田云飛,劉曉莉,成文玉,金紅星

(河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院,天津 300130)

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α-淀粉酶基因在腸膜明串珠菌基因表達(dá)中的應(yīng)用

田云飛,劉曉莉,成文玉,金紅星*

(河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院,天津 300130)

目的:為了驗(yàn)證α-amy(α-淀粉酶基因)在腸膜明串珠菌中應(yīng)用的可行性,構(gòu)建重組質(zhì)粒并建立了腸膜明串珠菌的三親雜交體系。方法:以大腸桿菌-明串珠菌的穿梭載體pCW4為基礎(chǔ),構(gòu)建了攜帶α-amy標(biāo)記的重組質(zhì)粒pCW7。腸膜明串珠菌ATCC8293(Leuconostocmesenteroides)的g6ph(6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因)表達(dá)盒插入到pCW7,并通過(guò)三親雜交轉(zhuǎn)化腸膜明串珠菌而獲得重組菌株。結(jié)果:重組菌株的甘露醇產(chǎn)量比原始菌株提高了7%。三親雜交中可以通過(guò)α-amy標(biāo)記篩選重組子。結(jié)論:證實(shí)了α-amy標(biāo)記在腸膜明串珠菌中應(yīng)用的可行性。

腸膜明串珠菌,α-淀粉酶基因,三親雜交,6-磷酸葡萄糖脫氫酶

在基因工程中通常以抗生素抗性基因作為正篩選標(biāo)記,進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定,是因?yàn)榭股氐目剐曰虮磉_(dá)盒一般都比較小,只有1.0 kb左右,便于利用。乳酸細(xì)菌的轉(zhuǎn)基因中普遍應(yīng)用的抗生素是紅霉素[1-5],但它有一些不足之處,比如,以大腸桿菌為受體菌在平板上進(jìn)行篩選時(shí),較低濃度容易產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性而長(zhǎng)出一大片菌落,而使用較高濃度時(shí)轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)緩慢且菌落數(shù)量銳減。因此,本研究欲利用α-淀粉酶基因(α-amy)標(biāo)記解決這一難題。另外,α-amy是可應(yīng)用于食品和藥物生產(chǎn)的安全標(biāo)記。

明串珠菌是泡菜、腌菜等發(fā)酵蔬菜中的優(yōu)勢(shì)菌株[6],是能產(chǎn)生乳酸、甘露醇、雙乙酰、細(xì)菌素的革蘭氏陽(yáng)性乳酸細(xì)菌,還應(yīng)用于乳制品的加工過(guò)程中,因此近年來(lái)在內(nèi)地對(duì)其研究比較活躍[7]。明串珠菌通常采用電穿孔法進(jìn)行轉(zhuǎn)化,但是它對(duì)儀器要求嚴(yán)格,不但成本高且維修周期長(zhǎng),給實(shí)驗(yàn)研究帶來(lái)諸多不便。三親接合轉(zhuǎn)移(三親雜交)是在細(xì)菌中廣泛應(yīng)用的轉(zhuǎn)化手段[8],不需要特殊的儀器設(shè)備,拓寬了革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)化途徑,然而在腸膜明串珠菌中尚未建立相應(yīng)的方法,因此本研究構(gòu)建腸膜明串珠菌的三親雜交體系。

6-磷酸葡萄糖脫氫酶(g6ph)催化PPK途徑中的6-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖酸,并產(chǎn)生NADH。蔗糖通過(guò)透性酶進(jìn)入腸膜明串珠菌的胞內(nèi),經(jīng)蔗糖磷酸化酶裂解為1-磷酸葡萄糖和果糖,果糖最終加氫還原為甘露醇,這一氫來(lái)源于NADH。因此,本研究通過(guò)g6ph的過(guò)表達(dá),驗(yàn)證了α-amy標(biāo)記和三親雜交體系的可行性。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

