025%、葡萄酒0.5%。

實驗分為只添加輔料的對照組和添加0.05%油菜蜂花粉黃酮提取物的處理組。色拉米制作工藝流程如下:

實驗選取5個取樣點:分別是第0 d(灌腸前),第2 d(發(fā)酵結束),第6 d(干燥前期),第9 d(干燥中期),第12 d(干燥結束后的成品)對每個實驗組分別取樣,每個實驗組做三個重復。

1.3測定方法

1.3.1提取物中黃酮含量測定精確稱取蘆丁標準品0.0105 g,80%乙醇溶解后定容于100 mL容量瓶中,得到0.105 mg/mL蘆丁標準品溶液。用移液槍分別吸取標準液0、1、2、3、4、5mL于10 mL容量瓶中,加入5% NaNO2溶液0.4 mL,搖勻;靜置6 min后,加入10% Al(NO3)3溶液0.4 mL,搖勻;放置6 min后,再加入4% NaOH溶液4 mL,搖勻;最后用60%的乙醇定容,靜止15 min后于510 nm處測定吸光值[12]。蘆丁濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制標準曲線。黃酮含量表示為mg/g(提取物干粉)。同時計算黃酮得率:

油菜蜂花粉黃酮得率(%)=(蜂花粉中總黃酮的質量/蜂花粉的質量)×100

1.3.2體外抗氧化性的測定采用總抗氧化能力、清除DPPH自由基的能力、清除羥基自由基能力三個方面比較客觀的評價油菜蜂花粉黃酮提取物的體外抗氧化能力。

1.3.2.1總抗氧化活性實驗方法:樣品配制成黃酮濃度分別為25、50、100、150、200、250 μg/mL的溶液[13]。按照總抗氧化能力檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)要求準備各工作液,在37 ℃時,每分鐘每毫升樣液使反應體系的吸光值每增加0.01時,為一個總抗氧化能力單位,其結果表示為U/mL。

1.3.2.2清除DPPH自由基DPPH·作為一種穩(wěn)定的自由基在乙醇溶液中呈現(xiàn)深紫色,當加入自由基清除劑時,其孤對電子被配對,溶液顏色變淺,可用來檢測自由基的清除效果,以此來評價物質的抗氧化能力[14]。樣品配制成黃酮濃度分別為25、50、100、150、200、250 μg/mL的提取物溶液。配制0.04 mg/mL DPPH·乙醇溶液,吸取黃酮提取液0.6 mL,加入DPPH·醇溶液3.4 mL,室溫下避光放置0.5 h,于517 nm處測吸光度A樣品,同時測定3.4mL DPPH·溶液和0.6 mL蒸餾水的混合液的吸光度A0,同樣的方法測定維生素E溶液作為對照組[15]。其中自由基清除活性公式為:

自由基清除率(%)=[(1-A樣品)/A0]×100

其中A樣品是3.4 mL DPPH·和0.6 mL黃酮提取液的吸光值,A0是3.4 mL DPPH·和0.6 mL蒸餾水的吸光值。

1.3.2.3清除羥基自由基羥基自由基是一種重要的活性氧,是由氫氧根失去一個電子形成。羥基自由基是最活潑也最具危害性的自由基,氧化性僅次于氟。因此往往也很難清除[16]。參考劉駿的方法—結晶紫法[17]來評價油菜蜂花粉黃酮提取物的清除羥基自由基的能力。配制黃酮濃度為0.5 mg/mL花粉黃酮提取液和維生素E(0.5 mg/mL)儲備液。分別加0.2 mL結晶紫(0.4 mmol/L)、0.6 mL FeSO4溶液(10.0 mmol/L)和0.8 mL H2O2溶液(5.0 mmol/L)于10 mL比色管中,并用磷酸氫二鉀-檸檬酸緩沖溶液(pH=4.0)定容至10 mL,搖勻后放置30 min,在580 nm處測其吸光度A0同時測定不加H2O2時580 nm處的吸光度A1,其羥自由基的產(chǎn)生量可以用ΔA=A1-A0。樣品液對羥自由基清除率的測定:按照以上步驟在加H2O2之前分別加入1、2、3、4、5 mL樣品儲備液,測定其吸光度A樣,所有測定平行進行三次,取平均值。則樣品溶液對羥自由基的清除率為:

自由基清除率(%)=(A樣-A0)/(A1-A0)

1.3.3脂肪氧化指標測定

1.3.3.1過氧化值(POV)按照GB/T5009.37-2003《食用植物油衛(wèi)生標準的分析方法》測定。

1.3.3.2硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)值參考Faustman等[18]的方法。準確稱取5 g肉樣品于離心管中,加25 mL 20% TCA和20 mL 蒸餾水,在冰水浴中以9000 r/min 轉速用高速勻漿機勻漿60 s,然后在4 ℃,3000×g離心10 min,過濾,濾液用蒸餾水定容到50 mL,然后取2 mL濾液加2 mL 0.02 mol/L TBA在沸水浴中反應20 min,取出用流水冷卻5 min,最后用紫外-可見分光光度計測定532 nm波長處的吸光度,空白樣為25 mL 20% TCA用蒸餾水定容到50 mL,步驟如上所述。TBA值通過標準曲線來計算,結果表示為 μg丙二醛/g肌肉。

