蘇　鶴,楊瑞金,趙　偉,華　霄,張文斌

(1.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122;2.食品科學與技術(shù)國家重點實驗室,江蘇無錫 214122)

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紫薯花色苷的超濾和樹脂聯(lián)用純化工藝

蘇鶴1,楊瑞金2,*,趙偉1,華霄1,張文斌1

(1.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122;2.食品科學與技術(shù)國家重點實驗室,江蘇無錫 214122)

利用超濾和大孔樹脂聯(lián)用的方法對紫薯花色苷粗提液進行了純化,考查了不同截留分子量超濾膜對花色苷粗提液的純化效果。結(jié)果表明:截留分子量為10 ku的膜可有效透過花色苷和截留大分子物質(zhì),花色苷的透過率為86.54%,蛋白質(zhì)截留率為93.67%,透過液的可溶性固形物含量降低了14.29%,透光率提高了23.78%。通過對6種不同極性的大孔吸附樹脂對超濾透過液中花色苷的吸附及解吸能力的考查,發(fā)現(xiàn)LS-305的吸附性能較好。其動態(tài)吸附及解吸條件為:上樣流速5.2 BV/h,上樣量35 BV;60%乙醇洗脫體積為9 BV可洗脫完全?；ㄉ债a(chǎn)品色價由純化前的1.59提高到純化后的32.89。HPLC分析表明超濾和樹脂聯(lián)用純化方法未對紫薯花色苷成分造成影響。

紫薯,花色苷,超濾,大孔樹脂,純化

近年來,由于合成色素的安全性受到質(zhì)疑,因此天然色素的開發(fā)及應用越來越受到社會關(guān)注[1-3]?；ㄉ沼捎谄渖珴甚r亮自然,無毒無害,并且具有保健作用,可作為一種天然水溶性色素而受到廣泛的關(guān)注[4-5]?；ㄉ諒V泛存在于植物的根、莖、葉、花和果實中,它是花青素與一個或者多個糖分子通過糖苷鍵結(jié)合而形成的化合物。葡萄、草莓、櫻桃、藍莓、紫薯等都含有花色苷,但由于紫薯產(chǎn)量高,易栽培,花色苷含量高,成為獲取天然花色苷色素的理想原料[6]。

天然花色苷類色素色澤亮麗,安全性高,然而生產(chǎn)成本高和穩(wěn)定性差,兩者是制約天然花色苷類色素商品化和產(chǎn)業(yè)化的“瓶頸”[7],因而開發(fā)一條成本低、安全性高、可工業(yè)化的工藝路線很有意義。紫薯花色苷色素為水溶性,通常采用溶劑法提取,然而溶劑法提取得到粗提液中含有較多的雜質(zhì),如蛋白質(zhì)、糖、淀粉等,極大的影響了花色苷的品質(zhì)和穩(wěn)定性,需要對其進行純化[8]。超濾是一種膜分離技術(shù),能耗小,不發(fā)生相變,整個過程是連續(xù)的,安全有效,可以除去提取液中的大分子物質(zhì),同時避免花色苷的變性和損失,保證天然色素的活性[9]。因而可將超濾技術(shù)運用于紫薯花色苷粗提液進行初步純化。大孔樹脂吸附法具有選擇性好、吸附容量大等優(yōu)點,因此在天然產(chǎn)物工業(yè)化提取分離中應用廣泛[10]。經(jīng)過超濾的初步純化再經(jīng)大孔樹脂進一步精制可得到純化的花色苷。

本文研究了超濾和大孔樹脂聯(lián)用對紫薯花色苷粗提液進行純化的工藝,確定其最佳工藝條件,旨在為紫薯花色苷色素的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

紫薯購自無錫當?shù)厥袌?大孔樹脂AB-8、LS-303、LS-305陜西藍深特種樹脂有限公司;大孔樹脂D101、NKA-Ⅱ、DM130鄭州勤實科技有限公司。

UV-1100 分光光度計上海美譜達儀器有限公司;SHA-2A型冷凍水浴恒溫振蕩器江蘇金壇億通電子有限公司;Pellicon切向流超濾系統(tǒng)美國密理博公司;SHZ-D(III)型循環(huán)水式真空泵鞏義市予華儀器有限責任公司;RV 10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀德國IKA-Werke公司;101-1-BS電熱恒溫鼓風干燥箱上海躍進醫(yī)療器械廠;BS2202 S和BS 224 S精密天平賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;QYC-2102 全溫培養(yǎng)搖床上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;FE20實驗室pH計梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;WYA-2W雙目阿貝折光儀上海索光光電技術(shù)有限公司;BS-100A 自動部分收集器、HL-2B 恒流泵上海滬西儀器設備廠;超高效液相色譜儀:Waters Acquity UPLC型美國Waters公司。

