鄢明輝,吳正鈞

(1.乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,光明乳業(yè)研究院,上海 200436;2.上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心,上海 200436)

?

腸膜明串珠菌胞外多糖合成的蛋白組學(xué)分析

鄢明輝1,吳正鈞2,*

(1.乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,光明乳業(yè)研究院,上海 200436;2.上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心,上海 200436)

以高產(chǎn)胞外多糖的腸膜明串珠菌BD3749為材料,通過(guò)雙向電泳技術(shù)分析了產(chǎn)糖過(guò)程中的蛋白質(zhì)組。結(jié)果表明,在產(chǎn)糖過(guò)程中有131個(gè)蛋白發(fā)生了明顯變化(2倍以上),其中25個(gè)蛋白有顯著改變(10倍以上)。初步的質(zhì)譜鑒定表明,其中包含GH70家族的糖基轉(zhuǎn)移酶、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶以及分子伴侶。腸膜明串珠菌胞外多糖的合成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,涉及眾多基因在蛋白水平的變化。

腸膜明串珠菌,胞外多糖,蛋白組,雙向電泳

乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是能夠發(fā)酵碳水化合物并產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽(yáng)性、非芽孢菌的總稱(chēng),在食品中具有悠久的應(yīng)用歷史,被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵制品、肉類(lèi)制品及醫(yī)藥保健品等領(lǐng)域。腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)是一種重要的工業(yè)用生產(chǎn)菌種,能夠利用蔗糖產(chǎn)生不同聚合度的右旋糖苷(Dextran),右旋糖苷可用作血漿代用品,用于出血性休克、創(chuàng)傷性休克及燒傷性休克等癥狀的治療。此外,明串珠菌還可產(chǎn)生的其他種類(lèi)胞外多糖(EPS),如左旋糖苷(Levan)類(lèi)型的果聚糖等,也被證實(shí)有重要的應(yīng)用價(jià)值。雖然明串珠菌的胞外多糖在工業(yè)上得到廣泛應(yīng)用,但其合成機(jī)制仍不十分清楚。隨著右旋糖苷及其他胞外多糖的廣泛應(yīng)用,闡明明串珠菌中負(fù)責(zé)EPS合成的關(guān)鍵酶及調(diào)控機(jī)理,對(duì)于高效制備所需求類(lèi)型的胞外多糖可以提供技術(shù)上的支持。目前已經(jīng)在明串珠菌中鑒定的葡聚糖蔗糖酶(GS)包括右旋糖苷合成酶(Dextransucrase)和果聚糖合成酶(Levansucrase)等,并且有多個(gè)GS基因得到克隆并實(shí)現(xiàn)了原核表達(dá),如dsrA,dsrB,dsrD,dsrS等[1-4]。但對(duì)于這些基因在明串珠菌細(xì)胞內(nèi)的功能(invivofunction),以及在多糖合成過(guò)程中如何協(xié)同作用尚不清楚。

蛋白質(zhì)組(proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出,指由一個(gè)基因組(Genome)所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)(protein)。雙向凝膠電泳(Two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù),由O’Farrell等首次提出[5]。利用雙向電泳技術(shù)構(gòu)建蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜,可以分離得到數(shù)以百計(jì)的蛋白質(zhì)。乳酸菌中的蛋白質(zhì)組學(xué)研究起步較晚,有研究者利用雙向電泳技術(shù)對(duì)乳桿菌及雙歧桿菌在酸性脅迫下的蛋白質(zhì)組進(jìn)行了研究[6-8]。國(guó)內(nèi)張和平等利用蛋白雙向電泳技術(shù)對(duì)多株乳桿菌在脅迫條件下的蛋白質(zhì)組進(jìn)行了分析[9-10]。

腸膜明串珠菌BD3749(CGMCC10064)是一株從泡菜中分離獲得、能夠利用蔗糖合成大量胞外多糖的菌株,其產(chǎn)生的胞外多糖由不溶性的多糖以及水溶性的多糖組成。因其在胞外多糖產(chǎn)量及類(lèi)型上的優(yōu)勢(shì),是研究乳酸菌胞外多糖合成的理想材料。鑒于上述分子克隆及原核表達(dá)在研究基因功能方面的局限性,本研究采用雙向電泳來(lái)分析腸膜明串珠菌產(chǎn)糖條件下的蛋白質(zhì)組,尋找負(fù)責(zé)胞外多糖合成的糖基轉(zhuǎn)移酶,并通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)及抽提條件,克服BD3749培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的胞外多糖(水溶性及不溶性多糖)對(duì)總蛋白抽提及分析的影響。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

