左　勇,王小龍,葉碧霞,江　鵬,傅　彬,楊小龍

(四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院,四川自貢 643000)

?

基于高通量測序?qū)σ速e芽菜中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

左勇,王小龍,葉碧霞,江鵬,傅彬,楊小龍

(四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院,四川自貢 643000)

目的:研究宜賓芽菜發(fā)酵過程中細(xì)菌微生物多樣性。方法:采用Illumina高通量測序技術(shù)對芽菜樣本中所有細(xì)菌的16S V1-V3區(qū)進(jìn)行測序,應(yīng)用QIIME軟件和Mothur軟件分析和統(tǒng)計(jì)樣品序列數(shù)目、OUT數(shù)量,并進(jìn)行聚類分析。結(jié)果:宜賓芽菜發(fā)酵過程中6個(gè)階段的樣本共獲得204997條有效序列,優(yōu)化后有效序列數(shù)為41703條,共9202個(gè)OTU分類;主要細(xì)菌類群為Firmicutes(厚壁菌門)下的Bacillus(芽孢桿菌屬),Bacteroidetes(擬桿菌門)下的Flavobacteriaceae(黃桿菌屬)和Sphingobacterium(鞘脂桿菌屬),Proteobacteria(變形菌門)下的Sphingomonas(鞘脂單孢菌屬)、Acidovorax(嗜酸菌屬)、Chromohalobacter(色鹽桿菌屬)和Pseudomonas(假單胞菌屬)以及Actinobacteria(放線菌門)下的Arthrobacter(節(jié)桿菌屬)。結(jié)論:宜賓芽菜發(fā)酵過程中細(xì)菌菌群處于動(dòng)態(tài)變化中,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,部分細(xì)菌逐漸減少或消失,優(yōu)勢細(xì)菌趨于穩(wěn)定。

宜賓芽菜,細(xì)菌群落,高通量測序,Miseq

宜賓芽菜是由芥菜的嫩莖劃成條狀,在大量微生物的作用下,經(jīng)過自然發(fā)酵腌制而成,是我國加工食品中非常著名的產(chǎn)品,有川菜“四大名菜”之稱,成為四川家喻戶曉的傳統(tǒng)醬腌菜[1]。芽菜發(fā)酵過程中主要功能菌為細(xì)菌,據(jù)研究表明,在芽菜發(fā)酵過程中有大量的乳酸菌類、嗜鹽、嗜酸類細(xì)菌[2-3]。它們之間互營共生,生成芽菜主要的風(fēng)味物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì),因此研究芽菜發(fā)酵過程中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)將對提高宜賓芽菜品質(zhì)有重要作用。

傳統(tǒng)的研究芽菜中微生物的方法是菌種分離,近幾年開始運(yùn)用分子生物學(xué)方法對對芽菜中微生物進(jìn)行研究,如PCR-DGGE技術(shù)[4]。傳統(tǒng)的菌種分離只能對芽菜中極少數(shù)能分離的菌種進(jìn)行研究,PCR-DGGE技術(shù)對芽菜的研究無法準(zhǔn)確的定量,也不能對樣品中微生物群落進(jìn)行較為完備的測序研究,同時(shí)工作量大、靈敏度不高。相比較這些方法,高通量測序(HTS)技術(shù)(又稱“下一代”測序(NGS)技術(shù))對微生物群落結(jié)構(gòu)的研究有其明顯的先進(jìn)性和優(yōu)勢,準(zhǔn)確定量、讀長較長、實(shí)時(shí)檢測等。目前,高通量測序技術(shù)已經(jīng)開始運(yùn)用于各種分子生物學(xué)領(lǐng)域[5],在人體微生物、水中生物、土壤、熱泉微生物[6-9]等多個(gè)領(lǐng)域都有應(yīng)用。

本研究首次運(yùn)用高通量Illumina MiSeq 2 x 300 bp測序平臺對宜賓芽菜發(fā)酵過程中的細(xì)菌進(jìn)行研究,建立一套高通量測序技術(shù)分析宜賓芽菜細(xì)菌的方法,同時(shí)利用QIIME和Mothur軟件相結(jié)合,運(yùn)用于數(shù)據(jù)分析,能夠更加準(zhǔn)確、完整地解析宜賓芽菜中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu),為進(jìn)一步利用和開發(fā)宜賓芽菜中微生物資源提供研究基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