1.2實驗方法

1.2.1紫薯花色苷提取工藝流程鮮紫薯→清洗、去皮→切成3～4 mm厚的片狀→檸檬酸溶液浸提(檸檬酸濃度為1.6%,溫度60 ℃,料液比為1∶10,振蕩提取2 h)→200目濾布過濾→花色苷粗提取液。

1.2.2理化指標的測定總糖含量的測定采用苯酚-硫酸法[11];蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍法[12];花色苷含量的測定采用pH示差法[13];可溶性固形物使用阿貝折光儀直接測定。透光率采用670 nm下的透光率值[14]。

1.2.3超濾滲透通量及效果的測定分別使用截留分子量為10、5、3、1 ku的超濾膜對紫薯花色苷提取液進行膜分離,操作條件為:室溫,壓力為1.379×105Pa。每次操作得到同樣體積透過液,測定各膜超濾過程中滲透通量的變化,并測定各膜對蛋白質(zhì)截留率、總糖截留率、花色苷透過率及透過液中固形物含量和透光率的變化。

滲透通量是指一定操作條件下,每單位時間內(nèi)水或溶液通過單位膜面積的透過量:

J=V/At

式中:J為滲透通量(L/m2·h);V表示透過液的體積(L);A為超濾膜面積,均為0.1 m2;t表示透過所需的時間(h)[15]。

1.2.4大孔樹脂進一步精制花色苷

1.2.4.1大孔樹脂的預處理選取6種不同極性的大孔吸附樹脂,其中D101為非極性,NKA-Ⅱ為極性,AB-8、LS-303、LS-305和DM130為弱極性,將所需大孔樹脂經(jīng)無水乙醇浸泡24 h后,用去離子水洗至中性,備用。

1.2.4.2大孔樹脂的篩選-吸附與解吸性能準確稱取經(jīng)過預處理的濕樹脂0.50 g,置于250 mL錐形瓶中,加入100 mL花色苷超濾后透過液,在20 ℃、120 r/min下,搖床中振搖24 h至樹脂充分吸附飽和,測定吸附前后花色苷的濃度。另稱取充分吸附飽和的樹脂0.50 g,加入100 mL 60%乙醇溶液在20 ℃、120 r/min下解吸24 h,測定解吸前后花色苷的濃度。各樹脂的吸附率(A)、吸附量(qe)、解吸率(D)和解吸量(qd)分別按式(1)～(4)計算:

(1)

(2)

(3)

(4)

其中:C0、Ce-吸附前和吸附后提取液中花色苷的濃度(mg/L);Vi-加入的花色苷提取液的體積(mL);m-樹脂的質(zhì)量(g);Cd-解吸液中花色苷的濃度(mg/L);Vd-解吸液的體積(mL)。

1.2.4.3大孔樹脂LS-305吸附動力學稱取大孔樹脂0.50 g,置于250 mL錐形瓶中,加入100 mL花色苷超濾后透過液,在20 ℃、120 r/min下,搖床中振搖進行吸附,每1 h取樣0.5 mL測定花色苷濃度,直至吸附平衡。繪制花色苷的靜態(tài)吸附動力學曲線。

1.2.4.4解吸液乙醇濃度的選擇稱取已經(jīng)吸附飽和的大孔樹脂若干份,每份0.50 g,分別加入100 mL體積分數(shù)為30%、40%、50%、60%、70%和80%乙醇溶液作為解吸液,20 ℃、120 r/min振搖12 h至解吸達到平衡,測定其花色苷濃度,計算解吸率。

1.2.4.5大孔樹脂LS-305動態(tài)泄露曲線將經(jīng)過預處理的LS-305濕樹脂濕法上柱,用5倍柱體積的去離子水沖洗柱子[16],分別以1.0、1.5、2.0 mL/min流速將紫薯花色苷超濾后透過液通過樹脂柱,每10 mL分管收集流出液,測定各管中溶液的花色苷濃度,以流出液體積和流出液中花色苷濃度作圖,繪制不同上樣流速下LS-305樹脂的動態(tài)吸附泄露曲線。

1.2.4.6大孔樹脂LS-305洗脫曲線將吸附花色苷至飽和的LS-305樹脂柱,用去離子水洗至流出液無色,再用60%的乙醇溶液進行洗脫,將洗脫流速分別設置為 1.0、1.5、2.0 mL/min,每10 mL收集一管,測定其中花色苷的濃度,以洗脫液體積和洗脫液中花色苷濃度作圖,繪制不同洗脫流速下LS-305樹脂的動態(tài)洗脫曲線。

1.2.5花色苷產(chǎn)品色價的測定將經(jīng)過超濾和大孔樹脂純化后收集所得洗脫液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇,所得濃縮液經(jīng)冷凍干燥得純化后的花色苷樣品。準確稱取0.05 g左右干燥后的花色苷樣品,用pH為3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液溶解并定容至100 mL,在520 nm波長下測定樣品的吸光值,由下式計算色價:

