任興晨,茅林春,苑佳佳,盧文靜

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310058)

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低溫堿性脂肪酶型時(shí)間-溫度指示劑的研究

任興晨,茅林春*,苑佳佳,盧文靜

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310058)

利用堿性脂肪酶催化三乙酸甘油酯分解導(dǎo)致pH降低,以酸堿指示劑顯示顏色變化,研究并確定低溫環(huán)境的TTI(時(shí)間溫度指示劑)的反應(yīng)體系及基本特性。該時(shí)間溫度指示劑(25 mL)的反應(yīng)體系為:5 mL三乙酸甘油酯∶20 g/L聚乙烯醇乳化液(v∶v=1∶19,均質(zhì)10000 r/min,每次3 min,間隔5 min,共兩次)、19.50 mL 0.05 mol/L pH10.60 Gly-NaOH緩沖液、0.05 mL 1 g/L堿性脂肪酶液、0.25 mL 0.10 mol/L CaCl2溶液、0.20 mL百里香酚藍(lán)-酚酞-百里酚酞混合指示劑。通過測定反應(yīng)體系在不同溫度下的pH下降速率,最終確定該反應(yīng)體系的Ea為60.14 kJ/mol。該反應(yīng)體系可應(yīng)用于監(jiān)測低溫環(huán)境下食品中酶反應(yīng)或脂肪分解的程度,間接判斷對應(yīng)食品的品質(zhì)狀況。

時(shí)間溫度指示劑,堿性脂肪酶,反應(yīng)體系,活化能

食品質(zhì)量的變化程度在很大程度上取決于食品貯運(yùn)時(shí)間的長短和所處環(huán)境溫度的高低[1]。時(shí)間溫度指示劑(time-temperature indicator,簡稱TTI)貼附在食品包裝上,和食品經(jīng)歷了相同的溫度歷史效應(yīng),通過產(chǎn)生簡單的機(jī)械形變或顏色變化來指示食品在流通過程中經(jīng)歷的時(shí)間和實(shí)際溫度的雙重效應(yīng),從而監(jiān)測食品質(zhì)量變化和剩余貨架期[2-3]。它可以應(yīng)用于易變質(zhì)食品的物流中,監(jiān)測食品從生產(chǎn)到銷售全部或部分溫度歷史,以確保食品品質(zhì)安全。

國際上已開展TTI的研制,并在牛奶[4]、冷凍魚[5]、冷凍肉[6]、冷凍漢堡[7]、冷藏水果及蔬菜[8]上進(jìn)行了應(yīng)用性研究。根據(jù)TTI的工作原理可以分為:酶型、微生物型、聚合物型、電子型、擴(kuò)散型等[9]。其中酶型TTI原理簡單,易于控制[3]。脂肪酶為甘油三酯水解酶,能夠逐步將甘油三酯水解成甘油二酯、甘油單酯、甘油和脂肪酸[10],使反應(yīng)體系pH降低,其來源廣泛,價(jià)格低廉。

現(xiàn)有報(bào)道的脂肪酶型TTI反應(yīng)體系是在20 ℃條件下研究確定的[11],其反應(yīng)體系在冷藏溫度下的適用性還無法確定。為了確保TTI在食品冷藏溫度下的適用性,本實(shí)驗(yàn)研究了4 ℃條件下的堿性脂肪酶TTI反應(yīng)體系,基本確定了底物種類、乳化處理、金屬離子、底物濃度、pH指示劑等關(guān)鍵組分。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

LVK-F100型堿性脂肪酶(20000 U/g)深圳市綠微康生物工程有限公司;三乙酸甘油酯、三丁酸甘油酯、三油酸甘油酯、聚乙烯醇124、氯化鈉、氯化鈣、氯化鉀、氯化鎂、酚酞、百里酚酞、酚紅、百里香酚藍(lán)、氫氧化鈉、甘氨酸國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

FSH-2A FS-2型可調(diào)分散器金壇市科析儀器有限公司;MIR-254型培養(yǎng)箱日本SANYO公司;CR-200型色差計(jì)日本KONICA MINOLTA公司;FE20型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)瑞士METTLER TOLEDO公司。

