王娜娜,李　婉,杜金城,霍貴成

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

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乳酸乳球菌KLDS4.0325產(chǎn)細菌素最佳培養(yǎng)條件的研究

王娜娜,李婉,杜金城,霍貴成*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

以分離自新疆牧民家庭自制酸馬奶中的乳酸乳球菌KLDS4.0325為研究對象,以大腸桿菌為指示菌,以抑菌圈直徑為考察指標,考察了不同溫度、pH、轉(zhuǎn)速及培養(yǎng)時間等培養(yǎng)條件對該菌株細菌素產(chǎn)量的影響,經(jīng)單因素實驗優(yōu)化得出乳酸乳球菌KLDS4.0325在培養(yǎng)溫度33 ℃,培養(yǎng)基初始pH7.0,120 r/min搖床培養(yǎng)20 h的條件下,無細胞發(fā)酵上清液對大腸桿菌的抑菌圈直徑最大,抑菌活性最強,細菌素產(chǎn)量最高。在此條件下,抑菌圈直徑為25.26 mm,細菌素效價可達5383.07 IU/mL。

乳酸乳球菌,細菌素,培養(yǎng)條件

細菌素是由細菌核糖體合成的抑菌多肽或蛋白類物質(zhì),能抑制或殺死與產(chǎn)生菌親緣關(guān)系相同或相近的微生物[1],而產(chǎn)生菌本身對其有免疫功能。近幾年,由于細菌素?zé)o毒無害(能在胃腸道內(nèi)被蛋白酶消化),人們越來越關(guān)注其作為生物防腐劑在食品工業(yè)中的應(yīng)用[2]?，F(xiàn)階段由于細菌素產(chǎn)量和活性的提高能節(jié)約生產(chǎn)成本,因此人們以研究其生產(chǎn)和純化為主[3]。

蔡慶霞[4]研究植物乳桿菌LPC718產(chǎn)細菌素的發(fā)酵條件,經(jīng)優(yōu)化最優(yōu)條件為菌液的接種量為4%,發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH7.5,36 ℃下靜置培養(yǎng);胡敏等[5]采用響應(yīng)面法優(yōu)化了枯草芽孢桿菌HJD.A32產(chǎn)細菌素的培養(yǎng)條件,經(jīng)優(yōu)化細菌素產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了一倍;劉國榮等[6]通過響應(yīng)面法優(yōu)化了彎曲乳桿菌RX-6產(chǎn)細菌素的發(fā)酵條件,使效價較優(yōu)化前提高了2.46倍;程建軍等[7]研究了不同溫度、時間、硫酸銨飽和度及培養(yǎng)基成分對植物乳桿菌B28產(chǎn)細菌素的影響,經(jīng)優(yōu)化使植物乳桿菌抑菌活性提高了30%。因此,改變菌株的培養(yǎng)基成分、發(fā)酵條件及細菌生長期等因素可提高細菌素產(chǎn)量,從而促進細菌素的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用。

L.lactisKLDS4.0325是東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室從中國新疆牧民家庭自制的酸馬奶中分離的一株乳酸乳球菌,于2013年完成全基因組測序并將序列上傳到Genbank數(shù)據(jù)庫,登錄號為NC_022593.1[8],分析全基因組序列發(fā)現(xiàn)其含有細菌素合成基因簇,并經(jīng)前期實驗驗證該菌株有產(chǎn)細菌素的能力。因此本研究優(yōu)化L.lactisKLDS4.0325產(chǎn)細菌素的培養(yǎng)條件,提高其產(chǎn)細菌素的能力,從而為該細菌素的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用提供切實的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與設(shè)備

乳酸乳球菌KLDS4.0325東北農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部重點實驗室工業(yè)微生物菌種保藏中心(KLDS-DICC)保藏;大腸桿菌EscherichiacoliATCC 25922黑龍江省微生物研究所;基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基128.99 g/L蔗糖,17.59 g/L蛋白胨,10 g/L酪蛋白胨,10 g/L磷酸氫二鉀,1.5 g/L硫酸鎂,1.49 g/L抗壞血酸鈉,1.5 g/Lβ-甘油磷酸鈉,乙酸鈉、氯化鈉、硫酸錳各為1.0 g/L,115 ℃,滅菌20 min,加入已滅菌的碳酸鈣60 g/L(121 ℃滅菌15 min);M17培養(yǎng)基大豆蛋白胨5.0 g、蛋白胨2.5 g、酪蛋白胨2.5 g、酵母浸粉2.5 g、牛肉粉5.0 g、乳糖5.0 g、抗壞血酸0.5 g、β-甘油磷酸鈉19.0 g/L、硫酸鎂0.25 g/L,121 ℃,滅菌15 min;Nisin標準品(106IU/g)、過氧化氫酶美國Sigma公司。