腸膜明串珠菌CGMCC1.10327、攜帶pRK2013(kanr)的大腸桿菌(輔助菌)和pSET152(Eryr)本實(shí)驗(yàn)室保藏,腸膜明串珠菌ATCC8293、食淀粉乳桿菌CGMCC1.3395中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心;pTA2載體TOYOBO;Taq酶、內(nèi)切酶、連接酶大連寶生物公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒Axygen公司。

KF960 PCR儀Heal Force;UV-1100紫外-可見分光光度計(jì)Mapada。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件大腸桿菌用LB液體培養(yǎng)基于37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng),腸膜明串珠菌、食淀粉乳桿菌用MRS液體培養(yǎng)基于30 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)。發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的液體培養(yǎng)基:蔗糖20 g、蛋白胨5 g、酵母浸粉2.5 g、硫酸錳0.02 g、磷酸氫二鉀1 g、檸檬酸銨1 g、乙酸鈉2.5 g,溶于1 L雙蒸水中。在大腸桿菌的培養(yǎng)中紅霉素(Ery)用量為300 μg/mL,在腸膜明串珠菌的培養(yǎng)中氨芐青霉素(Amp)用量為5 μg/mL。

1.2.2引物合成與載體構(gòu)建本研究中使用的引物列于表1。根據(jù)GenBank的相關(guān)核苷酸序列,用Oligo6.0設(shè)計(jì)引物并由華大基因公司合成。

表1　本研究中使用的引物

以大腸桿菌-明串珠菌的穿梭質(zhì)粒pCW4[9]為基礎(chǔ),插入Ampr后切除Eryr并插入了oriT,最后再插入α-amy而成為pCW7。構(gòu)建過(guò)程見圖1。

圖1　pCW7質(zhì)粒的構(gòu)建流程Fig.1　The process for construction of the pCW7 plasmid

1.2.3三親本雜交過(guò)夜培養(yǎng)的供體菌(大腸桿菌,含攜帶oriT基因的pCW7-g6ph)、輔助菌分別以1%的接菌量轉(zhuǎn)接到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中,受體菌(腸膜明串珠菌CGMCC1.10327)按1%的接菌量轉(zhuǎn)接到新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中。分別培養(yǎng)到OD600為0.6時(shí),將三者按體積比例(mL)0.4∶0.4∶0.6混勻,菌體用MRS培養(yǎng)基洗滌2次,溶于100 μL MRS培養(yǎng)基中。均勻涂布于含0.005%(W/V)錐蟲藍(lán)、1%可溶性淀粉和0.1 mol/L CaCl2的MRS轉(zhuǎn)化平板中,30 ℃培養(yǎng)5 h后,用含5 mg/mL Amp和50 mg/mL萘啶酮酸的水溶液1 mL均勻覆蓋平板培養(yǎng)基表面[10],培養(yǎng)72 h,得到的藍(lán)色菌落即為重組菌株。

為了優(yōu)化受體菌的三親雜交條件,分別就受體菌的OD值、三種菌的混合比例、Amp的濃度和抗生素覆蓋時(shí)期等單因素條件進(jìn)行三親雜交實(shí)驗(yàn),并統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化后平板上長(zhǎng)出的藍(lán)色菌落個(gè)數(shù),即為接合轉(zhuǎn)移子數(shù)目。進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn),將三種菌混合液100 μL以一定倍數(shù)稀釋后取100 μL,涂布于轉(zhuǎn)化平板上,覆蓋平板培養(yǎng)基表面時(shí)用只含萘啶酮酸而不含Amp的水溶液,獲得的菌落個(gè)數(shù)乘以其稀釋倍數(shù)作為受體菌落形成單位。

每個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)做3組平行實(shí)驗(yàn),統(tǒng)計(jì)每個(gè)平板上的菌落數(shù),算出其數(shù)值平均值作為最終數(shù)據(jù)。按照公式(接合轉(zhuǎn)移頻率=接合轉(zhuǎn)移子數(shù)目/受體菌落形成單位(cfu)[11])算出結(jié)合轉(zhuǎn)移頻率,采用Origin8.0數(shù)據(jù)處理軟件作圖,根據(jù)圖線的趨勢(shì)選出最佳條件。

