吳　均,楊德瑩,李抒桐,嚴(yán)海元,向建國,謝青松,熊　虎

(重慶市永川食品藥品檢驗(yàn)所,重慶 402160)

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甜橙精油的化學(xué)成分、抑菌和抗氧化活性研究

吳均,楊德瑩,李抒桐,嚴(yán)海元,向建國,謝青松,熊虎

(重慶市永川食品藥品檢驗(yàn)所,重慶 402160)

采用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)對甜橙精油的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析,通過抑菌圈實(shí)驗(yàn)和試管二倍稀釋法對其抑菌效果、最低抑菌濃度(MIC值)進(jìn)行測定,采用3種方法(DPPH、ABTS和FRAP)對甜橙精油的抗氧化活性進(jìn)行體外評價(jià)。結(jié)果表明:甜橙精油含有101種組分,鑒定出50種成分,主要為脂肪族(5.96%)和萜類化合物(78.39%);甜橙精油對6種供試菌均有較明顯的抑制作用,其中對枯草芽孢桿菌的抑制作用最強(qiáng)(MIC值7.5 μL/mL),綠色木霉最弱(MIC值15 μL/mL);甜橙精油對DPPH自由基和ABTS+自由基有明顯的清除作用,樣品量與清除率間呈量效關(guān)系。

甜橙精油,化學(xué)成分,氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS),抑菌作用,抗氧化活性

甜橙[Citrussinensis(Linn.)Osb.]為蕓香科(Rutaceae)柑橘亞科(Aurantioideae)柑橘屬(Citurs)果樹,是柑橘的主要品種之一,我國栽培的甜橙品種主要有臍橙、夏橙、錦橙(普通甜橙)和血橙,目前種植面積和產(chǎn)量位居世界第一,具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-2]。甜橙精油通常采用冷榨或水蒸氣蒸餾的方法從果皮、葉子及種子中提取獲得,主要作為食品、煙草、牙膏、日化產(chǎn)品的香料[3-5]。其具有祛痰、止咳、平喘、舒緩壓力、改善失眠、降低血壓等功效[6-7],同時(shí)還含有許多抗氧化活性[8]和抗真菌活性成分,能抑制黃曲霉生長[9-10]、誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[11]和清除自由基[12]。關(guān)于甜橙精油的研究,國內(nèi)外均有報(bào)道,但結(jié)果不一。在化學(xué)成分方面,趙鑫等[13]研究發(fā)現(xiàn)甜橙精油中鑒定了24種化學(xué)成分,占總含量的92.24%,主要成分為檸檬烯(78.24%);在抑菌性方面,Viuda-Martos等[14]研究發(fā)現(xiàn),甜橙類精油能夠抑制黑曲霉(Aspergillusniger)、黃曲霉(Aspergillusflavus)的生長,且抑制效果隨著精油濃度的增大而增強(qiáng)。趙鑫等[13]研究發(fā)現(xiàn)甜橙精油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色念珠菌等具有一定的抗菌能力。在抗氧化方面,Choi等[15]研究發(fā)現(xiàn),柑橘類精油對DPPH自由基的清除能力相較于標(biāo)準(zhǔn)抗氧化物-Trolox表現(xiàn)出同等或較強(qiáng)水平,效果隨著精油濃度的增大而增強(qiáng)。Fayed等[16]研究發(fā)現(xiàn),寬皮相橘(CBlanco)精油對DPPH自由基的清除作用接近于抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)品—抗壞血酸(維生素C)。本文在前人的基礎(chǔ)上對甜橙精油的化學(xué)成分、抑菌作用和抗氧化活性進(jìn)行更加全面的研究。以期確定甜橙精油的主要化學(xué)成分,探索其抑菌作用和抗氧化特性,因此,本實(shí)驗(yàn)將利用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法分析甜橙精油的化學(xué)成分,同時(shí)通過濾紙片法測量甜橙精油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、日本根霉、綠色木霉和黑曲霉等6種菌的最大抑菌圈的直徑,確定出最低抑菌濃度,并以DPPH自由基、ABTS+自由基的清除能力和總抗氧化能力(FRAP)為指標(biāo)綜合評價(jià)甜橙精油的抗氧化活性,為它的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