腸膜明串珠菌BD3749由乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供;MRS 培養(yǎng)基(1 L)蛋白胨10 g,牛肉膏 5 g,酵母膏粉10 g,葡萄糖20 g,吐溫-80 1 g,K2HPO42 g,乙酸鈉 5 g,檸檬酸三銨 2 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,MnSO4·4H2O 0.05 g;改良產(chǎn)糖培養(yǎng)基(1 L)蔗糖 20 g,蛋白胨 10 g,酵母提取物 5 g,K2HPO45 g;丙烯酸胺、Tris、SDS、TEMED、N,N＇-甲叉雙丙烯酞胺、硝酸銀、三氯乙酸上海生工生物;尿素、硫脲、DTT、CHAPS、碘乙酰胺、考馬斯亮藍(lán)、IPG(Immobilized pH gradient)干膠條(18 cm、pI 4～7)美國(guó)Bio-rad公司;正丁醇、過(guò)硫酸胺、無(wú)水乙酸鈉、丙酮、EDTA、Na2S2O3、Na2CO3等;蛋白裂解液PL039及蛋白質(zhì)定量試劑盒SK3031上海生工。

SDS-PAGE電泳儀Bio-rad公司;等電聚焦儀、Ettan DALT Twelve system 裝置、Image Scanner 掃描儀及 Image Master 5. 0 圖像分析系統(tǒng)美國(guó)GE公司;TGL-168 低溫離心機(jī)德國(guó) Eppendorf 公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1用于蛋白分析的培養(yǎng)條件的改良參考Jun等人的工作[11],對(duì)用于蛋白質(zhì)分析的培養(yǎng)條件做了改良。使用20 g/L蔗糖、不加Ca2+的培養(yǎng)條件,產(chǎn)糖量顯著降低,以便于后續(xù)的蛋白電泳分析。

1.2.2BD3749生長(zhǎng)曲線測(cè)定及生長(zhǎng)情況比較挑取MRS平板上活化的BD3749單菌落,轉(zhuǎn)接至新鮮MRS液體中培養(yǎng)12 h后按1∶50轉(zhuǎn)接至改良產(chǎn)糖培養(yǎng)基中(對(duì)照組以相同濃度的葡萄糖替代蔗糖),30 ℃搖床培養(yǎng)。期間每隔2 h取樣測(cè)定OD600,每組取三個(gè)重復(fù)。同時(shí)取樣經(jīng)梯度稀釋后涂布于MRS平板,置于厭氧箱中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。通過(guò)所得的活菌數(shù)量繪制生長(zhǎng)曲線,比較添加葡萄糖和蔗糖條件下BD3749的生長(zhǎng)情況。

1.2.3樣品蛋白提取MRS液體中培養(yǎng)12 h的種子,以1∶50轉(zhuǎn)接至50 mL改良產(chǎn)糖培養(yǎng)基中,30 ℃搖床培養(yǎng)12 h后離心收集到菌體,所得樣品以0.5 mol/L NaOH洗三遍去除不溶性多糖,所得菌體沉淀中加入1 mL蛋白裂解液,100 W超聲破碎,超聲2 s間歇5 s,共3 min,超聲結(jié)束后4 ℃,12000 r/min離心30 min,獲得上清液,加入1 mL預(yù)冷丙酮,-20 ℃過(guò)夜。4 ℃,12000 r/min離心30 min,去除上清,待沉淀?yè)]干丙酮后加入500 μL蛋白裂解液。使用 Bradford 法蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒對(duì)所得蛋白提取液進(jìn)行濃度測(cè)定,具體步驟參照使用說(shuō)明書(shū)。

1.2.4雙向電泳

1.2.4.1等電點(diǎn)聚焦(IEF)取1.2.2中所得總蛋白樣品150 μg,選用pH4～7 NL IPG預(yù)制干膠條,進(jìn)行第一向等電聚焦,電泳參數(shù)見(jiàn)表1。

表1　等電聚焦電泳參數(shù)Table 1　Isoelectric focusing(IEF)parameters

1.2.4.2膠條平衡將聚焦完成的膠條加2D Equilibration Buffer(加1% DTT)10 mL,搖床平衡15 min。清洗膠條,加入2D Equilibration Buffer(加2.5% IAA),搖床平衡15 min。