芽菜樣本采自宜賓雙誼富康芽菜廠,分別為同一批次發(fā)酵15 d(編號1)、30 d(編號2)、60 d(編號3)、90 d(編號4)、120 d(編號5)、150 d(編號6),迅速置于冰盒運(yùn)回,-20 ℃保藏;TaqDNA polymerase、dNTPs、DL2000TM DNA Marker寶生物工程(大連)有限公司;蛋白酶KMerck;溶菌酶 Sigma;瓊脂糖、丙烯酰胺、N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺、去離子甲酰胺 Solarbio;引物由上海英濰捷基生物技術(shù)公司合成。

通用型恒壓恒流電泳儀北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;My Cycler型PCR儀美國Bio-rad公司;Bio-Best 200E型凝膠成像分析系統(tǒng)美國SIM公司;高速冷凍離心機(jī)X1R美國Thermo公司;臺式冷凍離心機(jī)Eppendorf;MX-S型可調(diào)式混勻儀美國賽洛捷克;SW-CG-1F型超凈工作臺蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司;微量熒光核酸定量儀Qubit 2.0;Miseq 測序儀Illumina公司。

1.2總DNA的提取及PCR擴(kuò)增

采用液氮研磨+溶菌酶+SDS高鹽抽提法[10]提取芽菜中微生物總宏基因組,然用核酸蛋白儀檢測DNA的濃度和純度,置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

通用引物選擇序列較長的V1-V3序列F8-R533[11],因其擴(kuò)增效果好,通用性較高,可以擴(kuò)增出650 bp左右的片段。PCR反應(yīng)體系為25 μL,體系包括5 μL 5×Buffer,0.6 μL 10 mmol/L dNTP,0.5 U phusion超保真DNA 聚合酶,DNA 模板用量為2 μL,533R內(nèi)側(cè)引物(5 pmol/L)2 μL,8F內(nèi)側(cè)引物10 μmol/L母液稀釋48倍取1 μL,8F外側(cè)引物10 μmol/L母液稀釋1.6倍取1 μL,533R外側(cè)引物10 μmol/L母液稀釋1.6倍取1 μL,補(bǔ)水至25 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?98 ℃ 30 s;98 ℃10 s,50 ℃ 90 s,72 ℃ 30 s,8個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min;98 ℃ 10 s,50 ℃ 90 s,72 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min;10 ℃ 10 min。PCR結(jié)束后取3 μL PCR產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

一個(gè)星期后，斯通只身潛水進(jìn)入奧古斯丁聚水坑，去重新完成伊恩和肯尼中斷的探險(xiǎn)任務(wù)。中間集結(jié)營地有一支后援隊(duì)作好了準(zhǔn)備，他就游回到那充滿空氣的石室。為了紀(jì)念伊恩·羅蘭，探察隊(duì)已將這石室命名為“羅蘭氣鐘”。

1.3PCR產(chǎn)物純化及定量

采用QIAquick Gel Extraction Kit膠回收試劑盒對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收,取3 μL回收產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。

采用Quant-iT PicoGreen 定量試劑盒[12]對膠回收之后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量。

1.4高通量測序

將定好量的DNA文庫樣本送至微基生物科技(上海)有限公司進(jìn)行高通量測序。

1.5QIIME軟件和Mothur軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析

2　結(jié)果與分析

2.1樣本文庫的獲得及定量

提取6個(gè)芽菜樣本總DNA,對細(xì)菌16S rRNA V1-V3區(qū)基因擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行膠回收,獲得樣本文庫(見圖1、圖2)。由圖1可知,基因組條帶可見,部分DNA樣本濃度低,條帶較弱,均可正常進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);由圖2可見,電泳檢測條帶單一,片段長度與預(yù)期片段大小一致,約為650 bp,且濃度適中,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1　芽菜樣本總DNA的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1　Sprouts samples of total DNA agarose gel electrophoresis注:1～6分別代表芽菜發(fā)酵時(shí)間15、30、60、90、120、150 d;M：DL2000TM DNA Marker,圖2同。

圖2　芽菜樣本細(xì)菌PCR擴(kuò)增結(jié)果(A)和膠回收結(jié)果(B)Fig.2　Sprouts sample bacteria PCR amplification (A)and gel recovery results(B)