GL-21M高速冷凍離心機上海市離心機械研究所;ZHWY-100B恒溫培養(yǎng)振蕩器、SPX-150B生化培養(yǎng)箱上海佳勝實驗設(shè)備有限公司;CHRISTALPHA1-4型凍干機MarinChrist德國。

1.2實驗方法

1.2.1菌株的活化及KLDS4.0325生長曲線的測定將活化好的乳酸乳球菌KLDS4.0325以2%接種量接入M17培養(yǎng)基中,置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2 h取樣一次,測定OD600、活菌數(shù)及pH。

1.2.2效價測定細菌素效價的測定:根據(jù)Cabo等[9]的方法以大腸桿菌ATCC25922為指示菌,以抑菌圈直徑為縱坐標,Nisin效價的對數(shù)值為橫坐標,其中抑菌活力單位為IU,繪制標準效價曲線。

1.2.3抑菌活性測定參考于微等人[10]的方法制備無細胞發(fā)酵上清液,即菌液10000 r/min,4 ℃離心15 min,收集上清液,用6 mol/L NaOH調(diào)pH到6.5,以排除有機酸的干擾;加入過氧化氫酶使其終濃度為5.0 mg/mL,37 ℃水浴2 h,以排除過氧化氫的干擾,然后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,除去菌體及其它雜質(zhì),然后冷凍干燥濃縮后備用。采用雙層平板法[11]測定無細胞發(fā)酵上清液的抑菌活性。

1.2.4培養(yǎng)條件的優(yōu)化所有單因素實驗選取基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基,條件均為初始pH7.0,2%的接種量。

1.2.4.1溫度將活化好的乳酸乳球菌KLDS4.0325以2%接種量接入數(shù)瓶基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中,調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為7.0,分別設(shè)定溫度為30、33、36、39、42 ℃,在轉(zhuǎn)速為120 r/min條件下,搖床培養(yǎng)20 h,測定菌液的OD600,然后制備無細胞發(fā)酵上清液,測定不同培養(yǎng)溫度下無細胞發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑大小,確定乳酸乳球菌產(chǎn)細菌素的最適發(fā)酵溫度。

1.2.4.2pH將活化好的乳酸乳球菌KLDS4.0325以2%接種量接入數(shù)瓶基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中,分別調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,33 ℃,120 r/min搖床培養(yǎng)20 h,測定菌液的OD600,然后制備無細胞發(fā)酵上清液,測定不同初始pH下無細胞發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑大小,進一步考察不同pH對乳酸乳球菌產(chǎn)細菌素的影響,確定最適pH。

1.2.4.3轉(zhuǎn)速將活化好的乳酸乳球菌KLDS4.0325以2%接種量接入數(shù)瓶基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中,調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為7.0,分別調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為0、40、80、120、160、200 r/min,33 ℃,培養(yǎng)20 h,測定菌液的OD600,然后制備無細胞發(fā)酵上清液,測定不同轉(zhuǎn)速下無細胞發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑大小,確定最佳轉(zhuǎn)速。

1.2.4.4時間將活化好的乳酸乳球菌KLDS4.0325以2%接種量接入數(shù)瓶基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中,調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為7.0,33 ℃,120 r/min搖床培養(yǎng),不同時間(0～48 h)每隔4 h取樣一次[11],測定菌液的OD600,然后制備無細胞發(fā)酵上清液,測定不同培養(yǎng)時間下無細胞發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑大小,確定最適發(fā)酵時間。

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析所有實驗均進行三次重復(fù)實驗,圖表運用Excel進行繪制;數(shù)據(jù)處理采用SPSS軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2　結(jié)果與討論