1.2.4發(fā)酵產(chǎn)甘露醇原始菌和重組菌用發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵20 h,根據(jù)張曉卿的方法[12]測(cè)定甘露醇含量。

2　結(jié)果與討論

2.1重組載體構(gòu)建

本研究以pCW4為基礎(chǔ)構(gòu)建了pCW7。其中所有的目標(biāo)插入片段都采用PCR擴(kuò)增,其瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。在圖2中,與DNA marker條帶相比較而得知,PCR產(chǎn)物的大小合適,通過(guò)測(cè)序獲得的序列與GeneBank的相關(guān)序列比對(duì)也證實(shí)了它們的正確性。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳,篩選了重組子,根據(jù)質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移率的不同,選出疑似重組子,然后通過(guò)酶切驗(yàn)證,結(jié)果見圖3。由圖可知,疑似重組子經(jīng)過(guò)特定酶切可以切為兩條帶,一條與目的片段的PCR產(chǎn)物大小一致,另一條與載體在相同酶切下的產(chǎn)物大小一致,證明其確實(shí)為重組子。又通過(guò)PCR再次驗(yàn)證了重組子。

圖2　PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2　PCR amplified product注:1,4,5,8為DNA Marker,2為Ampr,3為oriT,6為amy(模板為食淀粉乳桿菌染色體),7為amy(模板為pTA2-amy)。

圖3　重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證電泳圖Fig.3　Result of recombinant plasmid verified by digestion注:1為Amp PCR產(chǎn)物;2為重組子pCW5的BamHI酶切產(chǎn)物;3為載體pCW4的BamHI酶切產(chǎn)物;4為重組子pCW6的XbaI酶切產(chǎn)物;5為DNA marker;6為載體pCW5的XbaI酶切產(chǎn)物;7為α-Amy PCR產(chǎn)物;8為重組子pCW7的XhoI酶切產(chǎn)物;9為載體pCW6的XhoI酶切產(chǎn)物;10為g6ph PCR產(chǎn)物;11為重組子pCW7-g6ph的SalI酶切產(chǎn)物;12為載體pCW7的SalI酶切產(chǎn)物。

利用g6ph-u/g6ph-d引物,以腸膜明串珠菌ATCC8293的總DNA為模板,克隆了g6ph表達(dá)盒,經(jīng)SalI酶切后插入到pCW7中,成為pCW7-g6ph。

2.2三親雜交體系的優(yōu)化

2.2.1受體菌OD600值對(duì)接合轉(zhuǎn)移頻率的影響考察了受體菌的OD600值對(duì)三親雜交的影響,結(jié)果見圖4。從圖4可以看出,OD600為0.6時(shí)接合轉(zhuǎn)移頻率最高。

圖4　宿主菌OD600對(duì)接合轉(zhuǎn)移頻率的影響Fig.4　Effect of OD600 of recipient cell on conjugation efficiency

2.2.2三種菌混合比例對(duì)接合轉(zhuǎn)移頻率的影響比較了供體菌、輔助菌和受體菌三者不同比例的三親雜交實(shí)驗(yàn),結(jié)果見圖5。由圖5可知,當(dāng)比例為1∶1∶1.5時(shí),接合轉(zhuǎn)移頻率最高。

圖5　三種菌株比例對(duì)接合轉(zhuǎn)移頻率的影響Fig.5　Effect of ratio of three types strain on conjugation efficiency

2.2.3抗生素Amp濃度的選擇不同Amp濃度條件下進(jìn)行了三親雜交實(shí)驗(yàn),接合轉(zhuǎn)移效果見圖6。由圖6可知,當(dāng)Amp為5 mg/L時(shí),接合轉(zhuǎn)移頻率最高。Amp低于5 mg/L時(shí),因誘導(dǎo)抗性而產(chǎn)生大量的假陽(yáng)性菌落,而抗生素濃度過(guò)高,抑制接合子的生長(zhǎng)。