1.4統(tǒng)計分析

所有實驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel進行整理,利用Sigmaplot12.0作圖,用SAS 8.2軟件進行統(tǒng)計分析。采用鄧肯多重比較,p<0.05表示差異顯著。

2　結果與討論

2.1蜂花粉黃酮提取物黃酮含量測定

利用最小二乘法做線性回歸,得蘆丁濃度與吸光度關系曲線的回歸方程y=1.0049x+0.0014(R2=0.9966),蘆丁濃度在 0～0.06 mg/mL范圍內與吸光度有良好的線性關系。油菜蜂花粉黃酮得率為3.02%。提取物中總黃酮含量為604 mg/g。

2.2油菜蜂花粉黃酮提取物體外抗氧化活性評價

通過一種方法來評價一種物質的抗氧化性是不客觀的,本實驗采用總抗氧化能力、清除DPPH自由基的能力、清除羥基自由基能力三個方面客觀地評價油菜蜂花粉黃酮提取物的體外抗氧化能力。

2.2.1總抗氧化能力分析不同實驗組的總抗氧化能力如圖1所示?？梢钥闯?油菜蜂花粉黃酮提取物和維生素E隨著樣品液質量濃度的增加,其總抗氧化能力顯著增強(p<0.05)。在25～250 μg/mL的濃度范圍內,油菜蜂花粉黃酮提取液的總抗氧化能力為2.13～66.06 U/mL,而維生素E的總抗氧化能力為1.23～40.74 U/mL。在低濃度下(樣品液濃度低于150 μg/mL)時,油菜蜂花粉提取物總抗氧化活性略高于維生素E(p>0.05)。當樣品液濃度大于150 μg/mL時,油菜蜂花粉的總抗氧化活性顯著高于維生素E(p<0.05)。250 μg/mL濃度下,油菜蜂花粉提取物的總抗氧化能力是維生素E的1.62倍。

圖1　油菜蜂花粉黃酮提取液的總抗氧化能力Fig.1　Total antioxidant capacity of rape bee pollen flavonoids extract

2.2.2清除DPPH自由基能力分析圖2反映的是油菜蜂花粉黃酮提取物和維生素E對DPPH自由基的清除作用?？梢钥闯?在濃度25～250 μg/mL的濃度范圍內,油菜蜂花粉黃酮提取物和維生素E均表現(xiàn)出較好的清除DPPH自由基的能力。且隨著濃度的增加,當樣品液濃度低于150 μg/mL時,油菜蜂花粉黃酮提取物和維生素E對DPPH自由基的清除能力均顯著增強(p<0.05)。當質量濃度增加到150 μg/mL時,油菜蜂花粉黃酮提取物對DPPH自由基的清除率增加速度減慢,油菜蜂花粉黃酮提取物清除DPPH自由基能力為22.5%～97.68%,而維生素E清除DPPH自由基能力為21.04%～82.76%。除樣品液濃度為50 μg/mL時油菜蜂花粉黃酮提取物和維生素E對DPPH自由基的清除能力差異性不顯著(p>0.05),在其他每一個濃度點,油菜蜂花粉黃酮提取物的清除DPPH自由基能力都顯著高于維生素E(p<0.05)。250 μg/mL濃度下,油菜蜂花粉提取物的DPPH自由基清除能力是維生素E的1.18倍。

圖2　油菜蜂花粉黃酮提取物的清除DPPH自由基能力Fig.2　DPPH free radical scavenging activity of rape bee pollen flavonoids extract

2.2.3清除羥基自由基能力分析不同實驗組的清除羥基自由基能力如圖3所示。可以看出,樣品液在較低濃度時,油菜蜂花粉黃酮提取物就表現(xiàn)出較好的清除羥基自由基能力,而維生素E清除羥基自由基的能力較弱,兩個實驗組差異性顯著(p<0.05)。隨著樣品液加入量增加,油菜蜂花粉黃酮提取物清除羥基自由基的能力有所增強。油菜蜂花粉黃酮提取物清除羥基自由基的能力為61.45%～93.56%,而維生素E清除羥基自由基的能力為13.23%～30%。250 μg/mL濃度下,油菜蜂花粉提取物的羥基自由基清除能力是維生素E的3.11倍。

圖3　油菜蜂花粉黃酮提取物清除羥基自由基能力Fig.3　Hydroxyl radical scavenging activity of rape bee pollen flavonoids extract

