程　聞,徐紅華,*,董世榮,夏行昊,譚俊艷,張艷杰

(1.東北農業(yè)大學食品學院食品質量與安全系,黑龍江哈爾濱 150030;2.東北農業(yè)大學黑龍江省乳品工業(yè)技術開發(fā)中心，黑龍江哈爾濱 150000;3.上海晨冠乳業(yè)有限公司，上海 201401)

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WPC納米纖維聚合物體外消化性能的研究

程聞1,徐紅華1,*,董世榮1,夏行昊2,譚俊艷1,張艷杰3

(1.東北農業(yè)大學食品學院食品質量與安全系,黑龍江哈爾濱 150030;2.東北農業(yè)大學黑龍江省乳品工業(yè)技術開發(fā)中心，黑龍江哈爾濱 150000;3.上海晨冠乳業(yè)有限公司，上海 201401)

為了研究納米纖維聚合物的體外消化性能,本文對不同加熱時間下納米纖維聚合物和常規(guī)聚合物性能與指標進行測定,并探討了胃蛋白酶和胰蛋白酶對2種不同結構聚合物的體外消化作用。結果表明,納米纖維聚合物的表面疏水性和游離巰基含量比常規(guī)聚合物高。在相對較低的酶濃度(E/S為1/30)條件下,與常規(guī)聚合物對比,納米纖維聚合物的水解度較高;但是,增加酶濃度(E/S為1/3)導致的水解度提高幅度遠不如WPC常規(guī)聚合物,尤其對胰蛋白酶而言,幾乎沒有任何提高,并且納米纖維聚合物的水解度要低于常規(guī)聚合物的水解度,但對胃蛋白酶而言,酶的添加量的增加依然使納米纖維聚合物的水解度高于常規(guī)聚合物的水解度。對于WPC納米纖維聚合物形成的3個時期而言,成核期有利于胃蛋白酶的水解,穩(wěn)定期有利于胰蛋白酶的水解?？梢缘贸鼋Y論:體外消化過程中,納米纖維聚合物更容易被水解。

乳清濃縮蛋白,纖維,聚合,消化,熱處理

近年來的研究顯示,在低pH(遠離等電點)、低離子強度、高溫長時間加熱條件下,乳清分離蛋白(WPI)、β-乳球蛋白等蛋白能夠自組裝形成直徑幾納米、長度幾微米的纖維狀聚合物[1]。Durand等人[2-3]研究發(fā)現(xiàn),乳清分離蛋白(WPI)在pH2.0條件下,70～80 ℃加熱數(shù)小時會形成乳清蛋白纖維結構。Arnaudov等人[4]在2002年報道,在pH2.0和低離子強度條件下,β-乳球蛋白80 ℃加熱10～24 h,形成納米纖維結構。Dave等人[5]也發(fā)現(xiàn)在pH2.0和低離子強度條件下,β-乳球蛋白80 ℃加熱可以自組裝為長鏈納米纖維。同時,我們團隊前期已經對乳清濃縮蛋白納米纖維的形成進行了系統(tǒng)研究,確定乳清濃縮蛋白在pH1.8～2.0、90 ℃加熱處理10 h以上可形成良好的納米纖維聚合物[6-7],纖維直徑在24～28 nm,對溫度、pH、離子強度、熱處理時間等條件對纖維形成及纖維直徑的影響進行了系統(tǒng)研究,并比較了乳清蛋白納米纖維與常規(guī)聚合物乳化性、起泡性、膠凝性的差異。但迄今為止,對乳清濃縮蛋白納米纖維的體外消化特性研究甚少。因此,本文采用胃蛋白酶以及胰蛋白酶對乳清濃縮蛋白(WPC)納米纖維聚合物和常規(guī)聚合物進行酶解處理,比較乳清濃縮蛋白2種不同聚合結構的體外消化能力差異,分析納米纖維在形成不同時期的體外消化能力差異,為乳清濃縮蛋白納米纖維的應用拓寬新的方向。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

