程稚玲,甄守艷,姚　薇,王鈺慧,韓克光,霍乃蕊,*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山西晉中 030801;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山西晉中 030801)

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風(fēng)味蛋白酶水解羊骨粉制備膠原多肽的工藝研究

程稚玲1,甄守艷1,姚薇1,王鈺慧1,韓克光2,霍乃蕊2,*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山西晉中 030801;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山西晉中 030801)

利用風(fēng)味蛋白酶水解羊骨粉,并對(duì)4個(gè)水解指標(biāo)做相關(guān)性分析。各指標(biāo)之間均顯著相關(guān),與水解度的相關(guān)性依次為短肽得率(0.926)>多肽生成量(0.805)>氨基酸態(tài)氮(0.680)。響應(yīng)面優(yōu)化羊骨粉水解工藝時(shí),以水解度為指標(biāo),得出最優(yōu)水解條件,即料水比為3∶25(W/V)、水解溫度為55 ℃、水解時(shí)間為315 min、加酶量為3.48%(E/S)、pH為7.5,在此條件下水解度為20.38%,與預(yù)測(cè)值(20.72%)相比,相對(duì)誤差較小,響應(yīng)面法所得的優(yōu)化工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠,具有實(shí)用價(jià)值。

羊骨,風(fēng)味蛋白酶,水解度,膠原多肽

骨中鈣和磷相對(duì)含量較高且比例適合人體吸收[1],膠原蛋白是骨中含量最多的物質(zhì),可以促進(jìn)皮下細(xì)胞新陳代謝,延緩機(jī)體衰老[2]。目前人們對(duì)骨中有價(jià)值成分還未能充分利用,尚處于起步階段[3]。

酶解是目前生產(chǎn)活性肽的主要方法,具有效率高、反應(yīng)條件溫和、幾乎不破壞氨基酸結(jié)構(gòu)、安全無污染等優(yōu)點(diǎn)[4]。實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶是對(duì)羊骨粉水解效果最好的3種酶,優(yōu)于木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶。

風(fēng)味蛋白酶是一種微酸性或中性條件下能水解蛋白質(zhì)的蛋白酶,可脫除低水解度產(chǎn)物的苦味,改善水解物的風(fēng)味[5]。目前針對(duì)畜骨的水解多利用堿性蛋白酶。陳新峰[6]等以水解度為指標(biāo),用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化風(fēng)味蛋白酶水解豬皮提取膠原蛋白的工藝,但沒有考慮氨基酸態(tài)氮含量、多肽生成量、短肽得率與水解度之間的關(guān)系。本文以水解度、氨基酸態(tài)氮含量、多肽生成量和短肽得率為指標(biāo),分析它們之間的相關(guān)性,并以水解度為響應(yīng)值,通過響應(yīng)面法獲得回歸模型并優(yōu)化水解工藝,以期提高羊骨蛋白利用率,具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和廣闊的發(fā)展前景。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮羊骨購于山西太谷縣屠宰場(chǎng),實(shí)驗(yàn)室-20 ℃貯存;風(fēng)味蛋白酶(酶活≥20 U/mg)廠家:Solarbio;甲醛、三乙醇胺、鉻黑T、對(duì)苯二甲醛(OPA)、三氯乙酸、氫氧化鈉、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、福林酚均為分析純。

722G型可見分光光度計(jì)上海精密儀器有限公司;高速萬能粉碎機(jī)廣州雷邁機(jī)械;802型索式抽提器天津市玻璃儀器廠;Neofuge23R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)上海力申科學(xué)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1骨粉制備工藝流程羊骨121 ℃高壓蒸煮30 min→脫脂(室溫,無水乙醇脫脂24 h)→真空冷凍干燥(-25 ℃預(yù)凍,工作壓力85～95 Pa,升華溫度50～55 ℃)→粉碎→過80目篩→骨粉

1.2.2骨粉水解工藝羊骨粉→骨泥→殺菌(90 ℃,15 min)→調(diào)pH→加酶→酶解→滅酶→冷卻→離心(5000 r/min,15 min)→取上清液→指標(biāo)測(cè)定