1.2.4.3SDS-PAGE將平衡后的膠條放入凝膠板中,加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液(0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖+電泳緩沖液),室溫靜置20 min后開(kāi)始第二向電泳。第二向SDS-PAGE凝膠濃度為12.5%,電泳參數(shù)設(shè)定為:100 V/膠,電泳45 min;200 V/膠,至溴酚藍(lán)離膠下沿0.5 cm處停止;冷循環(huán)設(shè)定溫度為15 ℃。電泳結(jié)束后,輕輕撬開(kāi)兩層玻璃,取出凝膠進(jìn)行染色。

1.2.4.4凝膠染色凝膠采用銀染試劑盒進(jìn)行染色,具體操作如下:水洗5～10 min,固定30 min,10%乙醇洗兩遍,每遍5 min,水洗兩遍,每遍5 min,敏化1 min,水洗兩遍,每次1 min,銀染20 min,水洗凝膠兩次,每次30 s,顯影5 min后拍照分析。

1.2.4.5凝膠圖像掃描對(duì)脫色結(jié)束的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行掃描,分辨率為300 dpi。使用PDquest 8.0軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1用于蛋白分析的培養(yǎng)條件改良

BD3749是一株高產(chǎn)胞外多糖的腸膜明串珠菌,在含200 g/L蔗糖的產(chǎn)糖培養(yǎng)基中產(chǎn)生大量胞外多糖,使得菌體分離和蛋白提取非常困難。在Jun等人的研究基礎(chǔ)上[11],對(duì)產(chǎn)糖過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化,目的是在不明顯影響糖基轉(zhuǎn)移酶誘導(dǎo)效果的前提下,降低胞外多糖的產(chǎn)量。粗多糖測(cè)定表明,采用改良后的培養(yǎng)條件(含20 g/L蔗糖),BD3749總多糖的產(chǎn)量降低到5 g/L以下。

作為雙向電泳的預(yù)實(shí)驗(yàn),同時(shí)檢測(cè)上述條件優(yōu)化對(duì)于總蛋白分析的改善效果,對(duì)上述條件下的培養(yǎng)物進(jìn)行了菌體總蛋白SDS-PAGE分析,如圖1所示。結(jié)果表明,優(yōu)化后的條件下,胞外多糖對(duì)于蛋白質(zhì)分析的影響已經(jīng)基本去除,SDS-PAGE分析能夠得出清晰的蛋白條帶。

圖1　優(yōu)化后的條件下BD3749菌體總蛋白SDS-PAGE結(jié)果Fig.1　SDS-PAGE of total protein of BD3749 cultivated under the optimized condition 注:S1,S2為BD3749在兩種不同產(chǎn)糖條件(振蕩培養(yǎng)和靜置) 下的總蛋白樣品,右側(cè)為蛋白分子量標(biāo)尺。

2.2不同條件下BD3749的生長(zhǎng)情況比較

在上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,選擇20 g/L蔗糖條件來(lái)分析產(chǎn)糖過(guò)程中的蛋白表達(dá)差異。因?yàn)锽D3749的胞外多糖合成主要是以蔗糖作為底物,同樣條件的葡萄糖培養(yǎng)物基本不合成胞外多糖,因此,以20 g/L的葡萄糖作為對(duì)照組。

為了避免不同培養(yǎng)條件菌體生長(zhǎng)差異對(duì)蛋白分析的干擾,對(duì)BD3749分別在20 g/L葡萄糖和20 g/L蔗糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況進(jìn)行了比較,如圖2所示。OD600值測(cè)定表明,BD3749在蔗糖培養(yǎng)基中能夠更快地積累生物量,這很大程度上是由于合成的胞外多糖。而菌體總蛋白濃度的結(jié)果表明,葡萄糖和蔗糖培養(yǎng)物中菌體生長(zhǎng)速度相當(dāng)(葡萄糖和蔗糖條件下同體積培養(yǎng)物所得的蛋白濃度相差不大)。

圖2　BD3749在葡萄糖和蔗糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況Fig.2　Growth of BD3749 in medium containing glucose(Glc)or sucrose(Suc)

2.3產(chǎn)糖條件下蛋白組的雙向電泳分析

分別取BD3749在上述優(yōu)化條件下的對(duì)數(shù)期培養(yǎng)物50 mL進(jìn)行菌體總蛋白抽提,所得總蛋白經(jīng)Bradford法定量后進(jìn)行雙向電泳,經(jīng)銀染后所得結(jié)果如圖3所示。