實驗采用的WPC-80來自于美國HILMA公司。

乳清蛋白粉WPC-80(蛋白質76.93%,脂肪1.4%,乳糖5.6%,灰分4.62%,均為質量分數(shù));胃蛋白酶,胰蛋白酶北京索萊寶科技有限公司。

KDN-102C半自動定氮儀上海纖檢儀器有限公司;DK-98-ⅡA恒溫磁力水浴鍋天津市泰斯特儀器有限公司;F-4500熒光分光光度計日本HITACHI;GL-21M型冷凍離心機上海精密儀器研究所;DELTA320型pH計梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1乳清濃縮蛋白纖維聚合物的制備按照我們前期研究的制備方法進行制備[6-7],將12 g乳清濃縮蛋白(WPC-80)溶于100 mL去離子水,用6 mol/L HCl將溶液的pH調至2.0,14000×g,10 ℃離心20 min,取中間清液,利用凱氏定氮法測定蛋白含量,隨即用pH2.0去離子水將蛋白濃度稀釋至2 wt%,90 ℃水浴加熱(0、1、5、10、15、18、20 h),取樣,4 ℃冰箱保存。

常規(guī)乳清濃縮蛋白聚合物的制備,除了上述離心前和稀釋前兩處調pH的地方無需調整,其余步驟同上。即乳清濃縮蛋白在pH2.0和pH6.5加熱條件下分別形成纖維聚合物和常規(guī)聚合物。

1.2.2表面疏水性參照相關ANS(8-苯氨基-1-奈磺酸)熒光探針法測定[8],并加以改進。用0.01 mol/L的磷酸緩沖液將不同pH、熱處理不同時間得到的蛋白溶液稀釋成蛋白濃度分別為0. 2 wt%、0.1 wt%、0.05 wt%和0.025 wt%。取已稀釋后的蛋白溶液6 mL,加入20 μL 的8 mmol/L ANS溶液,漩渦攪拌均勻,在室溫下避光15 min,隨即在激發(fā)波長為390 nm、發(fā)射波長為470 nm和狹縫5 nm的條件下利用熒光分光光度計比色,測定熒光強度,以熒光強度值為縱坐標,蛋白質溶液濃度為橫坐標作圖,初始斜率即為樣品表面疏水性值。

1.2.3游離巰基本實驗參照Shimada等人的方法,結合自身實驗加以改善[9]。取1 mL不同條件處理后的樣品(20 mg/mL),加入至5 mL的Tris-Gly緩沖溶液(0.086 mol/L Tris,0.09 mol/L甘氨酸,0.004 mol/L乙二胺四乙酸,pH8.0和8 mol/L尿素)中,然后在向其中加入20 μL的2,2′-dinitro-5,5′-dithiodibenzoate(DTNB)試劑,震蕩混勻,在室溫下靜止15 min,利用紫外分光光度計在412 nm波長下測定吸光值,以不加DTNB的溶液做空白調零。

巰基含量(μmolSH/L)=(73.53×A412×D)/C

式中:A412-在412 nm下的吸光值,計算時可用平均值;C-固形物含量(mg/mL);D-稀釋系數(shù)。

1.2.4濁度測定參考Kurganov[10]等人的方法,并加以改善。將蛋白濃度為20 mg/mL的樣品溶液用去離子水稀釋至2 mg/mL,混勻,在室溫條件下利用紫外分光光度計在波長400 nm下測定OD值,用去離子水調零。OD值即為濁度值。

1.2.5乳清濃縮蛋白纖維的體外模擬消化實驗

1.2.5.1蛋白酶活力的測定參照中華人民共和國專業(yè)標準(SB/T 10317-1999)測定。胰蛋白酶酶活17.9×104U/g,胃蛋白酶酶活力5.4×104U/g。

1.2.5.2單酶酶解反應胃蛋白酶酶解反應:10 mL 2 wt %的蛋白溶液,用1 mol/LHCL調節(jié)pH至2.0,定容至25 mL。將胃蛋白酶溶于pH2.0的磷酸鹽緩沖溶液中,分別按照酶與底物比(E/S)1/3(以1 g乳清濃縮蛋白質計,添加胰蛋白酶59660.7 U,胃蛋白酶17998.2 U)和1/30的比例加入蛋白酶(以1 g乳清濃縮蛋白質計,添加胰蛋白酶5966.07 U,胃蛋白酶1799.82 U),水浴(37 ℃,100 r/min)消化,反應1 h。反應結束后放入85 ℃水浴鍋中滅酶15 min。利用pH-state法測定水解度。水解度DH(%)按下式計算:

