王　晶,張春丹,楊利敏,解春艷,杜　娟,閆訓(xùn)友,吳智艷，*

(1.廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,河北廊坊 065000; 2.河北省高校食藥用菌應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心,河北廊坊 065000; 3.廊坊市食用菌技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北廊坊 065000)

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阿魏側(cè)耳胞外多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的激活作用

王晶1，2，3,張春丹1,楊利敏1,解春艷1，2，3,杜娟1，2，3,閆訓(xùn)友1，2，3,吳智艷1，2，3，*

(1.廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,河北廊坊 065000; 2.河北省高校食藥用菌應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心,河北廊坊 065000; 3.廊坊市食用菌技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北廊坊 065000)

利用巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)體系,研究阿魏側(cè)耳胞外多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的激活作用。無菌獲得小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞吞噬活性;熒光探針標(biāo)記和Griess反應(yīng)分別檢測細(xì)胞內(nèi)外NO的含量,酶聯(lián)免疫吸附法檢測細(xì)胞內(nèi)一氧化氮合成酶(NOS)、培養(yǎng)上清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)和白細(xì)胞介素12(IL-12)的含量。結(jié)果表明,與空白組相比,25～200 mg/L阿魏側(cè)耳胞外多糖可顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬活性(p<0.05),增加細(xì)胞因子IL-1(p<0.05)和IL-12(p<0.05)的分泌量;50～200 mg/L阿魏側(cè)耳胞外多糖可顯著提高細(xì)胞NOS(p<0.05)和NO(p<0.05)的含量以及TNF-α的分泌量(p<0.05)。因此,一定濃度阿魏側(cè)耳胞外多糖對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞具有激活作用。

胞外多糖,熒光探針,一氧化氮合成酶,白細(xì)胞介素-1,白細(xì)胞介素-12

多糖廣泛分布于動(dòng)植物和微生物中,是自然界中含量最豐富的大分子化合物之一[1],根據(jù)在細(xì)胞中存在部位不同,多糖分為胞內(nèi)多糖、胞壁多糖和胞外多糖三種,與胞內(nèi)多糖不同,真菌胞外多糖易與菌體分離,可通過深層發(fā)酵獲得[2-3]。

阿魏側(cè)耳(Pleurotusferulaelanzi),是一種具有很高食藥用價(jià)值的擔(dān)子菌,具有抗腫瘤,提高免疫力[4-5]和延緩衰老等功效[6],阿魏側(cè)耳胞外多糖是從阿魏側(cè)耳液體發(fā)酵液中提取的多糖組分[3],目前對(duì)于阿魏側(cè)耳胞外多糖生物活性的研究局限在體內(nèi)研究階段[7],未有體外激活巨噬細(xì)胞及其機(jī)理的相關(guān)報(bào)道。本文利用建立的小鼠巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)體系,研究阿魏側(cè)耳胞外多糖對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬和細(xì)胞因子分泌等免疫功能的影響作用,為其在食品、藥品中的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

阿魏側(cè)耳(PleurotusferulaeLanzi)胞外多糖實(shí)驗(yàn)室制備[3];BALB/C小鼠動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2011-0011，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司;胎牛血清(FBS)上海生物工程有限公司;DMEM美國Gibco公司;脂多糖(LPS)美國Sigma公司;一氧化氮檢測試劑盒、一氧化氮DAF-FM DA探針碧云天生物技術(shù)有限公司;小鼠一氧化氮合成酶(NOS)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)和白細(xì)胞介素-12(IL-12)ELISA檢測試劑盒美國R&D公司;青霉素和鏈霉素山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司;實(shí)驗(yàn)中所用其他試劑均為分析純。

MCO-20AIC二氧化碳培養(yǎng)箱日本SONYA公司;FD-1D-50真空冷凍干燥機(jī)北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;ZHJH-C超凈工作臺(tái)上海智城分析儀器制造有限公司;BX50系統(tǒng)(熒光)顯微鏡(配有DP71成像系統(tǒng))、CKX41SF倒置顯微鏡日本Olympus公司;MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋日本SONYA公司;iMark酶標(biāo)儀美國Bio-Rad公司;Milli-Q超純水機(jī)美國Millipore公司。VCX130超聲波細(xì)胞破碎儀美國Sonics公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1多糖溶液的配制阿魏側(cè)耳胞外多糖用DMEM培養(yǎng)液溶解,0.22 μm針頭濾器過濾除菌后得濃度為2 g/L的阿魏側(cè)耳胞外多糖母液,冰箱中冷藏備用。