圖6　Amp濃度對(duì)接合轉(zhuǎn)移頻率的影響Fig.6　Effect of concentration of ampicillin on conjugation efficiency

2.2.4覆蓋時(shí)期的選用3種菌株混合物涂布于MRS平板后,不同時(shí)期用Amp和萘啶酮酸覆蓋平板,結(jié)果見圖7。由圖7可知,培養(yǎng)5 h是最佳的覆蓋時(shí)期,超過(guò)6 h時(shí),長(zhǎng)出大量假陽(yáng)性菌落,而時(shí)間過(guò)早抑制接合子的生長(zhǎng)。

圖7　覆蓋時(shí)間對(duì)接合轉(zhuǎn)移頻率的影響Fig.7　Effect of time on conjugation efficiency

受體菌的OD600值和三種菌混合比例的探索,是用CaCl2洗滌混合菌2次后置于平板的濾紙上而進(jìn)行三親本雜交的[13],其接合轉(zhuǎn)移頻率非常低,且十分不穩(wěn)定?？赡苁怯捎谖⒖诪V紙阻隔菌吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、CaCl2的處理時(shí)期和時(shí)間不適而造成的。采用藥物覆蓋法[10]優(yōu)化了Amp濃度和藥物覆蓋時(shí)期,接合轉(zhuǎn)移頻率大大提高。

2.3利用α-淀粉酶基因標(biāo)記篩選重組子

含0.005%(W/V)錐蟲藍(lán)、1%可溶性淀粉的MRS平板中接合子菌落的顏色為藍(lán)色,見圖8。用溶菌酶處理腸膜明串珠菌菌體后,采用小量提取試劑盒提取了接合子的質(zhì)粒,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果見圖9。電泳結(jié)果表明,該藍(lán)色菌落含有與供體菌的pCW7-g6ph大小一致的重組質(zhì)粒,證明該藍(lán)色菌落就是接合子。隨著時(shí)間的推移,藍(lán)色平板的顏色越來(lái)越淡,而接合子菌落的顏色越來(lái)越深。由此可知,菌落的顏色是接合子吸附藍(lán)色的錐蟲藍(lán)而導(dǎo)致的,但是含淀粉酶基因標(biāo)記的菌落變藍(lán)的機(jī)理還不清楚。

圖8　接合子Fig.8　Conjugant

圖9　接合子鑒定Fig.9　Identification of conjugant注:1.原始菌株；2.接合子；3.pCW7-g6ph。

馬向東等[14]認(rèn)為,含淀粉的平板中加入錐蟲藍(lán)時(shí),更容易觀察到枯草芽孢桿菌分泌的淀粉酶溶解淀粉而出現(xiàn)的透明圈。但本研究中并沒有觀察到明顯的透明圈,可能是淀粉酶基因在腸膜明串珠菌中表達(dá)緩慢且活性低的緣故。于是用液體培養(yǎng)接合子12 h后,取菌液1 μL滴于含淀粉的MRS平板中,放置18 h后用I2-KI溶液噴灑平板,發(fā)現(xiàn)有明顯的透明圈產(chǎn)生,見圖10。由圖10可知,接合子確實(shí)有淀粉酶活性。

圖10　接合子的淀粉酶溶解淀粉實(shí)驗(yàn)Fig.10　Starch test of amylase from conjugant

本研究克隆的α-amy片段為2.0 kb,包括啟動(dòng)子和信號(hào)肽序列,但只含有部分的3′端重復(fù)序列。Eric[15]分離的食淀粉乳桿菌α-amy基因表達(dá)盒為2862 bp,其3′端有5個(gè)273 bp重復(fù)序列,Eric認(rèn)為此重復(fù)序列與淀粉酶活性無(wú)關(guān)。陳孝禮[16]分析了食淀粉乳桿菌的α-amy基因結(jié)構(gòu),也認(rèn)為其3′端重復(fù)序列對(duì)淀粉酶的異源表達(dá)活性沒有影響。綜上所述,3′端的重復(fù)序列與與淀粉酶活性無(wú)關(guān)。