2.1KLDS4.0325的生長曲線

由圖1可知,KLDS4.0325在2 h左右度過延滯期,進入指數(shù)生長期,0～8 h活菌數(shù)呈指數(shù)增長。其中在0～4 h之間活菌數(shù)增長最快,而4～8 h內(nèi)活菌數(shù)增長趨勢變緩。在8～20 h期間,活菌數(shù)基本穩(wěn)定,此階段為穩(wěn)定期,細胞代謝產(chǎn)物積累達到最高峰,是生產(chǎn)的收獲期。在20～24 h期間,活菌數(shù)稍有下降,此階段為衰亡期;菌株OD600變化趨勢與活菌數(shù)對數(shù)值基本一致;pH由初始7.0慢慢下降,在10 h左右達到最小值,此后趨于穩(wěn)定,說明菌株生長已進入穩(wěn)定期。綜上,選取20 h為菌株的發(fā)酵終點。

圖1　KLDS4.0325的生長曲線Fig.1　The grow curve of KLDS4.0325

2.2Nisin效價標準曲線

以Nisin效價的對數(shù)值為橫坐標,抑菌圈直徑為縱坐標,繪制效價標準曲線,結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,Nisin標準效價的對數(shù)值與抑菌圈直徑之間呈線性關(guān)系,回歸方程為y=6.021x+10.62,其中y表示抑菌圈直徑,x表示Nisin效價的對數(shù)值,相關(guān)系數(shù)為0.994,因此該曲線符合進一步的實驗要求。

圖2　細菌素的標準效價曲線Fig.2　Standard titer curve of bacteriocin

2.3不同培養(yǎng)溫度對細菌素產(chǎn)量的影響

由圖3可知,當(dāng)溫度在30～33 ℃時,隨溫度升高,菌液的光密度值增大,細菌數(shù)目增多;當(dāng)溫度在33～42 ℃之間時,隨溫度的升高,菌液的光密度值減小,細菌數(shù)目變少,說明隨著溫度的升高,不利于菌株的生長。隨溫度變化,抑菌圈直徑大小呈先增大后減小的趨勢,與菌液光密度值的變化趨勢一致,該結(jié)果與大多乳球菌的最適生長溫度相近[12]。因此,選取33 ℃為乳酸乳球菌KLDS4.0325產(chǎn)細菌素的最適溫度，進行下一步的研究。

圖3　溫度對抑菌圈直徑的影響Fig.3　Effect of different temperature on inhibitory zone diameter

2.4不同pH對細菌素產(chǎn)量的影響

由圖4可知,當(dāng)pH在4.5～7.0之間,抑菌圈直徑大小隨著pH的升高而增大,當(dāng)pH為7.0時達到最大值,隨著pH的繼續(xù)增加,抑菌圈直徑有所下降,這說明該菌株無細胞發(fā)酵上清液的抑菌活性在中性pH條件下最強;另一方面,當(dāng)pH在4.5～6.5之間,抑菌圈直徑與菌液的光密度值呈現(xiàn)一定的正相關(guān),由此推斷,菌液濃度在很大程度上也影響細菌素的產(chǎn)量,隨著菌液濃度的增大,抑菌圈直徑變大,細菌素產(chǎn)量增加,無細胞發(fā)酵上清液的抑菌活性增強;此外,由于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加碳酸鈣可中和初始pH較低的培養(yǎng)基,使菌株在4.5、5.0和5.5的低pH下也能生長。綜上,該結(jié)果不同于大多數(shù)乳酸乳球菌適合在弱酸性環(huán)境中生長,這也說明細菌素的產(chǎn)生是菌株對不良環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)。因此,選取pH7.0為乳酸乳球菌KLDS4.0325產(chǎn)細菌素發(fā)酵培養(yǎng)基的最適初始pH。

圖4　不同初始pH對抑菌圈直徑的影響Fig.4　Effect of different initial pH on inhibitory zone diameter