1.2反應(yīng)體系的確定

1 g/L堿性脂肪酶液:稱取0.10 g堿性脂肪酶,用Gly-NaOH緩沖液定容至100 mL,靜置1 h,過濾取濾液,4 ℃下保存。

酚紅-酚酞-百里酚酞混合指示劑:稱取0.10 g酚紅,0.50 g酚酞,0.20 g百里酚酞,溶于100 mL 60%乙醇中,靜置12 h后抽濾。

百里香酚藍(lán)-酚酞-百里酚酞混合指示劑:稱取0.10 g百里香酚藍(lán),0.30 g酚酞,0.10 g百里酚酞,溶于100 mL 50%乙醇中,靜置12 h后抽濾。

1.2.2反應(yīng)底物的確定分別取0.25 mL三乙酸甘油酯、三丁酸甘油酯、三油酸甘油酯,與4.75 mL 20 g/L聚乙烯醇(PVA)混合,用可調(diào)分散器乳化兩次,轉(zhuǎn)速10000 r/min,每次3 min,間隔5 min[12]。分別在三種乳化液中加入19.50 mL 0.05 mol/L pH10.60 Gly-NaOH緩沖液,在4 ℃下預(yù)冷10 min,加入0.05 mL 1 g/L堿性脂肪酶液,放置在4 ℃恒溫箱,每隔4 h用pH計(jì)測pH。

1.2.3乳化處理參數(shù)的確定底物和乳化劑分3組處理:第1組0.25 mL三乙酸甘油酯加入4.75 mL 20 g/L PVA混合,10000 r/min均質(zhì),每次3 min,間隔5 min,共兩次;第2組0.25 mL三乙酸甘油酯加入4.75 mL 20 g/L PVA,不均質(zhì);第3組0.25 mL三乙酸甘油酯加入4.75 mL 0.05 mol/L pH10.60 Gly-NaOH緩沖液[11]。反應(yīng)體系同1.2.2,放置在4 ℃恒溫箱中,每隔4 h測pH。

1.2.4金屬離子對TTI反應(yīng)體系的影響 三乙酸甘油酯與PVA按1∶19(v∶v)混合后均質(zhì)(10000 r/min,每次3 min,間隔5 min,共兩次),取5 mL乳化液分別加入到五組19.50 mL 0.05 mol/L pH10.60 Gly-NaOH緩沖液中,對照組中加入0.25 mL 0.05 mol/L pH10.60 Gly-NaOH緩沖液,4個(gè)實(shí)驗(yàn)組中分別加入0.25 mL 0.10 mol/L CaCl2、NaCl、KCl、MgCl2溶液,其余反應(yīng)條件同1.2.2,每隔4 h測pH。

1.2.5底物濃度的選擇底物含量配比見表1,反應(yīng)條件同1.2.2,每隔4 h測pH。

表1　底物含量配比

1.2.6pH指示劑的確定0.25 mL三乙酸甘油酯與4.75 mL PVA混合均質(zhì)(10000 r/min,每次3 min,間隔5 min,共兩次),再加入19.50 mL緩沖液,0.05 mL酶液,0.25 mL 0.10 mol/L CaCl2溶液,分別加入0.20 mL酚紅-酚酞-百里酚酞混合指示劑、百里香酚藍(lán)-酚酞-百里酚酞混合指示劑。4 ℃下每隔4 h測pH,并用色差計(jì)測定反應(yīng)液色澤。

第二,醫(yī)護(hù)人員全面了解抗菌藥物的相關(guān)知識,如藥效、藥動力學(xué)、適應(yīng)癥、禁忌癥、使用方法、可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)等,掌握不同抗菌藥物的藥理作用,根據(jù)患者實(shí)際病情,選擇性用藥。

