武奔月,陳鋒澤,張麗娟,閆靜芳,田有秋,謝廣杰,王昱灃

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

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硫磺菌凝集素的提取工藝研究

武奔月,陳鋒澤,張麗娟,閆靜芳,田有秋,謝廣杰,王昱灃*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

硫磺菌凝集素是一種從硫磺菌子實(shí)體中提取的、能凝集紅細(xì)胞的蛋白質(zhì)。本文以硫磺菌為原料,采用磷酸緩沖溶液浸提,對(duì)氯化鈉濃度、液料比、提取溫度、提取時(shí)間、浸提pH五個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),并設(shè)計(jì)四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn),以研究硫磺菌凝集素的最佳提取工藝。研究結(jié)果表明:氯化鈉濃度為0 mol/L,液料比為30∶1 mL/g,提取溫度為15 ℃,提取時(shí)間為10 h,浸提pH為7.5的條件下,硫磺菌凝集素的凝集活性最高,達(dá)到0.5870,蛋白得率為0.576%。

硫磺菌,凝集素,提取,凝集活性,蛋白濃度

硫磺菌(Laetiporussulphureus(Fr.)Murrill)又稱硫磺多孔菌、硫色多孔菌、硫色絢孔菌、硫色干酪菌、雞冠菌、鮭魚菌[1],隸屬真菌門、擔(dān)子菌亞門、擔(dān)子菌綱、非褶菌目、多孔菌科、硫磺菌屬,是一種食藥兼用的大型真菌[2]。硫磺菌子實(shí)體含多糖、凝集素、齒孔酸、甜菜堿和葫蘆巴堿等多種有效成分。其中食用菌多糖的研究體系已非常成熟,但凝集素的研究方法有待進(jìn)一步完善。凝集素是一種具有凝集細(xì)胞或沉降復(fù)合糖質(zhì)作用的非免疫起源的蛋白質(zhì)或糖蛋白,它具有依靠結(jié)合的糖分子與外源細(xì)胞相互識(shí)別,抗病毒,免疫調(diào)節(jié),促進(jìn)有絲分裂、細(xì)胞凝集,抑制腫瘤生長(zhǎng)等多種生物學(xué)功能[3-4]。目前國(guó)內(nèi)外研究者提取的食用菌凝集素,主要有黑木耳、蒙古口蘑[5]、白樺茸和草菇[6]等,其提取研究?jī)?nèi)容主要是對(duì)提取劑、液料比、提取時(shí)間等影響因素的選擇,并通過正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化[7-8]。

國(guó)內(nèi)對(duì)硫磺菌的研究較多的是菌種的栽培[9-11]、菌絲體培養(yǎng)條件優(yōu)化[13-15]和生理活性[16-20],而有關(guān)硫磺菌凝集素提取分離方面迄今為止未見報(bào)道。國(guó)外僅有Konska G[21]等對(duì)硫磺菌凝集素進(jìn)行了初步分離純化,但對(duì)凝集素提取工藝、生物特性研究很少。

本課題選取硫磺菌為研究對(duì)象,采用鹽提法提取硫磺菌子實(shí)體凝集素,并對(duì)影響提取凝集素的工藝參數(shù)如氯化鈉濃度、提取溫度、提取時(shí)間、液料比、浸提pH進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)優(yōu)化,篩選出最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件,以期得到凝集活性較高的凝集素。本研究不僅獲得凝集素的新來源,而且為硫磺菌的資源開發(fā)、合理利用和保護(hù)提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

硫磺菌吉林省長(zhǎng)白山保護(hù)開發(fā)區(qū)池北森林珍寶收購(gòu)站;兔子(普通級(jí),新西蘭雄兔)南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng);蒸餾水;無水乙醇、氯化鈉、磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、二水合檸檬酸三鈉、磷酸等試劑均為分析純，南京化學(xué)試劑有限公司;5 mL無菌注射器常州市回春醫(yī)療器材有限公司;G-250考馬斯亮藍(lán)北京索萊寶科技有限公司;