1.2.4單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1料水比對(duì)羊骨粉水解效果的影響分別稱取4、6、8、10、12 g羊骨粉與100 mL的蒸餾水混合,pH6.5,酶添加量為4%,50 ℃酶解5 h后,高溫加熱滅酶15 min終止反應(yīng),5000 r/min離心15 min,取上清液測(cè)定水解度、氨基酸態(tài)氮含量、多肽生成量、短肽得率。

1.2.4.2pH對(duì)羊骨粉水酶解效果的影響在確定料水比1∶10的基礎(chǔ)上,依次調(diào)節(jié)pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,酶添加量為4%,50 ℃酶解5 h后,高溫加熱終止反應(yīng),離心,取上清液測(cè)定骨蛋白的水解度、氨基酸態(tài)氮含量、多肽生成量、短肽得率。

1.2.4.3溫度對(duì)羊骨粉水酶解效果的影響在確定料水比1∶10、pH7.5的基礎(chǔ)上,酶添加量為4%,依次調(diào)節(jié)水解溫度40、45、50、55 ℃,酶解5 h后,高溫加熱終止反應(yīng),離心,取上清液測(cè)定骨蛋白的水解度、氨基酸態(tài)氮含量、多肽生成量、短肽得率。

1.2.4.4酶添加量對(duì)羊骨粉水酶解效果的影響在確定料水比1∶10、pH7.5、溫度50 ℃的基礎(chǔ)上,依次調(diào)節(jié)酶添加量E/S為2%、3%、4%、5%,酶解5 h后,高溫加熱終止反應(yīng),離心,取上清液測(cè)定骨蛋白的水解度、氨基酸態(tài)氮含量、多肽生成量、短肽得率。

1.2.4.5水解時(shí)間對(duì)羊骨粉水酶解效果的影響在確定料水比1∶10、pH7.5、溫度50 ℃、酶添加量4%的基礎(chǔ)上,依次調(diào)節(jié)水解時(shí)間為3、4、5、6 h,高溫加熱終止反應(yīng),離心,取上清液測(cè)定骨蛋白的水解度、氨基酸態(tài)氮含量、多肽生成量、短肽得率。

1.2.5響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)在單因素的基礎(chǔ)上,以水解度為響應(yīng)值,運(yùn)用Design-Expert軟件,對(duì)水解條件進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1　Factors and levels of response surface experimental

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SigmaPlot 10軟件進(jìn)行單因素分析、采用IBM SPSS statistics v 21.0軟件對(duì)水解程度各指標(biāo)間相關(guān)性進(jìn)行分析、Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1料水比對(duì)骨粉水解指標(biāo)的影響由圖1可知,水解度、多肽生成量、短肽生成量、氨基酸態(tài)氮含量均隨料水比的增大呈先增大后降低的趨勢(shì),料水比為1∶10時(shí)達(dá)到最大值,之后隨著料水比的增大,呈緩慢下降趨勢(shì)。因?yàn)榈孜餄舛容^低的時(shí)候,反應(yīng)速度隨著底物濃度增大而增大,當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定值后,隨著產(chǎn)物濃度的升高,會(huì)抑制酶的活性,水解反應(yīng)逐步趨于平衡。所以實(shí)驗(yàn)選擇料水比1∶10。

圖1　料水比對(duì)骨粉水解指標(biāo)的影響Fig.1　Effect of the amount bone powder on the hydrolysis related indices

2.1.2pH對(duì)骨粉水解指標(biāo)的影響由圖2可知,水解度、多肽生成量、短肽生成量、氨基酸態(tài)氮含量均先隨著pH的增大而升高,在pH7.5的時(shí)候水解度達(dá)到最大,多肽生成量和短肽生成量在pH7的時(shí)候達(dá)到最大,隨后便開始出現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。隨著反應(yīng)的進(jìn)行,水解產(chǎn)物會(huì)改變體系的pH,pH的變化會(huì)影響酶的活性,當(dāng)pH升高至一定水平時(shí),酶的活性降低,酶解率也隨之降低。

圖2　pH對(duì)骨粉水解指標(biāo)的影響Fig.2　Effect of pH value on the hydrolysis related indices