采用微量熒光核酸定量儀Qubit 2.0對膠回收產(chǎn)物進(jìn)行定量。從圖3可以看出,標(biāo)準(zhǔn)曲線符合定量標(biāo)準(zhǔn),以此計(jì)算的定量結(jié)果較為準(zhǔn)確,表1為由此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的各樣品PCR產(chǎn)物定量的濃度,定量濃度滿足高通量測序要求。

圖3　膠回收產(chǎn)物定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3　Gel product recycling quantitative standard curve

樣本編號123456濃度(ng/μL)8.027.667.148.206.5112.69

2.2細(xì)菌群落的OUT分類

將6個(gè)芽菜樣本進(jìn)行高通量測序,根據(jù)barcode標(biāo)簽序列篩選出有效序列,并對處理后的有效序列進(jìn)行數(shù)據(jù)及長度分布統(tǒng)計(jì),細(xì)菌共獲得41703條有效序列。根據(jù)97%水平的OTU豐度,使用rarefaction curve對樣本多樣性進(jìn)行評估,得到樣本稀釋曲線。據(jù)圖4(A)中所示,隨著測序深度的增加,各樣本的曲線斜率逐漸減小,最終趨于平緩。說明測序深度能夠較準(zhǔn)確地反映芽菜中細(xì)菌的豐富度和多樣性。利用各樣本的測序量在不同測序深度時(shí)的細(xì)菌多樣性指數(shù)構(gòu)建Shannon-Wiener曲線,以此反映各樣本在不同測序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性[14]。從圖4(B)中可以看出,各樣本曲線趨向平坦,說明測序數(shù)據(jù)量足夠大,可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物物種信息。

圖4　測序深度曲線Fig.4　Sequencing depth curve注:A：稀釋性曲線，B：Shannon-Wiener曲線。

2.3各樣本在屬水平上的比較

6個(gè)樣本的有效細(xì)菌基因序列錄入BLAST結(jié)合MEGAN軟件,在屬分類水平上分析,根據(jù)各樣本中的細(xì)菌組成繪制柱狀圖(圖5),比較各樣本在屬分類水平上群落結(jié)構(gòu)組成的差異。結(jié)果顯示,發(fā)酵120 d和150 d的優(yōu)勢菌與其他4個(gè)時(shí)期有較大差別,其中發(fā)酵120 d時(shí)有超過90%的序列為Chromohalobacter,發(fā)酵150 d時(shí)占優(yōu)勢的細(xì)菌為Lactobacillus(44%)、Pseudomonas(15%)Pseudomonas(14%)。其他發(fā)酵時(shí)間段的優(yōu)勢細(xì)菌分別為:發(fā)酵15 d時(shí)占優(yōu)勢的細(xì)菌為Kushneria、Unclassified、Buttiauxella、Pseudomonas、Sphingomonas;發(fā)酵30 d的優(yōu)勢細(xì)菌為Kushneria、Unclassified、Pseudomonas、Pectobacterium、Methylobacterium、Arthrobacte、Sphingomonas;發(fā)酵60 d的優(yōu)勢細(xì)菌為Unclassified、Serratia、Sphingomonas、Rhizobium;發(fā)酵90 d的優(yōu)勢細(xì)菌為Unclassified、Buttiauxella、Exiguobacterium、Leuconostoc、Staphylococcus、Arthrobacter、Enterobacter。

圖5　各樣本在屬水平上群落結(jié)構(gòu)組成的差異Fig.5　All the samples in the genus level of community structure

圖6　基于屬水平的PCA圖Fig.6　Based on the genus level of PCA figure

由各樣本OUT組成的差異,通過方差分解,作出PCA圖(圖6)。PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為74.3%和14.3%,累計(jì)貢獻(xiàn)率高達(dá)88.6%,是變異的主要來源,可以解釋變量的絕大部分信息。由圖6可知,芽菜發(fā)酵120 d時(shí)細(xì)菌的多樣性與其他發(fā)酵時(shí)期有較大差別,主要是因?yàn)镃hromohalobacter所占的比例較大,發(fā)酵前期與發(fā)酵后期細(xì)菌的組成也有較大差異性,由此可知芽菜發(fā)酵過程中優(yōu)勢細(xì)菌的組成是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,部分細(xì)菌逐漸減少或消失,優(yōu)勢細(xì)菌逐漸趨于穩(wěn)定,含量有所差異。