100%甜橙精油水蒸氣蒸餾提取贛南甜橙果皮中的精油,重慶國泰生化藥品責(zé)任有限公司;供試菌:大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、日本根霉(RhizopusjaponicusVuillemin)、綠色木霉(Trichodermaviride)、黑曲霉(Aspergillusniger)重慶市永川食品藥品檢驗(yàn)所微生物實(shí)驗(yàn)室提供;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2′-azinobis(3-ethylbenzothi azoline-6-sulfonic acid)ammonium salt,ABTS)、2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-tris(2-pyridyl)-S-triazine,TPTZ)美國Sigma公司;濃鹽酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸鈉、過硫酸鉀、冰乙酸、醋酸鈉、氯化鐵、硫酸亞鐵、鄰二氮菲、雙氧水、Tris、鄰苯三酚分析純,成都市科龍化工試劑廠。

JA2003型分析天平上海精密科學(xué)儀器有限公司;GC-MS 2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有電子轟擊(EI)離子源及GCMSsolution2.50工作站)日本島津公司;UV-2450S(E)型紫外分光光度計(jì)日本島津公司;PB-10型精密pH計(jì)德國Sartorius公司;

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1甜橙精油揮發(fā)性成分的GC-MS分析氣相色譜條件[17-18]:色譜柱:DB-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),升溫程序:初始溫度60 ℃,保持3 min,以8 ℃/min升至150 ℃保持2 min,再以10 ℃/min升至230 ℃;進(jìn)樣口溫度:250 ℃;進(jìn)樣方式:分流;壓力:55.8 kPa;總流量:101.9 mL/min;柱流量:0.98 mL/min;線速度:36.1 cm/s;吹掃流量:3.0 mL/min;分流比:100∶1;載氣(高純He,99.999%)流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:0.2 μL;溶劑延遲:1.0 min。

質(zhì)譜條件:電子轟擊(EI)離子源;檢測器電壓:830 eV;離子源溫度230 ℃;接口溫度250 ℃;ACQ方式:Scan;掃描速度:769 u/s;質(zhì)量掃描范圍:m/z 40～400。

成分解析:樣品中各未知揮發(fā)性成分的定性由計(jì)算機(jī)檢索與儀器所配置的NIST 08.LIB和NIST 08s.LIB譜庫匹配,結(jié)合相似度并參考相關(guān)文獻(xiàn)選擇85%以上匹配度的化學(xué)物質(zhì)確定為精油揮發(fā)性組分,并用峰面積歸一法確定各組分相對含量。

1.2.2甜橙精油的抗菌活性測定

1.2.2.1培養(yǎng)基的制備分別配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、土豆培養(yǎng)基[19]。

1.2.2.2菌種的活化和菌懸液的制備將3種細(xì)菌分別接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上,37 ℃培養(yǎng)24 h;將3種霉菌分別接種于土豆培養(yǎng)基平板上,28 ℃培養(yǎng)48 h。利用平板計(jì)數(shù)法將菌懸液濃度調(diào)至106～107CFU/mL,備用。

1.2.2.3抑菌圈直徑測定采用濾紙片法[20]。吸取200 μL各供試菌菌懸液于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基,均勻涂布,制成含菌平板。用滅菌濾紙片(直徑8 mm)蘸取100%甜橙精油后置于含菌平板表面,恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)(細(xì)菌在37 ℃培養(yǎng)24 h;霉菌在28 ℃培養(yǎng)48 h)。每組3個(gè)平板,每個(gè)平板放置3片濾紙,重復(fù)3次,選取抑菌圈比較明顯的平板測定抑菌圈直徑求平均值。

1.2.2.4最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)的測定采用二倍稀釋法,配制一系列濃度梯度的精油溶液,將不同濃度的溶液加入融化的固體培養(yǎng)基中混合均勻,使培養(yǎng)基中所含精油濃度分別為0.23、0.47、0.94、1.88、3.75、7.50、15.00、30.00 μL/mL。待培養(yǎng)基凝固后,用移液槍吸取200 μL菌懸液,均勻涂布于固體培養(yǎng)基表面。以不長菌時(shí)的精油體積濃度來確定精油抑菌的最低體積濃度為精油的MIC值,以乙醇-無菌水作對照。