篩選重組子時(shí)利用菌落的顏色非常簡(jiǎn)便,例如Li等[17]利用了靛藍(lán)素基因、Takahashi等[18]利用了非核糖體肽合成酶催化產(chǎn)生的一種藍(lán)色染料。但是這些產(chǎn)生顏色的基因,其表達(dá)盒都很大,不利于應(yīng)用,如靛藍(lán)素基因?yàn)?.9 kb、非核糖體肽合成酶基因4.8 kb。淀粉酶基因只有2.0 kb,因此在實(shí)際應(yīng)用中占優(yōu)勢(shì)。

2.4搖瓶發(fā)酵產(chǎn)甘露醇

利用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)20 h后,重組菌的甘露醇含量為10.1 g/L,比原始菌(9.4 g/mL)提高了約7%。這一數(shù)據(jù)與預(yù)期相符,說(shuō)明6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因的過(guò)表達(dá)可以提高NADH通量,進(jìn)而對(duì)終產(chǎn)物甘露醇的合成起促進(jìn)作用。Gaspar等[19]在乳球菌中通過(guò)敲除乳酸脫氫酶基因而減少NADH的消耗,使甘露醇產(chǎn)量得到了提高。由此可見,增加NADH通量的手段,可以提高甘露醇的產(chǎn)量。

3　結(jié)論

α-淀粉酶基因作為篩選標(biāo)記可以應(yīng)用于腸膜明串珠菌的基因工程中,并消除紅霉素應(yīng)用中的不利影響。供體菌、輔助菌和受體菌OD600為0.6時(shí),將三者按體積比(mL)0.4∶0.4∶0.6比例混勻,用MRS培養(yǎng)基洗滌混合菌2次,涂布于含0.005%(W/V)錐蟲藍(lán)、1%可溶性淀粉、0.1 mol/L CaCl2的MRS平板中,培養(yǎng)5 h后用1 mL含5 mg/L的Amp、50 mg/mL萘啶酮酸的水溶液覆蓋,培養(yǎng)至72 h,平板上長(zhǎng)出藍(lán)色菌落。通過(guò)表達(dá)6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因的重組菌,甘露醇產(chǎn)量比原始菌提高了約7%。

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Study on application ofα-amylase gene in the gene expression ofLeuconostocmesenteroides

TIAN Yun-fei,LIU Xiao-li,CHENG Wen-yu,JIN Hong-xing*

(School of Chemical Engineering & Technology,Hebei University of Technology,Tianjin 300130,China)

Objective:To verify the effect of theα-amy(α-amylase gene)used inLeuconostocmesenteroides,construction of recombined plasmid and triparental mating system inLeuconostocmesenteroideswere performed. Methods:The recombined plasmid pCW7,containingα-amy,was constructed based onE.coli-Leuconostoc shuttle vectors pCW4. 6-Phosphoglucose dehydrogenase gene(g6ph)expression cassettes fromLeuconostocmesenteroidesATCC8293 was cloned into pCW7 and introduced intoLeuconostocmesenteroidesby triparental mating. Results:Compared with the wild type,the recombination strain increased 7% yield of mannitol. The recombinant can be successfully selected byα-amylase gene markers. Conclusion:It showed the practicability ofα-amylase gene markers used in improving the gene expression ofLeuconostocmesenteroides.

Leuconostocmesenteroides;α-amylase gene;triparental mating;6-Phosphoglucose dehydrogenase

2015-11-30

田云飛(1989-)，女，碩士，研究方向：細(xì)菌遺傳育種學(xué)，E-mail：tian_yunfei@163.com。

金紅星(1968-)，男，博士，副教授，研究方向：細(xì)菌遺傳育種學(xué)，E-mail：jinhx87@126.com。

TS201.3

A

1002-0306(2016)10-0203-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.033