RHP-400型打粉機(jī)浙江永康市榮浩工貿(mào)有限公司;CP124C先行者精密電子天平奧豪斯儀器(上海)有限公司制造;DK-8D型電熱恒溫水槽上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;5804R冷凍離心機(jī)基因有限公司;STARTER3100實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)奧豪斯儀器(上海)有限公司制造;96孔V型血凝板美堰市榮飛器械廠;ZQTY-70臺(tái)式全溫振蕩培養(yǎng)箱上海知楚儀器有限公司;AXLC1850-V型超純水機(jī)阿修羅科技發(fā)展有限公司;SHZ-D型真空泵鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;VM-01U渦旋混勻器上海珂淮儀器有限公司;SB-5200DT超聲波清洗機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司;EU-2600R紫外可見分光光度計(jì)上海昂拉儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1兔血紅細(xì)胞懸液配制用一次性注射器對(duì)兔子進(jìn)行耳緣靜脈取血,并按V(血)∶V(抗凝劑)=9∶1的量將兩者混合均勻,其中抗凝劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.8%的二水合檸檬酸鈉?；靹蚝蠹尤脒m量的0.9%的生理鹽水,1500 r/min下離心5 min,重復(fù)洗滌4～5次,直至上清液透明,去上清,最終用0.9%的生理鹽水配制成2.0%(V/V)紅細(xì)胞懸液,置4 ℃冰箱暫存[22-23]。

1.2.2硫磺菌凝集素的提取稱取經(jīng)打粉機(jī)粉碎的硫磺菌1.00 g,按一定的液料比(0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液:硫磺菌)浸泡于一定pH的磷酸鹽緩沖液(PBS)內(nèi),再加入氯化鈉,使其達(dá)到一定的氯化鈉濃度。然后,在一定的溫度下浸提一定的時(shí)間。反應(yīng)液經(jīng)9000 r/min冷凍離心10 min,棄沉淀,保留上清液待用,得到硫磺菌凝集素粗提取液。

1.2.3硫磺菌凝集素的凝集活性測(cè)定凝血效價(jià)檢測(cè):凝血效價(jià)檢測(cè)參照孫冊(cè)等人的方法[24],取96孔V血凝板,每個(gè)孔加入50 μL生理鹽水,然后在第1行各孔分別加入樣品液50 μL,每列依次倍比稀釋,每種樣品做3個(gè)重復(fù),對(duì)照為不加樣品的生理鹽水,最后分別加入2.0%血細(xì)胞懸液50 μL,靜置1～2 h,觀察結(jié)果?？椎子醒虺恋沓牲c(diǎn)狀的為無凝集反應(yīng),孔中血球凝集成片懸浮的為有凝集反應(yīng)。以能產(chǎn)生可見的凝集的凝集素最大稀釋度的倒數(shù)作為此凝集素的效價(jià)[25]。

通過對(duì)凝集效價(jià)定性數(shù)據(jù)賦值,其加權(quán)平均數(shù)作為量化凝集活性(agglutinating activity,Aa)，根據(jù)凝集效價(jià)賦值表，則凝集活性(Aa)量化公式如下:

Aa=∑AWi,i=1,2,3,…,n

式中:A為待測(cè)液凝集反應(yīng)賦值;Wi為凝集活性權(quán)重,Wi=2-i;n為倍比稀釋次數(shù)。

1.2.4蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[26],以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。

樣品蛋白含量的測(cè)定:將不同提取液稀釋到相同的體積,以蛋白濃度來反映蛋白質(zhì)含量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線A=5.7596C+0.0191(R2=0.9935),得到蛋白濃度。

蛋白得率=(蛋白濃度×提取液體積)/子實(shí)體原料重量×100。

1.2.5單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.5.1氯化鈉濃度氯化鈉濃度設(shè)置0、0.25、0.50、0.75和1.00 mol/L五個(gè)梯度,液料比、提取溫度、提取時(shí)間及浸提pH分別是30∶1 mL/g、4 ℃、10 h和7.5。

1.2.5.2液料比液料比設(shè)置10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g五個(gè)梯度,氯化鈉濃度、提取溫度、提取時(shí)間及浸提pH分別是0、4 ℃、10 h和7.5。

1.2.5.3提取溫度提取溫度設(shè)置4、15、25、35和45 ℃五個(gè)梯度,氯化鈉濃度、液料比、提取時(shí)間及浸提pH分別是0、30∶1 mL/g、10 h和7.5。

1.2.5.4提取時(shí)間提取時(shí)間設(shè)置5、10、15、20和25 h五個(gè)梯度,氯化鈉濃度、液料比、提取溫度及浸提pH分別是0、30∶1 mL/g、4 ℃和7.5。