圖3　BD3749產(chǎn)糖條件下的雙向電泳分析Fig.3　2-D gel electrophoresis of BD3749 total protein

雙向凝膠電泳結(jié)果表明,葡萄糖和蔗糖培養(yǎng)條件下的菌體總蛋白的蛋白點(diǎn)吻合率在90%以上。PDquest 8.0 軟件分析表明,蔗糖和葡萄糖兩種條件下有明顯差異(差異在2倍以上)的蛋白點(diǎn)為131個(gè),其中差異倍數(shù)在10倍以上的蛋白點(diǎn)為25個(gè)。

2.4差異表達(dá)的蛋白分析

在上述差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)中,重點(diǎn)關(guān)注是BD3749的糖基轉(zhuǎn)移酶。已有的研究表明,腸膜明串珠菌中負(fù)責(zé)胞外多糖合成的主要是葡聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶(Glucansucrase,屬于GH70家族),而已發(fā)現(xiàn)的GH70家族的糖基轉(zhuǎn)移酶分子量都很大,在180 ku以上[3,12]。同時(shí),如圖3所示,雙向電泳結(jié)果表明,產(chǎn)糖過(guò)程中明顯上調(diào)的蛋白點(diǎn)主要分布于較高分子量、中性蛋白區(qū)域(圖3中右上角部分)。因此,對(duì)大分子量的差異蛋白(圖3中右上角方框中部分)進(jìn)行了重點(diǎn)分析。通過(guò)對(duì)上述蛋白斑點(diǎn)(5個(gè)高分子量的斑點(diǎn))進(jìn)行質(zhì)譜分析(代表性肽譜圖如圖4所示),除了GH70家族的糖基轉(zhuǎn)移酶以外,鑒定除了包含檸檬酸合成酶、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和分子伴侶在內(nèi)的一系列差異表達(dá)的蛋白質(zhì),如表2所示。

圖4　代表性肽指紋圖譜Fig.4　Representative peptide fingerprinting map 注:A圖中譜圖對(duì)應(yīng)的肽段N-SLVEGESVEVGPTFGLR-C, 匹配到的蛋白為gi|517441595,B圖中譜圖對(duì)應(yīng)的肽段 N-AYYLPGVDSSKITAK-C,匹配到的蛋白為gi|499999644。

胞外多糖的合成及調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程,其中可能涉及到對(duì)環(huán)境中的信號(hào)(如誘導(dǎo)物蔗糖)的感知及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、多糖合成相關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控以及糖基轉(zhuǎn)移酶加工及分泌等環(huán)節(jié)。蛋白組分析結(jié)果表明,雙組份信號(hào)系統(tǒng)相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶KFRI-MG_1289在產(chǎn)糖過(guò)程中顯著上調(diào),同

表2　差異蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果Table 2　MASS analysis of differentially expressed proteins

時(shí),GH70家族的糖基轉(zhuǎn)移酶AHF19404.1也發(fā)生顯著上調(diào)。同時(shí),分子伴侶GroEL也顯著上調(diào),提示其可能在多糖合成相關(guān)酶的加工及分泌中發(fā)揮功能。此外,檸檬酸合酶的表達(dá)量也發(fā)生變化,這可能與不同碳源導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)代謝差異有關(guān)。

此外,除了上述已經(jīng)成功鑒定的蛋白,差異蛋白中可能還包括了對(duì)這些糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子,對(duì)這些轉(zhuǎn)錄因子的鑒定有望進(jìn)一步解釋胞外多糖合成的調(diào)控機(jī)制。因此,更多的差異蛋白點(diǎn)的鑒定工作還在進(jìn)行中。

3　結(jié)論與展望

對(duì)腸膜明串珠菌BD3749產(chǎn)糖過(guò)程的總蛋白進(jìn)行了雙向電泳分析,從中找到大量在產(chǎn)糖過(guò)程中發(fā)生顯著改變的蛋白點(diǎn),通過(guò)質(zhì)譜分析對(duì)其中的5個(gè)大分子量差異蛋白進(jìn)行了鑒定,其中包括GH70家族的糖基轉(zhuǎn)移酶、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶以及分子伴侶。