2.4基于UniFrac的聚類的比較分析

分析了宜賓芽菜6個(gè)不同發(fā)酵時(shí)期樣本中細(xì)菌菌群的總體結(jié)構(gòu),對比分析6份芽菜樣本間菌群多樣性的相似度,可以采用2種圖(樹圖和熱點(diǎn)圖)來表示。其中比對得到的樹圖(圖7),圖中顯示所有枝條的結(jié)點(diǎn)表示相鄰兩個(gè)細(xì)菌多樣性有顯著性差異(p<0.01),特別是5號樣本與其他樣本有明顯菌群的差異,除5號樣本其他樣本都依次按照發(fā)酵時(shí)間相鄰。

圖7　全樣本相似性分析樹圖Fig.7　All sample tree graph similarity analysis

將指定種屬水平上的分類信息(本次繪圖是根據(jù)genus水平上OUTsize位于前50的信息進(jìn)行繪制的)分別按照樣品和分類進(jìn)行聚類后作出Heatmap圖(圖8),通過顏色的梯度及相似程度來反映數(shù)據(jù)的相似性和差異性,能夠反映出所有樣本在各分類水平上表現(xiàn)的相似性或者差異性。由圖8可知1、2、3號樣本聚為一類,細(xì)菌種類的組成基本相同,但某些細(xì)菌的含量在逐漸減少,甚至消失;4、5、6號樣本聚為一類,細(xì)菌種類趨于穩(wěn)定,含量有所差異,尤其5號樣本色鹽桿菌屬含量與其他樣本有明顯差異。說明在宜賓芽菜發(fā)酵過程中,發(fā)酵前期細(xì)菌的種類變化不大,在數(shù)量上有部分變化;發(fā)酵后期細(xì)菌的種類已經(jīng)比較穩(wěn)定,在各菌群含量上有所差異。

圖8　全樣本多樣性熱圖Fig.8　All samples diversity heatmap

3　結(jié)論

通過Miseq測序方法全面的分析了宜賓芽菜發(fā)酵過程中細(xì)菌的多樣性,結(jié)果顯示6個(gè)階段的樣本共獲得204997條有效序列,優(yōu)化后有效序列數(shù)為41703條,共9202個(gè)OTU分類。通過芽菜樣本的細(xì)菌主成分分析結(jié)果,得出發(fā)酵各時(shí)期的優(yōu)勢細(xì)菌,通過熱圖反映了各樣本之間的相似性與差異性。Miseq測序16S rDNA V1-V3序列反映了更多的多樣性種類,比以往任何芽菜細(xì)菌多樣性的研究得到了更多的分類種類和未知屬種的細(xì)菌,證實(shí)了宜賓芽菜在發(fā)酵過程中含有豐富的細(xì)菌資源。

對芽菜發(fā)酵微生物群落結(jié)構(gòu)的研究與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法及16S rDNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)方法不同,利用高通量測序的方法研究宜賓芽菜發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),全面客觀地分析了芽菜中的微生物多樣性,發(fā)現(xiàn)了一些在芽菜中以前未報(bào)道的細(xì)菌類,如Sphingobacterium(鞘脂桿菌屬)、Chromohalobacter(色鹽桿菌屬)、未培養(yǎng)細(xì)菌等,同時(shí)本研究分析了各類優(yōu)勢菌的含量,根據(jù)數(shù)據(jù)客觀地反映宜賓芽菜發(fā)酵過程中各時(shí)期的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)中細(xì)菌引物設(shè)計(jì)在650 bp左右,測序數(shù)據(jù)對不同發(fā)酵時(shí)期芽菜中微生物的區(qū)分度將擴(kuò)大,能夠更好的了解芽菜中微生物的類群,同時(shí)建立較為完善的芽菜微生物數(shù)據(jù)庫,為芽菜生產(chǎn)和提高芽菜質(zhì)量提供了較為準(zhǔn)確的參考數(shù)據(jù)。

[1]徐坤,雷激,李博，等.芽菜腌制過程中理化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)研究[J].中國釀造,2010(1):29-32.

[2]尹曦,蒲彪,陳安均，等.四川宜賓芽菜中乳酸菌分離篩選及菌相分析[J].食品科學(xué),2013(3):163-168.