1.2.5.5浸提pH浸提pH設(shè)置6.0、6.5、7.0、7.5和8.0五個(gè)梯度,氯化鈉濃度、液料比、提取溫度及提取時(shí)間分別是0、30∶1、4 ℃和10 h。

1.2.6正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以氯化鈉濃度、液料比、提取溫度和提取時(shí)間為因素,每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平,以凝集活性、蛋白濃度為考察指標(biāo),設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn),優(yōu)化硫磺菌凝集素提取工藝條件,因素水平見表1。

表1　正交因素水平表Table 1　Factors and levels of orthogonal test

1.3數(shù)據(jù)處理

本文實(shí)驗(yàn)均為三次重復(fù),采用Orgin8.5作圖、單因素方差分析(one-way ANOVA)和正交實(shí)驗(yàn)助手Ⅱ進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,顯著水平p<0.05。

2　結(jié)果與討論

2.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1氯化鈉濃度對(duì)凝集活性、蛋白濃度的影響氯化鈉濃度對(duì)凝集活性的影響如圖1所示。當(dāng)NaCl濃度在0～0.50 mol/L時(shí),凝集活性變化較小,差異不顯著(p>0.05)。但當(dāng)NaCl大于0.50 mol/L時(shí),隨著NaCl濃度的升高,凝集活性急劇下降。在0.75～1.00 mol/L時(shí),凝集活性變化不明顯,差異不顯著(p>0.05)。而NaCl濃度為0、0.25、0.50 mol/L與0.75、1.00 mol/L之間凝集活性差異顯著(p<0.05)。

氯化鈉濃度對(duì)蛋白濃度的影響如圖1所示。當(dāng)氯化鈉濃度在0～0.50 mol/L時(shí),蛋白濃度急劇下降,差異顯著(p<0.05)。當(dāng)NaCl濃度為0.75 mol/L時(shí),蛋白濃度有所上升,可能由于鹽溶蛋白的溶出。但當(dāng)NaCl濃度達(dá)到1 mol/L時(shí),蛋白濃度又有所下降。經(jīng)顯著性分析可知,NaCl濃度為0.25 mol/L與0.75 mol/L、0.5 mol/L與1.00 mol/L蛋白濃度差異不顯著(p>0.05)。

圖1　氯化鈉濃度對(duì)凝集活性、蛋白濃度的影響Fig.1　Effects of the concentration of NaCl on the agglutination activity and protein concentration 注:圖1中不同小寫字母表示差異顯著性(p<0.05), 具有相同字母的差異不顯著(p>0.05),圖2～圖3同。

因此,綜合凝集活性與蛋白濃度兩種指標(biāo),NaCl濃度選擇0.25 mol/L左右為宜。孫東等[27]在研究影響桑葉凝集素提取率的氯化鈉濃度時(shí)發(fā)現(xiàn),當(dāng)NaCl濃度在0～0.25 mol/L時(shí),桑葉凝集素提取率變化較小,但在NaCl濃度大于0.25 mol/L時(shí),提取率急劇下降,NaCl濃度選擇在0～0.25 mol/L。在凝集素提取時(shí)盡量選擇較低濃度的NaCl,否則會(huì)影響凝集素的溶出,使得提取不充分。

2.1.2液料比對(duì)凝集活性、蛋白濃度的影響液料比對(duì)凝集活性的影響如圖2所示。因凝血活性計(jì)算時(shí)采取倍比稀釋的辦法,原始提取的體積必將影響凝血活性,故應(yīng)將得到的不同體積的提取液通過稀釋或冷凍濃縮的辦法調(diào)至同一個(gè)體積后再檢測(cè)不同液料比對(duì)凝集活性的影響。當(dāng)液料比在10∶1～30∶1時(shí),凝集活性呈上升趨勢(shì),在30∶1時(shí)凝集活性為0.5771,達(dá)到最大。當(dāng)液料比在30∶1～50∶1時(shí),凝集活性變化較平緩。料液比為10∶1與30∶1、40∶1之間凝集活性差異顯著(p<0.05),20∶1、30∶1、40∶1與50∶1四者之間差異不顯著(p>0.05),10∶1、20∶1與50∶1三者之間差異不顯著(p>0.05)。