2.1.3溫度對(duì)骨粉水解指標(biāo)的影響由圖3可知,不同的酶解溫度得到的水解度也不相同,50 ℃時(shí)水解度達(dá)到最高,水解度、多肽生成量、短肽生成量、氨基酸態(tài)氮含量隨溫度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)。在一定范圍內(nèi)隨溫度升高,反應(yīng)速度會(huì)加快,超過一定溫度后,會(huì)使蛋白酶活性降低甚至喪失活性,從而影響反應(yīng)速度。

圖3　溫度對(duì)骨粉水解指標(biāo)的影響Fig.3　Effect of temperature on the hydrolysis related indices

2.1.4加酶量對(duì)骨粉水解指標(biāo)的影響由圖4可知,在加酶量小于4%時(shí),隨著加酶量的增加,水解度隨著增加,當(dāng)加酶量到達(dá)4%時(shí),水解度的增加趨于平緩,這是由于隨著加酶量的增加,酶濃度抑制了酶解反應(yīng)的進(jìn)行。在水解度上升的同時(shí),多肽生成量、短肽生成量、氨基酸態(tài)氮含量也在不斷上升,從經(jīng)濟(jì)角度來看,選加酶量為4%較佳。

圖4　加酶量對(duì)骨粉水解指標(biāo)的影響Fig.4　Effect of the amount of enzyme added on the hydrolysis related indices

2.1.5時(shí)間對(duì)骨粉水解指標(biāo)的影響由圖5可知,5 h時(shí),水解度、多肽生成量、短肽生成量、氨基酸態(tài)氮均達(dá)到最大值,隨反應(yīng)的進(jìn)行有下降趨勢(shì)。這是因?yàn)槊傅拇呋俣葧?huì)受到產(chǎn)物的影響,反應(yīng)初期,產(chǎn)物的抑制作用小,隨著時(shí)間的延長,酶活力逐漸下降,游離的小肽和氨基酸增多,產(chǎn)物的抑制作用增加。因此選擇5 h為最佳酶解時(shí)間。

圖5　時(shí)間對(duì)骨粉水解指標(biāo)的影響Fig.5　Effect of time on the hydrolysis related indices

2.2各指標(biāo)相關(guān)性分析

蛋白質(zhì)水解過程的水解度(DH)、短肽得率、游離氨基酸態(tài)氮等參數(shù),是相互關(guān)聯(lián)的,它們分別從不同的方面反映了蛋白質(zhì)的水解度。隨著水解的進(jìn)行,蛋白質(zhì)肽鏈斷裂,游離氨基酸逐漸增多,即游離氨基中氮元素占總氮元素的比值不斷變化,因此選用水解度作為主要的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)[12]。本文采用IBM SPSS statistics v 21.0軟件對(duì)水解程度各指標(biāo)間相關(guān)性進(jìn)行分析,得出各指標(biāo)之間的相關(guān)性均極顯著(p<0.01),說明它們均可判斷水解程度。其中短肽得率和水解度之間的相關(guān)性最強(qiáng),r=0.926,因此可用這兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)水解條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

表2　4個(gè)指標(biāo)間的相關(guān)性分析Table 2　Correlation analysis of 4 indicators

注:**表示在0.01水平上顯著(p<0.01)。

2.3響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

響應(yīng)面法的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。運(yùn)用Minitab 16數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,回歸模型系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3　風(fēng)味蛋白酶水解羊骨粉條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3　Design and results of RSM tests on hydrolysis conditions of sheep bon collagen with flavourzyme

表4　回歸方程的方差分析Table 4　Variance analysis of the regression equation

注:**,p<0.01;*,p<0.05。

得到料水比(A)、水解溫度(B)、水解時(shí)間(C)、加酶量(D)與水解度(Y)的二次多項(xiàng)回歸模型為:

Y=19.30+1.40A+2.11B+0.21C+0.88D-0.45AB+2.22AC-0.055AD-0.10BC-1.63BD+0.10CD-0.99A2-1.26B2-3.71C2-0.74D2

由表4回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知,模型的一次項(xiàng)A、B和二次項(xiàng)C2極顯著及交互項(xiàng)AC顯著,其他項(xiàng)不顯著,表明各因素對(duì)于水解度的影響不是簡單的線性關(guān)系。