1.3TTI反應(yīng)體系動力學(xué)參數(shù)的測定

目前對時(shí)間溫度指示劑的動力學(xué)參數(shù)Ea研究報(bào)道的只有Arrenhenius模型,即lnK=lnKA-Ea/(R×T)[13-14]。本實(shí)驗(yàn)通過在不同溫度下測量體系的pH,得到pH下降速率K進(jìn)而求得Ea值。25 mL反應(yīng)體系:0.25 mL三乙酸甘油酯與4.75 mL 20 g/L PVA混合均質(zhì)(10000 r/min,每次3 min,間隔5 min,共兩次)、19.50 mL 0.05 mol/L pH10.60 Gly-NaOH緩沖液、0.05 mL 1 g/L堿性脂肪酶液、0.25 mL 0.10 mol/L CaCl2溶液、0.20 mL百里香酚藍(lán)-酚酞-百里酚酞混合指示劑。將反應(yīng)體系分別置于4、10、15、20、25 ℃下,每隔4 h測pH。

1.4數(shù)據(jù)處理

全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Origin 8.1進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差;并使用SPSS 19.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2　結(jié)果與討論

2.1TTI反應(yīng)體系的確定

2.1.1底物的選擇脂肪酶為甘油三酯酶[10],因此本實(shí)驗(yàn)底物從三種常見的甘油三酯中選擇。三丁酸甘油酯和三油酸甘油酯乳化后溶液呈白色,上層漂浮微小油滴。與三乙酸甘油酯組pH變化(100%)相比,三丁酸甘油酯和三油酸甘油酯pH相對變化幅度分別為29.30%、16.28%,這兩種反應(yīng)體系pH下降幅度小、速度慢;三乙酸甘油酯乳化后為透明均一液體,pH從10.46下降到8.31,pH跨度廣(圖1)。三乙酸甘油酯反應(yīng)體系pH呈現(xiàn)出指數(shù)變化規(guī)律,將曲線用指數(shù)函數(shù)擬合,擬合系數(shù)為0.9635,pH呈現(xiàn)出良好的時(shí)間相關(guān)性。因此,選擇三乙酸甘油酯作為TTI反應(yīng)體系的底物。

圖1　三乙酸甘油酯反應(yīng)體系pH-時(shí)間關(guān)系圖Fig.1　pH-time relationship of triacetin reaction system

2.1.2乳化處理的效果各反應(yīng)體系pH均呈現(xiàn)指數(shù)變化的規(guī)律,將各曲線用指數(shù)函數(shù)擬合,不加乳化劑不均質(zhì)組、加乳化劑不均質(zhì)組、加乳化劑并均質(zhì)組的擬合系數(shù)分別為:0.9449、0.9410、0.9624,不加乳化劑不均質(zhì)組與加乳化劑不均質(zhì)組的擬合系數(shù)無顯著差異(p=0.066),加乳化劑并均質(zhì)組與其他兩組的擬合系數(shù)具有顯著差異(p<0.01),加乳化劑并均質(zhì)組的擬合程度顯著高于其他組,pH與時(shí)間相關(guān)性好。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇加乳化劑并均質(zhì)處理,處理參數(shù)為10000 r/min,每次3 min,間隔5 min,共兩次。

圖2　乳化處理對反應(yīng)體系pH的影響Fig.2　Effect of emulsification on pH value of reaction system

2.1.3金屬離子的選擇有文獻(xiàn)報(bào)道[15],Na+能降低反應(yīng)體系界面電荷效應(yīng)的抑制作用,提高酶活力。1 mmol/L K+、Mg2+、Ca2+可以增強(qiáng)脂肪酶活力[16]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各實(shí)驗(yàn)組pH差別較小,根據(jù)圖像無法判斷金屬離子對反應(yīng)體系的影響(圖3)。