液料比對(duì)蛋白濃度的影響結(jié)果見圖2。當(dāng)液料比在10∶1～40∶1時(shí),蛋白濃度呈上升趨勢(shì)。在40∶1時(shí),蛋白濃度為0.12 mg/mL,達(dá)到最大。當(dāng)液料比50∶1時(shí),蛋白濃度有所下降。液料比為10∶1、20∶1與30∶1三者之間蛋白濃度差異顯著(p<0.05),30∶1與40∶1、50∶1之間差異不顯著(p>0.05),40∶1與50∶1兩者之間差異顯著(p<0.05)。

圖2　液料比對(duì)凝集活性、蛋白濃度的影響Fig.2　Effects of different liquid-solid ratio on the agglutination activity and protein concentration

結(jié)合凝集活性和蛋白濃度可知,液料比在30∶1時(shí),凝集活性達(dá)到最大,且此時(shí)的蛋白濃度與液料比在40∶1處的最大值無顯著差異。因此,液料比選擇在30∶1左右。趙則海等[28]在研究四棱豆葉中凝集素的提取及其凝集活性時(shí)發(fā)現(xiàn),液料比30∶1處理對(duì)四棱豆葉蛋白質(zhì)提取效果最好,與本文液料比一致。液料比低會(huì)導(dǎo)致提取率低和提取液黏稠,液料比高有利于目標(biāo)物的提取,但會(huì)導(dǎo)致提取液體積較大、目標(biāo)物濃度太低,不利于后期的處理。因此,選擇一個(gè)合理的液料比具有很重要的意義。

2.1.3提取溫度對(duì)凝集活性、蛋白濃度的影響提取溫度對(duì)凝集活性的影響如圖3所示。當(dāng)溫度在4～25 ℃時(shí),凝集活性隨著溫度的升高而上升,25 ℃時(shí)達(dá)到峰值,即0.5913。當(dāng)溫度在25～45 ℃時(shí),隨著溫度升高,凝集活性下降。提取溫度為4 ℃與15、25、35、45 ℃差異顯著(p<0.05),25 ℃與15、35、45 ℃差異顯著(p<0.05),15、35 ℃與45 ℃三者之間差異不顯著(p>0.05)。

提取溫度對(duì)蛋白濃度的影響結(jié)果也見圖3。當(dāng)溫度在4～25 ℃時(shí),蛋白濃度逐漸上升,25 ℃時(shí),達(dá)到最大,即0.43 mg/mL,差異顯著(p<0.05)。當(dāng)溫度在25～45 ℃時(shí),蛋白濃度變化趨于平緩,差異不顯著(p>0.05)。

圖3　提取溫度對(duì)凝集活性、蛋白濃度的影響Fig.3　Effects of extraction temperature on the agglutination activity and protein concentration

當(dāng)提取溫度為25 ℃時(shí),凝集活性、蛋白濃度都達(dá)到最大。因此,選擇在25 ℃左右。鄧鄭東等[6]研究影響黑木耳凝集素提取的溫度時(shí)發(fā)現(xiàn),在低溫條件下,黑木耳的凝集活性隨著提取溫度的上升而增加,在30 ℃時(shí),達(dá)到最大。超過30 ℃時(shí),隨著溫度的上升,凝集活性明顯下降。提取溫度過低不利于凝集素的溶出,但提取溫度過高可能導(dǎo)致凝集素變性失活,凝集活性下降。

2.1.4提取時(shí)間對(duì)凝集活性的影響提取時(shí)間對(duì)凝集活性的影響如圖4所示。當(dāng)提取時(shí)間在5～15 h時(shí),凝集活性緩慢上升,15 h時(shí)凝集活性為0.5935,達(dá)到最大。當(dāng)提取時(shí)間在15～25 h時(shí),隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),凝集活性緩慢下降。提取時(shí)間為15 h與5、10、20、25 h之間凝集活性差異顯著(p<0.05),5、10、20與25 h四者之間差異不顯著(p>0.05)。