1.2.3甜橙精油的抗氧化活性測定

1.2.3.1甜橙精油對ABTS+自由基的清除作用將等量的7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L 過硫酸鉀混合使之反應(yīng)并置于暗處12～16 h以制備ABTS+·。用無水乙醇將ABTS+·溶液稀釋直至其在波長734 nm處吸光度為0.70±0.02[21-22]。

將10、20、30、40、50、60、70 μL精油裝入7支試管中,用無水乙醇將體積補(bǔ)充到0.1 mL,向試管中加入2.0 mL ABTS+·溶液的試管中,搖勻后于室溫下放置10 min,測量其在波長734 nm處的吸光度(Ai)。以0.1 mL無水乙醇代替樣品為空白對照(A0),以0.1 mL樣品與2.0 mL無水乙醇混合液為樣品對照(Aj)以消除樣品本身顏色的影響,按式(1)計(jì)算自由基清除率。用10、20、30、40、50、60、70 μL 0.2 mg/mL的VC和10、20、30、40、50、60、70 μL 0.2 mg/mL的Trolox做陽性對照,每個(gè)濃度的樣品測定3次并取平均值。

清除率(%)=1-(Ai-Aj)/A0×100

式(1)

1.2.3.2甜橙精油對DPPH自由基的清除作用將2 mL 0.2 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液分別加入到2 mL含有10、20、30、40、50、60、70 μL的精油乙醇溶液中混勻,避光靜置30 min,在517 nm波長處測定吸光度。用10、20、30、40、50、60、70 μL 0.2 mg/mL的VC和10、20、30、40、50、60、70 μL 0.2 mg/mL的Trolox做陽性對照,每個(gè)濃度的樣品測定3次并取平均值[23-25]。

DPPH自由基清除率(%)=1-(Ai-Aj)/A0×100

式(2)

式中:A0為2 mL DPPH溶液+0.1 mL無水乙醇;Ai為2 mL DPPH溶液+0.1 mL樣品溶液;Aj為0.1 mL樣品溶液+2 mL無水乙醇。

1.2.3.3總抗氧化能力測定(FRAP)將10、20、30、40、50 μL精油裝入5支試管中,用無水乙醇將體積補(bǔ)充到0.1 mL,向試管中加入2.9 mL TPTZ 工作液(0.3 mol/L醋酸鹽緩沖液,10 mmol/L TPTZ溶液,20 mmol/L FeCl3溶液以V醋酸鹽緩沖液∶VTPTZ溶液∶VFeCl3溶液=10∶1∶1混合,現(xiàn)用現(xiàn)配)的試管中,37 ℃反應(yīng)10 min,測定其在波長為593 nm處的吸光度。每個(gè)濃度的樣品測定3次并取平均值[26-27]。

FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:分別取不同質(zhì)量濃度的FeSO4溶液0.1 mL,各加入2.9 mL TPTZ 工作液,37 ℃反應(yīng)10 min,測定其在波長為593 nm處的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo),FeSO4質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析處理方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS(Version 19.0)和Origin(Version 9.0)軟件進(jìn)行處理分析。

2　結(jié)果與分析

2.1甜橙精油成分分析

對甜橙精油化學(xué)成分進(jìn)行GC-MS分析,所得結(jié)果見圖1和表1。

圖1　甜橙精油成分的GC-MS 色譜圖Fig.1　GC-MS chromatogram of volatile compounds in essential oil from Citrus sinensis