其中V是消耗HCL的體積,α是α-氨基酸的解離度,MP是蛋白質量(g),htot是溶質所含的肽鍵數(shù)(meqv/g protein),N是HCL的濃度,本實驗中是0.05 mol/L,本實驗中α為0.44,htot是8.8[11]。

胰蛋白酶酶解反應:10 mL 2 wt %的蛋白溶液,用1 mol/L NaOH調節(jié)pH至7.0,定容至25 mL。將胰蛋白酶溶于pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液中,分別按照酶與底物比(E/S)1/3和1/30的比例加入蛋白酶,水浴(37 ℃,100 r/min)消化,反應2 h。反應結束后放入85 ℃水浴鍋中酶活15 min。利用pH-state法測定水解度。

1.2.6統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)采用Oringin8.0進行作圖和Statistix8.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行ANOVA進行方差分析。數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示(n=3)。

2　結果與分析

2.1表面疏水性

在pH2.0和pH6.5兩種條件下熱處理20 h,樣品的表面疏水性產生了較明顯的變化(圖1)。pH2.0的纖維聚合物表面疏水性顯著高于pH6.5條件下形成的聚合物的表面疏水性。隨著加熱時間的延長,pH2.0的纖維聚合物的表面疏水性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,并且加熱5 h時,表面疏水性最大,增加幅度為0 h的38%。與pH2.0的纖維聚合物相比,pH6.5常規(guī)聚合物的表面疏水性在整個熱處理過程中變化不大,加熱5 h后表面疏水性最強,并且表面疏水性的增加幅度僅為0 h的11.98%。并且常規(guī)聚合物在加熱5 h后表面疏水性的提高量僅為納米纖維聚合物表面疏水性提高量的24.89%。這種差異可能是因為表面疏水性是纖維形成的主要作用力[12-13],并且在pH2.0條件下,蛋白質所帶電荷量較大,產生較大分子間斥力,致使疏水氨基酸暴露程度加大[14]。

圖1　不同乳清濃縮蛋白聚合物熱處理 過程中表面疏水性的變化Fig.1　The surface hydrophobicities(S0)of WPC at different pH for heating various times注:a～g不同表示同一樣品不同加熱時間差異顯著;A,B 不同表示同一加熱時間不同樣品差異顯著,圖2～圖5同。

2.2游離巰基

由圖2中的結果可知,纖維聚合物在整個形成過程中游離巰基的降低程度明顯低于常規(guī)聚合物。pH2.0條件下的WPC在加熱至20 h時游離巰基含量較0 h的降低了22.2%;pH6.5條件下的WPC在加熱至20 h時游離巰基含量較 0 h的降低了57.65%,其中在加熱至1 h時,游離巰基由最初的21.11 μmoL/L降至12.70 μmoL/L。與pH2.0的纖維聚合物相比,pH6.5常規(guī)聚合物的游離巰基的降低幅度是纖維聚合物的2.60倍。從以上結果可知,在pH6.5 WPC發(fā)生常規(guī)聚合時,乳清濃縮蛋白主要通過共價的二硫鍵形成發(fā)生聚合,然而,在pH2.0 WPC形成纖維聚合時,二硫鍵作用是微弱的[7]。

圖2　不同乳清濃縮蛋白聚合物 熱處理過程中游離巰基的變化Fig.2　The content of free sulfhydryl group(-SH) for WPC at different pH during various times