1.2.2小鼠巨噬細(xì)胞的獲得及多糖處理參考王晶等[7]方法。小鼠頸椎脫臼處死,75%酒精浸泡,注5 mL DMEM完全培養(yǎng)液(含10%體積分?jǐn)?shù)的胎牛血清)至腹腔,靜置5 min,超凈工作臺(tái)中無菌打開腹腔,收集腹腔液,1500 r/min 離心10 min,棄上清,DMEM完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并接種至培養(yǎng)皿中,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h,棄培養(yǎng)液,磷酸鹽緩沖溶液(PBS)漂洗去未貼壁細(xì)胞,胰蛋白酶消化,收集細(xì)胞,1500 r/min 離心10 min,棄上清,DMEM完全培養(yǎng)液重懸后得純化的小鼠巨噬細(xì)胞懸液。臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù),調(diào)整活細(xì)胞密度為5.0×105個(gè)/mL分別接種至培養(yǎng)皿或細(xì)胞培養(yǎng)板中,多糖處理組添加2 g/L的阿魏側(cè)耳胞外多糖母液,終濃度分別為0、25、50、100、200 mg/L,陽性對(duì)照組添加終濃度為20 μg/mL的LPS,置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3巨噬細(xì)胞吞噬能力檢測采用中性紅法[8]。按上述方法獲取、純化并接種巨噬細(xì)胞至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,接種量為200 μL。每組設(shè)10個(gè)重復(fù)孔。培養(yǎng)板用PBS 漂洗3次后,每孔添加終濃度0.075%中性紅溶液(無菌PBS配制)100 μL,置37 ℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h,吸棄上層溶液,PBS 漂洗后加入細(xì)胞裂解液(0.01 mol/L冰醋酸與無水乙醇混合液,體積比為1∶1)200 μL,4 ℃靜置過夜。酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光值A(chǔ)490 nm。

1.2.4巨噬細(xì)胞NO含量測定NO的生成采用熒光探針法檢測[9]。按照上述方法獲取、純化并接種巨噬細(xì)胞至載玻片(置于培養(yǎng)皿中),待細(xì)胞貼壁后,添加足量DMEM(含10% FBS)培養(yǎng)液。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。多糖處理24 h后,收集培養(yǎng)上清,離心后冰箱冷藏備用。取出載玻片,細(xì)胞面朝上,添加稀釋好的DAF-FM DA探針,37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。PBS洗滌細(xì)胞三次,充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DAF-FM DA探針,加蓋潔凈的蓋玻片后,熒光顯微鏡觀察拍照。

NO含量的測定采用Griess法[10]。依照試劑盒說明,酶標(biāo)板分設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔和待測樣品孔,標(biāo)準(zhǔn)孔依次加濃度分別為0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol/L標(biāo)準(zhǔn)品(NaNO2)溶液50 μL,空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(DMEM完全培養(yǎng)液)50 μL,樣品孔加不同處理組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清,各孔分別添加50 μL Griess Reagent Ⅰ及50 μL Griess Reagent Ⅱ。酶標(biāo)儀檢測540 nm處吸光值A(chǔ)540 nm,根據(jù)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中NO濃度。

1.2.5一氧化氮合成酶(NOS)含量測定按上述方法獲取、純化和接種細(xì)胞至培養(yǎng)皿中,接種量為5 mL。多糖處理24 h后,細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞,離心,棄上清,磷酸緩沖溶液(PBS)重懸,超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞(功率39 W;工作時(shí)間3 s,停止時(shí)間3 s,共50個(gè)循環(huán)),離心,收集上清,采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)[10]測定巨噬細(xì)胞內(nèi)NOS含量。

按照試劑盒說明,取出室溫平衡20 min后的板條,設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔和樣品孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL,樣品孔加待測樣品10 μL和40 μL樣品稀釋液,空白孔不加。除空白孔外,標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔中每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體100 μL,37 ℃溫育30 min。棄去液體,吸水紙拍干,洗滌液洗滌5次,吸水紙拍干,每孔加入底物A、B各50 μL,37 ℃避光孵育15 min后每孔加入終止液50 μL,酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處各孔A450 nm,根據(jù)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中NOS濃度。