提取時(shí)間對(duì)蛋白濃度的影響結(jié)果見圖4。當(dāng)提取時(shí)間在5～15 h時(shí),蛋白濃度不斷上升。15 h時(shí),蛋白濃度為0.33 mg/mL,達(dá)到最大。當(dāng)提取時(shí)間在15～25 h時(shí),蛋白濃度急劇下降,可能由于提取時(shí)間較長(zhǎng),非蛋白成分的溶出,使得蛋白濃度下降。提取時(shí)間為5、20與25 h三者之間蛋白濃度差異不顯著(p>0.05),10與15 h兩者之間蛋白濃度差異不顯著(p>0.05),5、20、25與10、15 h之間蛋白濃度差異顯著(p<0.05)。

圖4　提取時(shí)間對(duì)凝集活性、蛋白濃度的影響Fig.4　Effects of extraction time on the agglutination activity and protein concentration

綜合考慮凝集活性以及蛋白濃度,提取時(shí)間為15 ℃時(shí),凝集活性、蛋白濃度都達(dá)到最大,故選擇在15 h左右。鄧鄭東等[6]研究影響黑木耳凝集素提取的時(shí)間時(shí)發(fā)現(xiàn),提取時(shí)間在12 h以內(nèi),黑木耳凝集素的凝集活性隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,12 h時(shí)達(dá)到峰值;此后,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),凝集素的凝集活性緩慢下降。提取時(shí)間過短不利于凝集素的溶出,使得凝集素得率較低;提取時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致其他雜質(zhì)的析出,給后期的分離純化帶來困難。

2.1.5浸提pH對(duì)凝集活性的影響浸提pH對(duì)凝集活性的影響如圖5所示。環(huán)境pH直接影響目標(biāo)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性及構(gòu)象,從而影響其活性。在酸性條件下,凝集活性隨著提取緩沖液pH的增大而逐漸升高,差異不顯著(p>0.05)。在pH7.5時(shí),凝集活性為0.5869,但在7.0～8.0之間變化不明顯,差異不顯著(p>0.05)。pH為6.0、6.5與7.0、7.5、8.0之間凝集活性差異顯著(p<0.05)。

浸提pH對(duì)蛋白濃度的影響如圖5所示,浸提pH對(duì)蛋白濃度存在著影響。當(dāng)pH在6.0～7.5時(shí),蛋白濃度不斷上升。pH7.5時(shí),蛋白濃度達(dá)到最大,即0.25 mg/mL,差異顯著(p<0.05)。但pH在7.5～8.0時(shí),蛋白濃度緩慢下降,差異不顯著(p>0.05)。

圖5　浸提pH對(duì)凝集活性、蛋白濃度的影響Fig.1　Effects of extraction pH on the agglutination activity and protein concentration

在酸性條件下,可能不利于蛋白的溶出,凝集活性也不高。但pH在7.0～8.0時(shí)凝集活性比較穩(wěn)定,且pH為7.5時(shí),蛋白濃度達(dá)到最大,故pH應(yīng)選擇在7.5左右。孫東等[27]在研究影響桑葉凝集素提取率的pH時(shí)發(fā)現(xiàn),桑葉凝集素的提取率隨著提取緩沖液pH的增大而逐漸升高。在pH8時(shí),桑葉凝集素提取率最大,此結(jié)果與本文的結(jié)果吻合。

2.2正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝

2.2.1凝集素提取因素選取根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取氯化鈉濃度、液料比、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素,以硫磺菌凝集素凝集活性為指標(biāo),進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn),對(duì)硫磺菌凝集素提取的最佳工藝進(jìn)行研究。

2.2.2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和極差分析見表2,方差分析結(jié)果見表3。由表2中的R值可知,影響凝集活性的提取因素的主要順序?yàn)?提取時(shí)間>提取溫度>液料比>氯化鈉濃度。影響蛋白濃度的提取因素的主要順序?yàn)?氯化鈉濃度>提取時(shí)間>液料比>提取溫度。

由表3可知,氯化鈉濃度、液料比、提取溫度對(duì)硫磺菌凝集素的凝集活性、蛋白濃度無顯著差異,而提取時(shí)間對(duì)凝集活性有顯著差異,對(duì)蛋白濃度無顯著差異。由k值大小可知,以凝集活性為指標(biāo),硫磺菌凝集素提取的最佳工藝組合是A1B2C1D1;以蛋白濃度為指標(biāo),硫磺菌凝集素提取的最佳工藝組合是A1B2C2D2。因提取時(shí)間對(duì)凝集活性有顯著影響,四種提取因素均對(duì)蛋白濃度無顯著差異,故確定硫磺菌凝集素的最佳提取工藝為A1B2C1D1,而正交實(shí)驗(yàn)組合中A1B2C2D2,無論凝集活性,還是蛋白濃度都比較高。因此,將A1B2C1D1和A1B2C2D2做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