本實驗油菜蜂花粉提取物在總抗氧化能力和自由基清除能力的評價體系中,取得了理想的效果,主要是由于油菜蜂花粉黃酮的分子結構中富含活性基團,遇到多種自由基均能提供H+而使自由基的氧化還原點位降低,從而發(fā)揮清除自由基的作用[19]。

2.3色拉米加工過程中脂肪氧化指標的測定

2.3.1色拉米加工過程中過氧化值(POV)的變化POV值主要用來衡量脂肪初級氧化產(chǎn)物的量,尤其是脂質氧化產(chǎn)生的氫過氧化物(HPOD)的量[20]。根據(jù)王文艷[21]的報道,添加9～12 g/kg的油菜蜂花粉可以較好得延長南京香腸的貯藏期,本實驗油菜蜂花粉黃酮得率為3.02%,本實驗選擇油菜蜂花粉黃酮提取物的添加量為0.05%。由圖4可以看出,在整個加工過程中,對照組和處理組POV值前期呈增長趨勢,之后有所降低。這是由于脂肪氧化最開始的階段以一次氧化作為主要氧化反應,生成大量的HPOD,而HPOD的量隨著反應時間的增長而增加,當累積到一定程度時,HPOD的量會達到最高值。隨后二級氧化繼續(xù)發(fā)生,醛類、醇類、酮類等物質作為二級氧化產(chǎn)物大量生成,此時HPOD的量也就迅速降低,因而POV有所降低。當添加0.05%的油菜蜂花粉黃酮提取物時,處理組的POV與對照組相比明顯降低(p<0.05),干燥后成品的POV值相比對照組降低了23%。說明油菜蜂花粉黃酮提取物可以有效地降低色拉米加工過程中的POV值。

圖4　色拉米加工過程中POV值的變化Fig.4　POV value of diffetent salami treatments during processing

圖5　色拉米加工過程中TBARS的變化Fig.5　TBARS value of diffetent salami treatments during processing

2.3.2色拉米加工過程中硫代巴比妥酸值(TBARS)的變化TBARS值是評價脂肪二次氧化程度的重要指標,主要反映了脂肪氧化的最終產(chǎn)物丙二醛的含量[22]。由圖5可知,對照組和處理組的TBARS值在整個加工過程中都呈現(xiàn)上升趨勢,前期上升緩慢,后期上升速度較快。干燥第6 d時,對照組的TBARS為0.571 mg MDA/kg,比添加0.05%的黃酮提取物處理組高出0.198 mg MDA/kg。干燥結束后,對照組的TBARS值為1.321 mg MDA/kg,而添加0.05%的黃酮提取物為0.871 mg MDA/kg。在干燥中后期黃酮提取物可以顯著降低色拉米腸的TBARS值(p<0.05)。成品的TBARS值相比對照組降低了34%。油菜蜂花粉中的黃酮可以減緩脂質過氧化,降低色拉米加工過程中的過氧化值,主要是由于含有山奈酚、槲皮素等黃酮類化合物[23]。

3　結論

油菜蜂花粉提取物中黃酮類化合物含量為604 mg/g。油菜蜂花粉黃酮提取物的總抗氧化能力、DPPH自由基和羥基自由基清除能力優(yōu)于維生素E。添加0.05%油菜蜂花粉黃酮提取物于色拉米中,成品中的POV值降低了23%,TBARS值降低了34%。因此,油菜蜂花粉黃酮提取物可作為優(yōu)良的天然抗氧化劑使用。

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Antioxidation of rape bee pollen flavonoid extracts and application in salami

YANG Feng-tian,ZHANG Ya-wei,LI Shun,LIU Cheng-hua,HUANG Xiao-chuang,LIU Shi-xin,PENG Zeng-qi*

(College of Food Science and Technology,Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

The flavonoid in rape bee pollen was extracted by ultrasound-assisted technology. Theinvitroantioxidant capacity was observed through three antioxidant assays including total antioxidant capacity,DPPH radical scavenging ability and hydroxyl radical scavenging capacity. The rape bee pollen flavonoid extracts were investigated as a natural antioxidant for the lipid stability of the salami.According to the results,the yield of flavonoid was 3.02% in rape bee pollen and 604 mg/g in the extracts. Total antioxidant capacity,DPPH radical scavenging ability and hydroxyl radical scavenging capacity of 250 μg/mL flavonoid extracted from rape bee pollen were respectively 1.62,1.18,3.11 times that of Vitamin E. Addition of 0.05% flavonoid extracts significantly caused a decrease(p<0.05)in the POV values and TBARS values of the salami.

rape bee pollen;flavonoid extract;antioxidant;salami;application

2016-01-14

楊鳳田(1990-)，女，碩士研究生，研究方向:畜產(chǎn)品加工與質量控制,E-mail：2014808124@njau.edu.cn。

彭增起(1956-)，男，博士，教授，畜產(chǎn)品加工與質量控制，E-mail：zqpeng@njau.edu.cn。

TS251.5

A

1002-0306(2016)15-0121-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.015