1.2.6TNF-α、IL-1和IL-12含量測定采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)[11]。取出多糖處理后的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清,按照試劑盒說明操作(方法同1.2.5),根據(jù)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TNF-α、IL-1和IL-12含量。

2　結(jié)果與分析

2.1阿魏側(cè)耳胞外多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響

利用中性紅法檢測巨噬細(xì)胞吞噬功能,通過測定細(xì)胞內(nèi)中性紅的含量來反映巨噬細(xì)胞的吞噬能力。結(jié)果顯示(表1),培養(yǎng)體系中添加了阿魏側(cè)耳胞外多糖(25～200 mg/L)、LPS(20 mg/L)的巨噬細(xì)胞中,中性紅的含量顯著增加(p<0.05),表明,阿魏側(cè)耳胞外多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力有增強(qiáng)作用。

表1　阿魏側(cè)耳胞外多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響

注:“*”表示與空白對(duì)照組相比,差異顯著(p<0.05);表2、表3同。

2.2阿魏側(cè)耳胞外多糖對(duì)巨噬細(xì)胞NO和NOS含量的影響

巨噬細(xì)胞在免疫活化或外界信號(hào)刺激下,細(xì)胞內(nèi)可誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶基因被誘導(dǎo)表達(dá),催化精氨酸氧化成瓜氨酸并產(chǎn)生大量的NO[12]。DAF-FM DA是最新一代用于NO定量檢測的熒光探針[13],能夠進(jìn)入細(xì)胞并被細(xì)胞內(nèi)酯酶催化形成不能穿過細(xì)胞膜的DAF-FM。DAF-FM本身僅有很弱的熒光,但和細(xì)胞內(nèi)NO反應(yīng)后可以產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光[14]。熒光結(jié)果顯示(圖1),對(duì)照組和添加25 mg/L阿魏側(cè)耳胞外多糖組的巨噬細(xì)胞內(nèi)的熒光較弱,說明兩組巨噬細(xì)胞可能沒有產(chǎn)生NO,細(xì)胞內(nèi)的熒光是DAF-FM自發(fā)熒光。而添加50～200 mg/L阿魏側(cè)耳胞外多糖、20 mg/L LPS的巨噬細(xì)胞內(nèi)綠色熒光的強(qiáng)度和平均光密度明顯增強(qiáng)(p<0.05)(見圖1C～F和圖2),表明,添加50～200 mg/L的阿魏側(cè)耳胞外多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生了NO。

圖1　NO熒光探針標(biāo)記的小鼠巨噬細(xì)胞(200×)Fig.1　Murine macrophage stained by fluorescence probe for NO(200×)注:A,空白對(duì)照組;B～E,25、50、100、200 mg/L阿魏側(cè)耳胞外多糖處理組;F,20 mg/L LPS處理組。

圖2　小鼠巨噬細(xì)胞中NO熒光探針的平均光密度值Fig.2　Mean optical density of fluorescence probe for NO in murine macrophage注:“*”,表示與對(duì)照組相比,差異顯著(p<0.05)。

表2　阿魏側(cè)耳胞外多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞胞外NO和NOS含量的影響

2.3阿魏側(cè)耳胞外多糖對(duì)巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1和IL-12分泌量的影響

表3　阿魏側(cè)耳胞外多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞多種細(xì)胞因子分泌量的影響

正常巨噬細(xì)胞(又稱為常駐巨噬細(xì)胞)處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài),很少甚至不分泌細(xì)胞因子,可在抗原刺激下發(fā)生活化,轉(zhuǎn)變成炎癥巨噬細(xì)胞,表現(xiàn)為對(duì)病原體和腫瘤細(xì)胞殺傷活性增強(qiáng)、分泌大量細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-1、IL-12)等生物活性的變化[16-18]。TNF-α是由巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種多效細(xì)胞因子,它具有殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞、提高機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)功能、提高中性粒細(xì)胞的吞噬活性以及抗感染等功效;IL-1主要由活化的單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,可活化胸腺細(xì)胞和T細(xì)胞,促進(jìn)B細(xì)胞增殖和抗體的分泌,調(diào)節(jié)機(jī)體免疫能力;IL-12 由B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生,具有激活NK細(xì)胞、刺激T細(xì)胞增殖等作用[19]。由表3可知,隨著阿魏側(cè)耳胞外多糖添加量的增加,TNF-α、IL-1、IL-12三種細(xì)胞因子的分泌量均呈上升趨勢(shì)。其中,添加量25～200 mg/L的胞外多糖可顯著提高小鼠巨噬細(xì)胞IL-1和IL-12的分泌量(p<0.05)。添加量50～200 mg/L的胞外多糖可顯著增加小鼠巨噬細(xì)胞TNF-α的分泌量(p<0.05)。表明,一定添加量的的阿魏側(cè)耳胞外多糖可活化小鼠巨噬細(xì)胞,誘導(dǎo)其產(chǎn)生更多的TNF-α、IL-1、IL-12等促炎細(xì)胞因子。