通過GC-MS聯(lián)用儀分析得出甜橙精油含有101種組分,鑒定出50種成分,占總峰面積84.58%,其中:脂肪族11個(gè),占5.96%;萜類化合物38個(gè),其中單萜類化合物24個(gè),占74.45%,倍半萜類化合物14個(gè),占3.94%;其他物質(zhì)1個(gè),占0.23%。其中相對含量大于1.0%的化學(xué)成分有13種,包括D-檸檬烯(42.79%)、α-蒎烯(4.54%)、3-蒈烯(4.44%)、芳樟醇(4.05%)、正葵醛(3.97%)、辛烯(3.25%)、環(huán)己烯(3.16%)、(R)-氧化檸檬烯(2.79%)、壬醛(1.17%)、α-萜品醇(1.17%)、順式-香芹醇(1.34%)、十四醛(1.15%)和檸檬醛(1.11%),占總量的74.93%。D-檸檬烯(42.79%),具有新鮮橙子香氣及檸檬香氣,為甜橙精油的主要芳香組分,具有抗氧化、抗癌和降低膽固醇的作用[28-29];芳樟醇(4.05%)具有百荷花和柑橘類香氣[30],具有抗細(xì)菌、抗真菌和抗病毒作用[31];α-蒎烯(4.54%)、β-蒎烯(0.33%)具有樹脂和松脂香氣[26];γ-萜品烯(0.88%)、α-萜品烯(0.21%)具有柑橘和檸檬香氣,用于配制人造檸檬和薄荷香精油;石竹烯(0.08%)是巖敗醬、藍(lán)布正和魚腥草等中藥材的揮發(fā)油的重要組分,具有舒肝、鎮(zhèn)痛、降壓、調(diào)經(jīng)、祛風(fēng)除濕、清熱解毒、利尿消腫的功效[32]。

2.2甜橙精油的抗菌活性測定結(jié)果

通過測定甜橙精油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、日本根霉、綠色木霉和黑曲霉的抑菌圈直徑大小、最小抑菌濃度(MIC),比較精油對這6種供試菌的抑菌效果,結(jié)果見表2。

表2　甜橙精油抑菌活性Table 2　Antimicrobial activity of essential oil from Citrus sinensis

注:高度敏感:+++;中度敏感:++;低度敏感:+;不敏感:-。

抗菌素抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)是:抑菌圈直徑大于15 mm時(shí)為高度敏感、10～15 mm時(shí)為中度敏感,7～9 mm時(shí)為低度敏感、無抑菌圈者為不敏感[33]。由表2可知,甜橙精油對細(xì)菌和霉菌均有較強(qiáng)的抑制作用,對枯草芽孢桿菌的抑菌作用最強(qiáng),抑菌圈直徑為16.5 mm;對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌作用要比革蘭氏陰性菌大腸桿菌強(qiáng),MIC值分別為7.5、7.5和15 μL/mL。原因可能是革蘭氏陰性菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜,在一定程度上阻礙了甜橙精油的有效成分通過細(xì)胞壁,所以抑菌效果比革蘭氏陽性菌要差[34]。霉菌對甜橙精油的抑菌作用屬于中度敏感,其MIC值均為15 μL/mL,且對細(xì)菌的抑制作用要好于對于霉菌的抑制作用,這與陳林林[35]等的研究結(jié)果一致。

表1　甜橙精油成分分析表Table 1　Chemical composition of essential oil from Citrus sinensis

2.3甜橙精油對ABTS+自由基的清除作用

ABTS+·清除法是一種廣泛應(yīng)用于生物樣品氧化能力的測定方法[36]。由圖2可知,甜橙精油對ABTS+·有明顯的清除作用,清除率隨樣品體積的增加而增加,樣品體積為70 μL時(shí),甜橙精油對ABTS+·的清除率達(dá)到98.95%,表現(xiàn)出良好的清除作用。樣品體積(X)與清除率(Y)存在較好的量效關(guān)系,兩者的回歸方程為Y=1.3081X+13.324(R2=0.9876),清除率為50%時(shí),甜橙精油的體積為28.04 μL。樣品體積在低于30 μL時(shí),甜橙精油對ABTS+·的清除率與0.2 mg/mL Trolox對ABTS+·的清除率差異不大,但隨著樣品量的增加,兩者清除率的差異逐步增大;而VC的清除率與甜橙精油和Trolox的清除率隨著體積的增大差異越來越大,在70 μL時(shí),VC和Trolox的清除率基本相同,高達(dá)99%以上。

圖2　甜橙精油對ABTS+·的清除作用Fig.2　Scavenging effect of Citrus sinensis essential oil against ABTS+· radicals