圖3　金屬離子對反應(yīng)體系pH的影響Fig.3　Effect of metal ions on pH value of reaction system

反應(yīng)60 h內(nèi),pH隨時(shí)間的變化呈現(xiàn)出指數(shù)變化的規(guī)律,將各曲線用指數(shù)函數(shù)進(jìn)行擬合[17]。對照、Na+、K+、Mg2+、Ca2+反應(yīng)體系擬合系數(shù)分別為0.9683、0.9669、0.9679、0.9673、0.9838。對照組、Na+、K+、Mg2+實(shí)驗(yàn)組的擬合系數(shù)兩兩之間無顯著差異,Ca2+實(shí)驗(yàn)組與其他各組均有顯著差異(p<0.01),Ca2+實(shí)驗(yàn)組的擬合程度顯著高于其余實(shí)驗(yàn)組,所以金屬離子選擇Ca2+。

2.1.4底物濃度的確定如圖4所示,五組不同底物濃度的反應(yīng)體系中e組pH變化最大。與e組(100%)比較,a、b、c、d組的相對變化幅度分別為59.38%、75.45%、90.63%、95.98%(圖4)。a組和b組pH相對變化幅度較小,加入pH指示劑后指示劑的顏色變化不明顯。c、d、e組pH相對變化幅度大,但d、e反應(yīng)速率太快,導(dǎo)致時(shí)間溫度指示劑的指示時(shí)間較短,適合在4 ℃下儲存時(shí)間特別短的食品。從水產(chǎn)品實(shí)際保存時(shí)間來考慮,c組的底物含量最優(yōu)。c組反應(yīng)曲線的指數(shù)函數(shù)的擬合系數(shù)為0.9834,pH與時(shí)間的相關(guān)性好,因此底物濃度選擇c組。

圖4　底物濃度對反應(yīng)體系pH的影響Fig.4　Effect of substrate concentration on pH value of reaction system

2.1.5pH指示劑的確定 酚紅-酚酞-百里酚酞混合指示劑體系L*隨時(shí)間先升高后趨于平緩,a*先升高后下降,b*基本呈上升趨勢(圖5)。與酚紅-酚酞-百里酚酞混合指示劑(L*、a*、b*與時(shí)間的線性擬合系數(shù)分別為0.8080、0.3624、0.6219)相比,百里香酚藍(lán)-酚酞-百里酚酞混合指示劑體系的L*、a*、b*有較好的時(shí)間相關(guān)性(L*、a*、b*與時(shí)間的線性擬合系數(shù)分別為0.9943、0.9565、0.9689),隨時(shí)間增加,L*增大,a*由正值趨于0,b*由負(fù)值趨于0(圖6),說明反應(yīng)體系顏色逐漸變淺,最終呈現(xiàn)無色透明溶液。本實(shí)驗(yàn)選擇百里香酚藍(lán)-酚酞-百里酚酞混合指示劑,反應(yīng)液的顏色變化順序?yàn)樗{(lán)色-深紫-淺紫-無色,無色時(shí)即為反應(yīng)終點(diǎn),反應(yīng)終點(diǎn)辨識度高(圖7)。

圖5　酚紅-酚酞-百里酚酞混合指示劑反應(yīng)體系L*，a*，b*值與時(shí)間關(guān)系圖Fig.5　Relationship of L*，a*，b* value and time in Phenol red-phenolphthalein-thymophthalein indicator reaction system

圖6　百里香酚藍(lán)-酚酞-百里酚酞混合指示劑反應(yīng)體系L*a*b*值與時(shí)間關(guān)系圖Fig.6　Relationship of L*a*b* value and time in Thymol blue-phenolphthalein-thymolphthalein indicator reaction system

圖7反應(yīng)體系顏色變化
Fig.7The color change of reaction system

2.2TTI反應(yīng)體系動力學(xué)參數(shù)的測定

隨著溫度的升高,反應(yīng)速率加快。在各溫度下,反應(yīng)的初期pH的變化呈現(xiàn)指數(shù)變化的趨勢(圖8),對各反應(yīng)曲線進(jìn)行指數(shù)函數(shù)的擬合,得到反應(yīng)速率和決定系數(shù)R2(表2)。

圖8　溫度對反應(yīng)體系pH的影響Fig.8　Effect of temperature on pH value of reaction system

表2　不同溫度下反應(yīng)體系的反應(yīng)速率和擬合曲線決定系數(shù)