2.5不同轉(zhuǎn)速對細菌素產(chǎn)量的影響

由圖5可知,當(dāng)轉(zhuǎn)速在0～120 r/min之間,隨著轉(zhuǎn)速的增加,抑菌圈直徑不斷增大,在轉(zhuǎn)速為120 r/min時,無細胞發(fā)酵上清液對大腸桿菌的抑菌圈直徑達到最大值;當(dāng)轉(zhuǎn)速進一步增加時,抑菌圈直徑開始變小,這可能是由于一定濃度的碳酸鈣能促進細菌素的產(chǎn)生,而一定大小的轉(zhuǎn)速有助于碳酸鈣均勻分布在培養(yǎng)基中,從而使碳酸鈣更好的發(fā)揮作用,而轉(zhuǎn)速過大會導(dǎo)致溶氧量增加,影響乳酸菌無氧發(fā)酵的過程,會改變菌株的代謝機制,從而對細菌素的合成造成不利的影響[13]。

圖5　不同轉(zhuǎn)速對抑菌圈直徑的影響 Fig.5　Effect of different speed on inhibitory zone diameter

2.6不同時間對細菌素產(chǎn)量的影響

圖6　L. lactis KLDS 4.0325的抑菌作用曲線Fig.6　Antimicrobial activity production during the growth of L. lactis KLDS 4.0325

由圖6可知,乳酸乳球菌KLDS 4.0325在8 h前已經(jīng)度過了指數(shù)生長期進入穩(wěn)定期前期,在8～20 h期間,菌株的活菌數(shù)保持穩(wěn)定,在20 h左右進入穩(wěn)定期末期,此時,菌株活菌數(shù)達到最大值,之后菌株活菌數(shù)逐漸下降,進入衰亡期;由抑菌圈直徑大小可知,在0～8 h,無細胞發(fā)酵上清液對大腸桿菌無抑制作用,細菌素在8 h即指數(shù)期后期開始產(chǎn)生,在穩(wěn)定期細菌素產(chǎn)量繼續(xù)增加,在20 h即穩(wěn)定期后期無細胞發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑達到最大值,對大腸桿菌的抑菌活性最大,細菌素產(chǎn)量最高,此時的抑菌圈直徑為25.26 mm,效價為5383.07 IU/mL。在20～24 h隨活菌數(shù)的減少,抑菌圈直徑變小,在24 h之后隨著活菌數(shù)達到穩(wěn)定值,細菌素產(chǎn)量趨于穩(wěn)定,因此,選取培養(yǎng)時間20 h為乳酸乳球菌KLDS4.0325產(chǎn)細菌素的最適培養(yǎng)時間。與其它菌株[14]相比,發(fā)酵時間短,可節(jié)約生產(chǎn)周期,有利于該菌株的工業(yè)化生產(chǎn)。

3　結(jié)論

對分離自新疆牧民家庭自制的酸馬奶中的乳酸乳球菌KLDS4.0325產(chǎn)細菌素的最優(yōu)培養(yǎng)條件進行優(yōu)化,經(jīng)優(yōu)化該菌株在培養(yǎng)溫度33 ℃,培養(yǎng)基初始pH7.0,120 r/min搖床培養(yǎng)20 h的條件下,抑菌圈直徑為25.26 mm,效價可達5383.07 IU/mL,細菌素產(chǎn)量最大,為該菌株所產(chǎn)細菌素的進一步研究及工業(yè)化生產(chǎn)提供了切實的理論依據(jù)。

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Studying on the optimal bacteriocin production condition ofLactococcuslactisKLDS4.0325

WANG Na-na,LI Wan,DU Jin-cheng,HUO Gui-cheng*

(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

The fermentation conditions ofL.lactisKLDS4.0325 isolated from self-made koumiss Xinjiang were optimized for bacteriocin production by double-plate method.The inhibitory zone diameter(mm)was used as evaluation index and quantified againstEscherichiacoliATCC 25922. The result showed that the bacteriocin production reached the maximal value under the condition of 33 ℃,original pH7.0 and 120 r/min for 20 h. Further,under the optimal culture condition,the inhibitory zone diameter was 25.26 mm and the titer of bacteriocin was reached up to 5383.07 IU/mL.

Lactococcuslactis;bacteriocin;fermentation condition

2015-12-18

王娜娜(1990-),女,碩士研究生,研究方向:食品科學(xué),E-mail:wnana1990@163.com。

霍貴成(1958-),男,博士,教授,研究方向:食品微生物與生物技術(shù),E-mail:gchuo58@126.com。

國家自然科學(xué)基金(31401512);國家863計劃項目(2011AA100902)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)14-0187-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.029