2.4甜橙精油對DPPH自由基的清除作用

DPPH自由基在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的、以氮為中心的質(zhì)子自由基,廣泛用于天然產(chǎn)物抗氧化活性的研究。由圖3可知,在10～70 μL體積范圍內(nèi),VC和Trolox對DPPH自由基的清除率隨體積的增大而增加,而甜橙精油隨著體積的增加,清除率逐漸增大,表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。甜橙精油的體積(X)與清除率(Y)間呈線性正相關(guān),兩者的回歸方程為Y=0.4692X+66.304(R2=0.9933)。

圖3　甜橙精油對DPPH自由基的清除作用Fig.3　Scavenging effect of Citrus sinensis essential oil against DPPH radicals

2.5總抗氧化能力測定(FRAP)

實(shí)驗(yàn)確定了以FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)品的總還原能力標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=0.698X+0.0215,方程的R2=0.9998。從圖5可以看出,甜橙精油對Fe3+具有一定的還原能力,說明樣品中含有一定的還原性物質(zhì)。被測樣品的還原能力均隨著體積的增加而上升,當(dāng)?shù)孜餄舛仍?0～50 μL之間變化時(shí),FRAP值與樣品體積之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,說明甜橙精油具有較高的總抗氧化能力。

圖4　FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4　Standard curve of ferrous sulfate

圖5　樣品對Fe3+的還原能力Fig.5　The sample of the reduction ability of Fe3+

3　結(jié)論與討論

通過以上研究可知,利用GC-MS對甜橙精油的化學(xué)成分進(jìn)行分析,鑒定出50個(gè)組分,占總峰面積84.58%,主要化學(xué)成分為:D-檸檬烯(42.79%)。甜橙精油具有很強(qiáng)的抑菌性,對革蘭氏陽性菌的抑菌作用要比對革蘭氏陰性菌的抑菌作用強(qiáng);甜橙精油具有很強(qiáng)的抗氧化活性。國內(nèi)外有一些研究表明萜類化合物與抗氧化活性有著密切相關(guān),周江菊等[28]研究發(fā)現(xiàn)α-蒎烯、檸檬烯、石竹烯等有較強(qiáng)的自由基清除能力;Vaio CD等[37]研究發(fā)現(xiàn)多種萜類化合物具有抗氧化作用。而甜橙精油中含量較高的幾種成分[D-檸檬烯(42.79%)、α-蒎烯(4.54%)、3-蒈烯(4.44%)、芳樟醇(4.05%)]為萜類化合物,說明其強(qiáng)抗氧化活性與其主要成分萜類化合物密切相關(guān),其機(jī)理還待進(jìn)一步研究,但能說明它在天然抗氧化劑和抑菌劑方面極具開發(fā)價(jià)值。因此對甜橙這種資源豐富的物質(zhì)可以進(jìn)一步加以利用。

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Study on chemical components,antimicrobial and antioxidant activity of essential oil from Citrus sinensis

WU Jun,YANG De-ying,LI Shu-tong,YAN Hai-yuan,XIANG Jian-guo,XIE Qing-song,XIONG Hu

(Chongqing Yongchuan Institute for Food and Drug Control,Chongqing 402160,China)

The chemical composition of essential oil from Citrus sinensis was investigated by gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS). Its minimum inhibitory concentration(MIC)was determined by inhibition zone experiment and tube double dilution method. The antioxidant activity of citrus sinensis essential oil was comparatively studied by DPPH,ABTS and ferric reducing antioxidant power and ferrous ions chelating capacity. The results showed that 101 components were detected in the essential oil and 50 compounds were identified. The major compounds included aliphatic compounds(5.96%)and terpenoids(78.39%). The essential oil revealed strong antibacterial activity,its MIC was 7.5 μL/mL againstBacillussubtilis,and 15 μL/mL againstTrichodermaviriderespectively. The citrus sinensis essential oil exhibited significant scavenging capacities against DPPH and ABTS+free radical and ferric reducing antioxidant power and ferrous ions chelating capacity all in a concentration-dependent fashion.

essential oil from Citrus sinensis;chemical components;gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS);antimicrobial activity;antioxidant activity

2015-12-29

吳均(1988-)，女，碩士研究生，研究方向：食品安全與質(zhì)量控制，食品微生物檢測，E-mail：3119495376@qq.com。

TS201.2

A

1002-0306(2016)14-0148-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.021