色價=A/m

式中:A-吸光值;m-稱取的花色苷樣品質(zhì)量(g)。

1.2.6HPLC對純化前后花色苷成分的分析精確稱取經(jīng)超濾和大孔樹脂純化后制備的花色苷色素樣品,配制成35 mg/mL的溶液。色譜條件:采用BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色譜柱;以乙腈為流動相A,2%甲酸為流動相B,梯度洗脫:梯度洗脫:0～0.1 min,2% A,0.1～20 min,2%～20% A,20～25 min,20%～80% A,25～26 min,80%～2% A。流速0.3 mL/min,進樣量1 μL,檢測波長為花色苷的特征吸收波長520 nm。

2　結(jié)果與分析

2.1紫薯花色苷粗提液成分分析

超濾前紫薯花色苷粗提液成分如表1所示。由表1可知,粗提取液中含有較多的蛋白質(zhì)和糖類雜質(zhì),透光率不高,需要對其進行進一步純化。

表1　紫薯花色苷粗提液成分

2.2超濾膜的選擇

截留分子量為10、5、3和1 ku的超濾膜的滲透通量和對蛋白質(zhì)截留率、總糖截留率、花色苷透過率及固形物含量、透光率的變化結(jié)果分別如圖1和表2所示。由圖1可以看出,隨著時間的延長,各膜的滲透通量先減小然后趨于穩(wěn)定。由表2可以看出,超濾對于蛋白質(zhì)能夠有效截留,而對于分子量相對較小的糖類的去除率較低;超濾后溶液的固形物含量均降低,透光率大大增加,所得透過液澄清透明。以上結(jié)果表明,截留分子量為10 ku的超濾膜通量大,且能有效脫除大部分的膠質(zhì)、蛋白等大分子,提高花色苷溶液的澄清度。

圖1　不同超濾膜的滲透通量隨時間的變化Fig.1　The change of permeation flux of different ultrafiltration membrane

2.3樹脂的篩選及吸附與解吸性能的測定

6種大孔吸附樹脂對紫薯花色苷的吸附率、解吸率和吸附量與解吸量如圖2(A和B)所示。由圖2(A)可知,LS-305大孔樹脂對紫薯花色苷的吸附率與解吸率均最高,因此可選用LS-305樹脂對花色苷進行后續(xù)吸附分離實驗。通過圖2(B)可得LS-305對花色苷的吸附量達(10.64±0.01)mg/g濕樹脂,解吸量達到(10.35±0.03)mg/g濕樹脂。紫薯花色苷分子結(jié)構(gòu)中含有較多的羥基和糖苷鏈,具有一定的極性,LS-305本身是弱極性樹脂,與花色苷極性最為相近,在吸附過程中最易于和花色苷結(jié)合[17]。

表2　不同超濾膜對花色苷提取液的超濾效果

圖2　不同樹脂對花色苷的吸附與解析性能Fig.2　Absorption and desorption capabilities of macroporous resins to anthocyanins

2.4大孔樹脂LS-305的吸附動力學曲線

LS-305對花色苷的吸附動力學曲線如圖3所示。由圖3可知,吸附量隨著吸附時間的延長而增加,當吸附時間達到6 h后吸附量緩慢增加,逐漸趨于平衡。

2.5解吸液乙醇濃度的選擇

不同乙醇濃度的解吸液對花色苷的解吸效果如圖4所示。由圖4可知,隨著乙醇體積分數(shù)的增大,解吸率呈現(xiàn)先增大再減小的趨勢,當乙醇濃度為60%時達到最大值。這可能是由于乙醇體積分數(shù)增大,溶液極性不斷減小的原因,在60%時的極性與花色苷最為接近,因此對花色苷的解吸效果最好[10]。

圖3　大孔樹脂LS-305的吸附動力學曲線Fig.3　Static absorption dynamics curve of macroporousresins to anthocyanins

圖4　不同乙醇濃度解吸液對花色苷的解吸率影響Fig.4　Effect of ethanol concentration on desorption ratio of macroporous resins

2.6LS-305的動態(tài)吸附泄露和動態(tài)洗脫曲線

2.6.1LS-305的動態(tài)吸附泄露曲線LS-305的動態(tài)泄露曲線如圖5所示。當流出液濃度達到上樣原液濃度的10%時可視為動態(tài)泄漏點,以泄漏點出現(xiàn)最遲的吸附流速為宜[18]。由圖5可看出,當流速越快,泄漏點出現(xiàn)的越早,由于流速越快導致樣液與花色苷接觸時間短,不能夠及時吸附導致泄露。為了保證最佳的吸附效果,可選擇1.0 mL/min(5.2 BV/h)的流速。在此條件下上樣體積達到400 mL即35 BV時達到泄露點,可停止上樣,吸附量為6.26 mg/g濕樹脂。