根據(jù)Arrenhenius方程,lnK=lnKA-Ea/(R×T),以lnK對1/T×1000作線性圖,則斜率為-Ea/(R×1000),得到回歸方程y=-7.23x+20.34,R2為0.9985(圖9),因此Ea/(R×1000)=7.23,求得Ea為60.14 kJ/mol。根據(jù)TTI應(yīng)用于食品的匹配原則,以及引起食品質(zhì)量下降的主要反應(yīng)的活化能,可以判斷該TTI可以指示因酶反應(yīng)(典型活化能值:41.84～62.76 kJ/mol)或脂肪氧化(典型活化能值:41.84～104.60 kJ/mol)導(dǎo)致品質(zhì)下降的食品質(zhì)量變化[18],應(yīng)用范圍較廣。但該TTI具體應(yīng)用于哪種食品,需要進(jìn)一步測定特定食品的Ea值和反應(yīng)終點(diǎn)Ea值才能確定。

圖9　不同溫度條件下TTI速率常數(shù)與1/T半對數(shù)圖Fig.9　Relationship of response rate constant and temperature

3　結(jié)論

研究確定了適用于低溫(4 ℃)環(huán)境的堿性脂肪酶型TTI反應(yīng)體系。反應(yīng)體系總體積25 mL,包括5 mL三乙酸甘油酯∶20 g/L聚乙烯醇乳化液(v∶v=1∶19,均質(zhì)10000 r/min,每次3 min,間隔5 min,共兩次)、19.50 mL 0.05 mol/L pH10.60 Gly-NaOH緩沖液、0.05 mL 1 g/L堿性脂肪酶液、0.25 mL 0.10 mol/L CaCl2溶液、0.20 mL百里香酚藍(lán)-酚酞-百里酚酞混合指示劑。反應(yīng)體系的pH與時(shí)間相關(guān)性好,顏色變化為藍(lán)色-深紫-淺紫-無色,變化顯著,辨識度高,反應(yīng)體系無色時(shí)即為反應(yīng)終點(diǎn)。通過測定不同溫度下的反應(yīng)速率,確定了反應(yīng)體系的活化能為60.14 kJ/mol,該時(shí)間指示劑可以指示因酶反應(yīng)或脂肪氧化導(dǎo)致品質(zhì)下降的食品質(zhì)量變化。

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Research on low-temperature TTI based on lipase

REN Xing-chen,MAO Lin-chun*,YUAN Jia-jia,LU Wen-jing

(College of Biosystems Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

The reaction system and basic characteristic of low-temperature TTI(time-temperature indicator)was determined. The TTI was based on the color change of pH indicator resulted from the hydrolysis of triacetin by alkaline lipase. Finally,parameters of 25 mL reaction system was determined:5 mL triacetin∶20 g/L polyvinyl alcohol emulsion(v∶v=1∶19,10000 r/min,every time 3 min,5 min intervals,a total of 2 times),19.50 mL 0.05 mol/L pH10.60 Gly-NaOH buffer,0.05 mL 1 g/L alkaline lipase,0.25 mL 0.10 mol/L CaCl2solution,0.20 mL Thymol blue-phenolphthalein-thymolphthalein mixture indicator. The activation energy of TTI was determined to be 60.14 kJ/mol by measuring pH descending rate at different temperature. The TTI can be applied to monitor enzyme reaction or steatolysis of low-temperature food,and further to indicate the quality of corresponding food.

time-temperature indicator;alkaline lipase;reaction system;activation energy

2015-09-29

任興晨(1991-),女,碩士研究生,主要從事水產(chǎn)品保鮮方面的研究,E-mail:xingchen5624@163.com。

茅林春(1962-),男,博士,教授,主要從事果蔬及水產(chǎn)品保鮮方面的研究,E-mail:linchun@zju.edu.cn。

國家科技支撐計(jì)劃課題(2015BAD17B03)。

TS254.4

A

1002-0306(2016)10-0251-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.042