2.3濁度

在pH2.0和pH6.5兩種條件下熱處理20 h,隨著加熱時間的延長,樣品的濁度產生了較明顯的變化(見圖3)。pH2.0的纖維聚合物濁度顯著低于pH6.5條件下形成的聚合物的濁度。pH2.0的纖維聚合物在熱處理過程中濁度呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢,并濁度增幅不明顯,僅為0 h的1.05倍,而常規(guī)聚合物(pH6.5)的濁度值呈明顯增大趨勢,加熱20 h較未加熱時的濁度增大了19.50倍。與加熱20 h的pH2.0的纖維聚合物相比,加熱20 h后的pH6.5常規(guī)聚合物的的濁度是纖維聚合物的11.52倍。產生這種差異可能是因為樣品在pH6.5條件下長時間加熱樣品形成較大團簇狀聚合物,而在低pH、長時間加熱時,球蛋白首先水解為小肽,繼而聚合為細絲狀的半柔性纖維所致[7]。此結果也可能表明乳清濃縮蛋白在pH2.0形成的纖維聚合速率較常規(guī)聚合物的速率慢。

圖3　不同乳清濃縮蛋白聚合物熱處理過程中濁度的變化Fig.3　The turbidity of WPC at different heating times

2.4WPC納米纖維體外消化能力的比較

與pH6.5的常規(guī)聚合物相比,pH2.0的纖維聚合物具有較高的表面疏水性,游離巰基含量較高,濁度小的特點。WPC纖維聚合物不同于常規(guī)聚合物的結構特性,可能導致其體外消化性能也存在很大不同。

圖4　不同胃蛋白酶濃度對乳清濃縮蛋白聚合物水解度的影響Fig.4　The effect of pepsin and trypsin concentration on the hydrolysis degree of WPC for heating various times注:a:胃蛋白酶 E/S=1/30;b:胃蛋白酶E/S=1/3;c:胰蛋白酶E/S=1/30;d:胰蛋白酶E/S=1/3。

WPC納米纖維的形成需要在pH2.0的條件下持續(xù)加熱10 h以上[4-7],圖4比較了纖維的形成期和穩(wěn)定期的酶解能力,從結果可以看出,在酶濃度(1/30)較低的條件下,WPC納米纖維聚合物的體外消化能力明顯優(yōu)于常規(guī)WPC聚合物,熱處理10 h形成納米纖維后的體外消化能力分別是WPC常規(guī)聚合物的1.41倍(胃蛋白酶)和2.09倍(胰蛋白酶)。產生這種結果的原因可能與這兩種聚合物的結構特性有關,從濁度的結果可以看出,WPC纖維和常規(guī)聚合物的結構存在很大不同(圖3),纖維結構中的WPC蛋白質分子充分展開,疏水氨基酸暴露,表面疏水性增強(圖1),更利于酶的水解;相反,常規(guī)聚合物的團簇狀結構,由于蛋白質分子之間存在較多的二硫鍵,結構相對更緊實,不利于酶的水解。但是,隨著酶濃度的增加(E/S為1/3),WPC納米纖維聚合物的體外消化能力并沒有很大提高,從圖5的結果可以看出,對胃蛋白酶而言,熱處理1 h常規(guī)WPC聚合物水解度提升最大,其他增加幅度不大,可能是因為胃蛋白酶對蛋白組分的消化情形與其空間結構緊密相關[15],而纖維在1 h時水解度最大可能是因為,對比于酸水解而言,胃蛋白酶更易攻擊具有較高表面疏水性氨基酸和芳香族氨基酸殘基[16];并且纖維形成過程中,屬于先水解再聚合的過程,在1 h處距離纖維的成核期較近,1 h處水解明顯,蛋白質的空間結構改變,暴露出胃蛋白酶酶切位點;而胰蛋白酶的水解結果卻發(fā)生了明顯的變化,增加酶的添加量基本沒有導致WPC納米纖維水解度的增加,作為對照的WPC常規(guī)聚合物的水解度卻隨著酶量增加有大幅度提高,以熱處理10 h為例,水解度由原來低于納米纖維52.11%提高到高出36.01%。這種結果的產生可能與納米纖維獨特的聚合結構有關,β-折疊相互疊加的纖維結構可能是胰蛋白酶不能進一步水解的原因[17]。