[3]張先琴,張小平,敖曉琳，等.PCR-DGGE分析四川地區(qū)家庭制作泡菜中微生物多樣性[J].食品科學(xué),2013(12):129-134.

[4]張先琴,張小平,敖曉琳，等.PCR-DGGE分析四川地區(qū)家庭制作泡菜中微生物多樣性[J].食品科學(xué),2013(12):129-134.

[5]Maccallum.ALLPATHS 2:small genomes assembled accurately and with high continuity from short paired reads[J]. Genome Biol, 2009, 10(10):R103.

[6]Yang F, Zeng X,Ning K.Saliva microbiomes distinguish caries-active from healthy human populations[J]. The ISME Journal，2011，106(40):172-175.

[7]李曉然.基于核糖體RNA高通量測序分析微生物群落結(jié)構(gòu)[D].上海：復(fù)旦大學(xué)，2011.

[8]Zhang L, Offre PR, He J,et al. Autotrophic ammonia oxidation by soil thaumarchaea[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences,2011,107(40):17240-17245.

[9]Lehtovirta-Morley LE, Stoecker K,Vilcinskas A, et al.Cultivation of an obligate acidophilic ammonia oxidizer from a nitrifying acid soil[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences,2011,108(38):15892-15897.

[10]倪崢飛,許偉,竇文芳,等.鎮(zhèn)江香醋固態(tài)發(fā)酵醋醅中微生物總DNA提取方法比較[J].微生物學(xué)報(bào),2010(1):119-125.

[11]Sizhong Yang, Xi Wen.Pyrosequencing investigation into the bacterial community in permafrostsoils along the China-Russia crude oil pipeline(CRCOP)[J]. PLoS ONE, 2012, 7(12):e52730.

[12]Acosta-Martmez V,Dowd SE,Sun Y, et al.Pyrosequencing analysis for characterization of soil bacterial populations as affected by an integrated livestock-cotton production system[J]. Applied Soil Ecology,2010,45(1):13-25.

[13]Chun-Lan Xu, Rui Sun,Xiang-Jin Qiao, et al. Protective effect of glutamine on intestinal injury and bacterial community in rats exposed to hypobaric hypoxia environment[J]. World Journal of Gastroenterology,2014(16):4662-4674.

[14]余瓊,李東堯,毛丙永,等.麻辣提取物對腸道微生物的影響[EB/OL]. 中國科技論文在線.

Based on high-throughput sequencing analysis of bacterial community structure in Yibin sprouts

ZUO Yong,WANG Xiao-long,YE Bi-xia,JIANG Peng,FU Bin,YANG Xiao-long

(Dept. of Bioengineering,Sichuan University of Science and Engineering,Zigong 643000,China)

Objective:The aim of this study was to analyze the yibin sprouts bacteria microbial diversity in the process of fermentation.Methods:Illumina high-throughput sequencing techno-logy were used to sequence 16S V1-V3 hypervariable reqion of all 6 yibin sprouts samples. QIIME and Mothur was used to analyze and calculate the numbers of sequences and operational taxonomic unitl(OTUs)for each sample,and followed by cluster analysis.Results:Yibin sprouts 6 stages in the process of fermentation samples received 204997 valid sequence,the optimized effectively sequence number was 41703,a total of 9202 OTUs.The main groups for bacteria of Yibin sprouts wasBacillusunder theFirmicutes,FlavobacteriaceaeandSphingobacteriumunder theBacteroidetes,Sphingomonas,Acidovorax,ChromohalobacterandPseudomonasunder theProteobacteria,andArthrobacterunder theActinobacteria.Conclusion:Yibin sprouts bacterial flora in the fermentation process of dynamic change,with the fermentation proceeds,some bacteria gradually decreased or disappeared,dominant bacteria stabilized.

Yibin sprouts;bacterial community;high-throughput sequencing;Miseq

2015-08-03

左勇(1972-),男,碩士，教授,主要從事發(fā)酵工程方面的研究,E-mail:sgzuoyong@tom.com。

固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(2015gtc002);2014四川省科技廳農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目;2013大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201310622001);四川理工學(xué)院培育項(xiàng)目(2013PY09)。

TS264.2

A

1002-0306(2016)10-0242-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.040