表3　方差分析結(jié)果Table 3　Variance analysis

注:*差異顯著(p<0.05);F0.01(2,2)=99.00;F0.05(2,2)=19.00。

表2　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　Result of the orthogonal experiment

2.2.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)為驗(yàn)證最佳提取工藝組合的合理性和可靠性,對(duì)A1B2C1D1和A1B2C2D2組合做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),其結(jié)果如表4所示:A1B2C1D1組合下,硫磺菌凝集素的凝集素活性為0.5870,蛋白濃度為0.144 mg/mL,蛋白得率為0.576%;A1B2C2D2組合時(shí),其凝集活性為0.5854,蛋白濃度為0.155 mg/mL,蛋白得率為0.620%。又由表3可知,四種提取因素對(duì)蛋白濃度無顯著差異影響,而提取時(shí)間卻對(duì)凝集活性有顯著影響。因此,綜合考慮,以凝集活性為主要指標(biāo),確定最佳組合最終為A1B2C1D1。且該組合蛋白得率與猴頭菇凝集素、槲寄生凝集素得率相比,結(jié)果合理[29-30]。證明該提取工藝組合效果較好、可靠,適合于硫磺菌凝集素的提取。

表4　驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 4　Results of verification experiment(n=3)

3　結(jié)論

凝集素的提取效果受多種條件的影響,通過單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)硫磺菌凝集素的提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化研究,綜合考慮了氯化鈉濃度、液料比、提取溫度、提取時(shí)間、浸提pH等因素對(duì)凝集活性、蛋白濃度的影響。本研究得出結(jié)論如下:影響凝集活性的提取因素的主要順序?yàn)?提取時(shí)間>提取溫度>液料比>氯化鈉濃度;影響蛋白濃度的提取因素的主要順序?yàn)?氯化鈉濃度>提取時(shí)間>液料比>提取溫度;最佳提取工藝為:氯化鈉濃度為0 mol/L,液料比為30∶1 mL/g,提取溫度為15 ℃,提取時(shí)間為10 h,浸提pH為7.5。在此條件下,硫磺菌凝集素的凝集活性最高,達(dá)到0.5870,蛋白得率為0.576%。通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出的硫磺菌凝集素提取條件切實(shí)可靠,為其進(jìn)一步純化及工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

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Study on extraction of lectin fromLaetiporussulphureus

WU Ben-yue,CHEN Feng-ze,ZHANG Li-juan,YAN Jing-fang,TIAN You-qiu,XIE Guang-jie,WANG Yu-feng*

(College of Food Science and Technology,Nanjing Angricultural Univeisity,Nanjing 210095,China)

Lectin fromLaetiporussulphureuswas a kind of protein,which could be extracted fromLaetiporussulphureusfruiting bodies and could agglutinate red blood cell. In the paper,theLaetiporussulphureuswas used as a raw material with extraction phosphate buffer. On the basis of single factor experiments,such as sodium chloride concentration,liquid-solid ratio,extraction temperature,extraction time,extraction pH value,four factors and three levels orthogonal experiment was designed to study lectins optimum extraction of theLaetiporussulphureus. The results showed that the optimum conditions of extraction technology were sodium chloride concentrations of 0 mol/L,liquid-solid ratio of 30∶1 mL/g,extraction temperature of 15 ℃,the extraction time of 10 h,the extraction pH of 7.5. Under the conditions of the extraction,agglutination activity ofLaetiporussulphureuslectin reached 0.5870 and the extraction rate of protein reached 0.576%.

Laetiporussulphureus;lectin;extraction;agglutination activity;protein concentration

2015-12-29

武奔月(1990-),女,在讀碩士研究生,主要從事食品科學(xué)與工程方面的研究,E-mail:2014108052@njau.edu.cn。

王昱灃(1976-),男,博士,副教授,主要從事生物工程和食品科學(xué)方面的研究，E-mail:joywangyu@sina.com。

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生工作站和江蘇省研究生工作站項(xiàng)目;江蘇省科技計(jì)劃項(xiàng)目(蘇北科技專項(xiàng),BN2015071)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)14-0277-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.047