本研究以高產(chǎn)胞外多糖的腸膜明串珠菌BD3749作為材料,通過(guò)雙向電泳技術(shù)分析了其產(chǎn)糖過(guò)程的蛋白質(zhì)組,得到了產(chǎn)糖過(guò)程中顯著改變的25個(gè)蛋白斑點(diǎn),并已成功地對(duì)其中的5個(gè)高分子量的斑點(diǎn)進(jìn)行了鑒定。為了進(jìn)一步闡述產(chǎn)糖過(guò)程的調(diào)控機(jī)制,正在對(duì)其他的差異斑點(diǎn)進(jìn)行鑒定,這些結(jié)果將進(jìn)一步揭示糖基轉(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理,從而對(duì)產(chǎn)糖相關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控有更全面的認(rèn)識(shí),為通過(guò)基因工程手段改良腸膜明串珠菌產(chǎn)糖特性提供理論支撐。

[1]Monchois V,Remaud-Simeon M,Russell RR,et al. Characterization of Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F dextransucrase(DSRS)and identification of amino-acid residues playing a key role in enzyme activity[J]. Appl Microbiol Biotechnol,1997,48(4):465-472.

[2]Neubauer H. Molecular characterization and expression analysis of the dextransucrase DsrD of Leuconostoc mesenteroides Lcc4 in homologous and heterologous Lactococcus lactis cultures[J]. Microbiology,2003,149(4):973-982.

[3]van Hijum S A,Kralj S,Ozimek L K,et al.,Structure-function relationships of glucansucrase and fructansucrase enzymes from lactic acid bacteria[J]. Microbiol Mol Biol Rev,2006,70(1):157-176.

[4]Fraga Vidal R,Claire Moulis,Pierre Escalier,et al. Isolation of a gene from Leuconostoc citreum B/110-1-2 encoding a novel dextransucrase enzyme[J]. Curr Microbiol,2011,62(4):1260-1266.

[5]O’Farrell P. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins[J]. J Biol Chem,1975,250(10):4007-4021.

[6]Aurélie Budin-Verneuil,Vianney Pichereau,Yanick Auffray,et al. Proteomic characterization of the acid tolerance response in Lactococcus lactis MG1363[J]. Proteomics,2005,5(18):4794-4807.

[7]Borja Sánchez,Marie-Christine Champomier-Vergès,María del Carmen Collado,et al. Low-pH adaptation and the acid tolerance response of Bifidobacterium longum[J]. Applied Environment Microbiology,2007,73(20):6450-6459.

[8]Maria De Angelis,Marco Gobbetti. Environmental stress responses in Lactobacillus:A review[J]. Proteomics,2004,4(1):106-122.

[9]烏日娜,張和平,孟和. 干酪乳桿菌蛋白質(zhì)雙向電泳條件優(yōu)化及圖譜建立[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2009,28(5):598-602.

[10]烏日娜,張和平. 益生菌LactobacilluscaseiZhang在酸脅迫下的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2012,38(7):17-20.

[11]Jun Liu,Jianguang Luo,Hong Ye,et al. Medium optimization and structural characterization of exopolysaccharides from endophytic bacterium Paenibacillus polymyxa EJS-3[J]. Carbohydrate Polymers,2010,79(1):206-213.

[12]Maher Korakli,Rudi F Vogel. Structure/function relationship of homopolysaccharide producing glycansucrases and therapeutic potential of their synthesised glycans[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2006,71(6):790-803.

[13]Wackett L P. Microbial exopolysaccharides[J]. Environmental Microbiology,2009,11(3):729-730.

Proteomic analysis of EPS synthesis ofLeuconostocmesenteroides

YAN Ming-hui1,WU Zheng-jun2,*

(1.State Key Laboratory of Dairy Biotechnology,Bright Dairy Research Institute,Shanghai 200436,China;2.Shanghai Engineering Research Center of Dairy Biotechnology,Shanghai 200436,China)

The proteome ofLeuconostocmesenteroidesBD3749,a strain with large amount of exopolysaccharides(EPS),was analyzed with 2-D gel electrophoresis. The results showed that during the process of EPS production,131 proteins were obviously changed by 2 folds,among which 25 proteins were dramatically changed by 10 folds. MASS analysis of the differential protein dots showed that glycosyltransferases of GH70 family,as well as chaperones were up-regulated in the process of EPS production. These results indicated that EPS synthesis was a complicated process which involved the regulation of many genes.

Leuconostocmesenteroides;exopolysaccharides(EPS);proteomics;2-D gel electrophoresis

2015-12-29

鄢明輝(1985-)，男，博士，研究方向：乳酸菌，E-mail:yanminghui@brightdairy.com。

吳正鈞(1966-)，男，高級(jí)工程師，研究方向：乳業(yè)生物技術(shù)，E-mail:wuzhengjun@brightdairy.com。

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題(2013BAD18B01)。

TS252.54

A

1002-0306(2016)14-0158-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.023