3　結(jié)論

本文采用原代培養(yǎng)技術(shù)獲得大量小鼠巨噬細(xì)胞,建立了其體外培養(yǎng)體系,并利用這一體系研究了阿魏側(cè)耳胞外多糖對(duì)體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的激活作用。根據(jù)中性紅實(shí)驗(yàn)、Griess實(shí)驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn),可知添加一定濃度的阿魏側(cè)耳胞外多糖可增強(qiáng)小鼠的吞噬能力,提高巨噬細(xì)胞NOS和NO的含量,增加免疫相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α、IL-1和IL-12的分泌量。由此可見,從阿魏側(cè)耳液體發(fā)酵液中獲得的胞外多糖具有激活巨噬細(xì)胞并增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫的功能,這為阿魏側(cè)耳液體發(fā)酵液的進(jìn)一步開發(fā)利用具有一定的指導(dǎo)意義。

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Activation effects of extracellular polysaccharides produced byPleurotusferulaeLanzi on murine macrophage

WANG Jing1，2，3,ZHANG Chun-dan1,YANG Li-min1,XIE Chun-yan1，2，3, DU Juan1，2，3,YAN Xun-you1，2，3,WU Zhi-yan1，2，3，*

(1.College of Life Sciences,Langfang Teachers University,Langfang 065000,China; 2.Edible and Medicinal Fungi Research and Development Center of Hebei Universities,Langfang 065000,China; 3.Edible Fungi Key Laboratory of Langfang City,Langfang 065000,China)

The culture system of macrophages was established to investigate the activation effects of extracellular polysaccharides produced byPleurotusferulaeLanzi(IPP)on murine macrophage. Murine macrophages were cultured in sterile environment. Phagocytic activity,the content of nitric oxide synthetase(NOS)and nitric oxide(NO),the levels of tumor necrosis factor-α(TNF-α),interleukin-1(IL-1),and interleukin-12(IL-12)in culture supernatant were examined with neutral red phagocytosis test,fluorescein labeled probe technique,griess reaction and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA),respectively. The results showed that IPP in the range of 25～200 mg/L reduced absorbance of neutral red in cytoplasm(p<0.05),improved the secretion level of IL-1(p<0.05)and IL-12(p<0.05)in culture supernatant. And IPP in the range of 50～200 mg/L increased the content of NOS(p<0.05)and NO(p<0.05),and the secretion level TNF-α(p<0.05). So murine macrophages culturedinvitrocould be activated by IPP at a certain concentration.

extracellular polysaccharides;fluorescein labeled probe;nitric oxide synthase;interleukin-1;interleukin-12

2015-10-09

王晶(1983-)，女，博士，講師，研究方向：動(dòng)物細(xì)胞工程和生物活性物質(zhì)，E-mail:oucflora@163.com。

吳智艷(1962-)，女，教授，研究方向：食用菌栽培與深加工，E-mail:lfwuzhiyan@126.com。

河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究青年基金項(xiàng)目(QN2016019)；河北省高等學(xué)?？茖W(xué)研究計(jì)劃優(yōu)秀青年基金項(xiàng)目(YQ2013027)；河北省高校食藥用菌應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心項(xiàng)目(YF201411-321)；河北省高等學(xué)校遺傳學(xué)重點(diǎn)發(fā)展學(xué)科項(xiàng)目(201221)；廊坊師范學(xué)院微生物學(xué)重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目(201501)；廊坊師范學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510100036)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)10-0356-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.065