表1　纖維不同形成時期水解度相對原始WPC水解度的提高量(%)Table 1　The increase quantity of WPC hydrolysis degree at different heating time(1,5,10 h)compared with native WPC under the same concentration of pepsin and trypsin concentration(%)

注:數(shù)據(jù)分析通過Statistix 8.1分析,同列字母不同者差異顯著(p<0.05);數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。

圖5　蛋白酶改變對纖維不同形成時期水解度的提高量Fig.5　The effect of protease concentration on the improvement percentage of degree hydrolysis of WPC during heating.注:蛋白酶改變指E/S從1/30提高到1/3。

2.5纖維不同形成時期水解能力的比較

纖維的形成主要分為3個時期:成核期(0～2 h)、增長期(2～5 h)和穩(wěn)定期(5～10 h)[18,7]。3個不同時期WPC纖維聚合物的水解能力也有很大不同,從表中的結果可以看出,與0 h未加熱的天然WPC的水解能力相比,胃蛋白酶和胰蛋白酶水解能力存在很大不同。對胃蛋白酶而言,成核期(1 h)的水解能力最強,生長期和穩(wěn)定期水解能力降低,說明纖維在形成初期有利于胃蛋白酶的快速水解,但是,隨著纖維結構的形成則不利于胃蛋白酶的水解;對胰蛋白酶而言,穩(wěn)定期的水解能力最強,而為具備纖維結構的成核期則不利于胰蛋白酶水解,也就是說穩(wěn)定期更適合胰蛋白酶水解。

3　結論

WPC納米纖維聚合物具有較高的表面疏水性、游離巰基以及濁度小等特點。在酶濃度相對較低的條件下,相比常規(guī)WPC聚合物,納米纖維聚合結構更適合胃蛋白酶和胰蛋白酶的快速水解,但是,增加酶濃度導致的水解度提高幅度遠不如WPC常規(guī)聚合物,尤其對胰蛋白酶而言,幾乎沒有任何提高。對于WPC納米纖維聚合物形成的3個時期而言,成核期有利于胃蛋白酶的水解,穩(wěn)定期有利于胰蛋白酶的水解。

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Digestion properties of WPC Namo-fibril aggregatesinvitro

CHENG Wen1,XU Hong-hua1,*,DONG Shi-rong1,XIA Xing-hao2,TAN Jun-yan1,ZHANG Yan-jie3

(1.Department of Food Quality & Safety,College of Food,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Heilongjiang Dairy Industry Technical Development Center,Northeast Agricultural Univesity,Harbin 150000,China;3.Shanghai Chen Guan Co.,Ltd. Shanghai 201401,China)

In order to study the properties ofinvitrodigestion of namo-fibril aggregates,the digestion of namo-fibril aggregates and normal aggregates for pepsin and trypsininvitrowas investigated in this paper,and the effect of heating time on the digestion of them were also discussed. The results showed that the surface hydrophobicity and the contents of the free sulfhydyl group of namo-fibrils aggregates were higher than those of the normal WPC aggregates. Compared with normal WPC aggregates,the namo-fibril aggregates had higher degree of hydrolysis at low enzyme concentrate(E/S 1/30). However,the improvement degree of hydrolysis was much less than normal WPC aggregates,especially,no any change was observed with the increase content of the trypsin,and the degree of hydrolysis of the namo-fibrils aggregates was lower than the degree of hydrolysis of normal aggregates,but for the pepsin,the degree of hydrolysis of the namo-fibrils aggregate was higher than that of normal aggregates as the increasing of the amount of enzyme. Nucleation of namo-fibrils was good for hydrolysis of pepsin,while termination of namo-fibrils was good for trypsin hydrolysis during WPC fibril formation three steps. It can be concluded:invitrodigestion process,the namo-fibril aggregates were more easily hydrolyzed.

Whey protein concentrate;fibril;aggregation;digestion;heating

2016-03-03

程聞(1989-)，女，碩士，研究方向：食品科學，E-mail:15114669364@163.com。

徐紅華(1969-)，女，博士，教授，研究方向：食品科學，E-mail:xhh3161@126.com。

國家自然基金項目(31471682)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)15-0116-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.014