2.4響應(yīng)面圖分析

通過上述二次項(xiàng)回歸方程所作的料水比與水解時(shí)間的響應(yīng)面圖見圖6。

圖6　料水比、水解時(shí)間及其交互作用 對(duì)水解度影響的響應(yīng)面圖Fig.6　Response surface plot for effects of liquid-solid ration enzymolysis time and their mutual interaction on the degree of hydrolysis

通過等高線形狀得出,料水比和水解時(shí)間的交互作用顯著。從圖6可以看出,水解度隨著料水比增加和水解時(shí)間的延長先增后降。由于底物濃度較低時(shí),酶催化反應(yīng)的速度與底物濃度成正比,當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定值后,酶被底物飽和,因此反應(yīng)速度逐步趨于平衡。

2.5工藝參數(shù)優(yōu)化及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

2.5.1數(shù)學(xué)模型的優(yōu)化利用Design-Expert 8.0.6軟件尋優(yōu),得到風(fēng)味蛋白酶最優(yōu)水解條件為料水比2.88∶25(W/V)、水解溫度55 ℃、水解時(shí)間313.8 min、加酶量3.48%,此條件下預(yù)測(cè)水解度20.72%。

2.5.2驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)考慮到實(shí)際操作,將風(fēng)味蛋白酶水解工藝調(diào)整為:料水比為3∶25(W/V)、水解溫度為55 ℃、水解時(shí)間為315 min、加酶量為3.48%(E/S)、pH7.5,在此條件下實(shí)際水解度為20.38%,與預(yù)測(cè)值相比,相對(duì)誤差較小。相對(duì)于林波等[13]通過正交實(shí)驗(yàn)確定最佳工藝,本文選用的響應(yīng)面法在各因素對(duì)水解度影響程度及顯著性的分析上都具有優(yōu)勢(shì)[14]。因此,基于響應(yīng)面法所得的優(yōu)化工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠,具有實(shí)用價(jià)值。

3　結(jié)論

4個(gè)水解指標(biāo)(水解度、短肽得率、氨基酸態(tài)氮、多肽生成量)之間均顯著相關(guān),其中短肽得率和水解度相關(guān)性最強(qiáng)。通過響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得出最佳水解工藝條件為:料水比為3∶25(W/V)、水解溫度為55 ℃、水解時(shí)間為315 min、加酶量為3.48%(E/S)、pH7.5,水解度為20.38%。

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Preparation of collagen polypeptide from sheep bone by the flavor protease

CHENG Zhi-ling1,ZHEN Shou-yan1,YAO Wei1,WANG Yu-hui1,HAN Ke-guang2,HUO Nai-rui2,*

(1.Shanxi Agricultural University,College of Food Science & Engineering,Jinzhong 030801,China;2.College of Animal Sicience,Jinzhong 030801,China)

Using flavourzyme enzyme solution of sheep bone meal,and the hydrolysis index correlation analysis. Results of correlation analysis indicated that 4 indicators were significantly correlated with each other. The correlation with the indicator of degree of hydrolysis was obtaining rate of short peptides(0.926)>polypeptides amount(0.805)>amino acid nitrogen(0.680). So in using response surface optimization of sheep bone enzymolysis,DH or the obtaining rate of short peptides were the first indicators to select. It was concluded that the optimal hydrolysis conditions,ratio of material to liquid was 3∶25(W/V),hydrolysis temperature for 55 ℃,hydrolysis time was 315 min,added enzyme quantity was 3.48%(E/s),pH7.5. This condition hydrolysis degree of 20.38%,the relative error was less than the predicted value(20.72%),and the optimized parameters obtained by the response surface method were accurate and reliable,which had practical value.

sheep bone;flavor protease;degree of hydrolyzing;collagen polypeptides

2015-11-09

程稚玲(1990-),女,在讀碩士研究生,研究方向:食品生物技術(shù),E-mail:chengzhiling111@163.com。

霍乃蕊(1972-),女,博士,教授,主要從事生物技術(shù)與食品安全方面的研究,E-mail:tgnrhuo@163.com。

國家自然科學(xué)基金(31201347);山西省回國留學(xué)人員項(xiàng)目(2014-042)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)14-0214-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.035