圖5　不同上樣流速下的動態(tài)吸附泄露曲線Fig.5　Breakthrough curve of dynamic adsorption under different flow rate

2.6.2LS-305的動態(tài)洗脫曲線LS-305的動態(tài)洗脫曲線如圖6所示。由圖6可看出,當流速為1 mL/min時,洗脫液的峰值濃度最高,峰型較窄;隨著流速的升高,峰值濃度下降,且洗脫速度較慢。由于當流速為1 mL/min時,洗脫的花色苷量較多且較為集中,容易收集,因此選擇較慢的洗脫流速1 mL/min較好。在此條件下,洗脫體積為100 mL左右(9 BV)時,可基本將吸附的花色苷洗脫完全。

圖6　不同流速下的動態(tài)洗脫曲線Fig.6　Dynamic desorption curve under different elution rate

2.7純化花色苷產(chǎn)品分析

2.7.1純化花色苷產(chǎn)品色價未經(jīng)過純化的花色苷粗提取液經(jīng)過凍干后很黏,粘結(jié)成塊狀,不成粉狀顆粒,色價僅為1.59。經(jīng)過超濾和大孔吸附樹脂純化后的花色苷提取液經(jīng)過凍干后呈細小粉狀顆粒,粘度較小,色價為32.89,比原來提高了20.69倍。

2.7.2純化前后花色苷成分對比圖7是花色苷粗提液(A)及純化后(B)的HPLC圖。由圖7(A)和(B)對比可以看出,紫薯花色苷主要由12種不同結(jié)構(gòu)類型的花色苷成分組成,純化前后花色苷的成分類型未發(fā)生明顯變化,因此經(jīng)過超濾和大孔樹脂聯(lián)用的純化工藝未對紫薯花色苷的成分造成影響。

圖7　花色苷粗提液(A)及純化后(B)的HPLC圖Fig.7　HPLC chromatogram of purple sweet potato anthocyanins before(A)and after(B)purification注:檢測波長為花色苷的特征吸收波長520 nm。

3　結(jié)論

對紫薯花色苷的純化工藝進行了研究,結(jié)果表明,截留分子量10 ku超濾膜可有效透過花色苷和截留蛋白質(zhì)等大分子雜質(zhì)?；ㄉ胀高^率為86.54%,對蛋白質(zhì)截留率為93.67%。透過液透光率提高了23.78%,可溶性固形物含量降低了14.29%。透過液用大孔樹脂LS-305樹脂柱進一步進行吸附分離,然后用60%乙醇溶液洗脫,最后再經(jīng)濃縮和冷凍干燥后,得到色價為32.89的花色苷產(chǎn)品。經(jīng)過HPLC分析,花色苷的主要成分未發(fā)生變化。以上結(jié)果表明,超濾和大孔樹脂聯(lián)用的純化方法可以制得較高色價的紫薯花色苷產(chǎn)品。

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Purification of anthocyanins from purple sweet potato by combination of ultrafiltration and macroporous resin

SU He1,YANG Rui-jin2,*,ZHAO Wei1,HUA Xiao1,ZHANG Wen-bin1

(1.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China; 2.State Key Laboratory of Food Science & Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The anthocyanins extract from purple sweet potato was purified using ultrafiltration and macroporous resin. The effect of different molecular weight cutoff(MWCO)ultrafiltration membranes to remove the macromolecular substances was investigated. The results showed that the 10 ku membrane could effectively remove the macromolecular substances in the extract. The protein entrapment rate was 93.67%,and the anthocyanins through rate was 86.54%. The soluble solids content was reduced by 14.29%,and light transmittance increased by 23.78%. The adsorption and desorption ability for anthocyanins of six kind of macroporous resins were evaluated. It turned out that LS-305 was the most suitable resin for anthocyanins. The dynamic adsorption and desorption conditions as follows:flow rate of 5.2 bed volume(BV)/h,the sample volume of 35 BV,60% ethanol used to elute the anthocyanins,and volume of 9 BV could elute anthocyanins completely. As a result,the color value of the anthocyanins from purple sweet potato increased from 1.59 to 32.89 after purification. HPLC analysis showed that ultrafiltration and macroporous resin did not affect the anthocyanins component.

purple sweet potato;anthocyanins;ultrafiltration;macroporous resin;purification

2015-11-27

蘇鶴(1990-),女,碩士,研究方向:食品加工與配料,E-mail:suhe0719@163.com。

楊瑞金(1964-),男,博士,教授,研究方向:食品加工新技術(shù),E-mail:yrj@jiangnan.edu.cn。

中央高校基本科研業(yè)務費專項資金資助(JUSRP51501)。

TS255.1

A

1002-0306(2016)10-0268-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.046