汪　靜，郭　柳，蔡春泉，陳曉麗，謝　華，趙慧智，吳佰林，張　霆，姜　宏

應(yīng)用微陣列比較基因組雜交技術(shù)探討顱部神經(jīng)管畸形與基因組拷貝數(shù)變異的相關(guān)性

汪靜1，郭柳2，蔡春泉3，陳曉麗4，謝華4，趙慧智5，吳佰林6，張霆4，姜宏1

目的 應(yīng)用微陣列比較基因組雜交技術(shù)（Array-CGH）對顱部神經(jīng)管畸形及正常流產(chǎn)胚胎進(jìn)行基因組拷貝數(shù)變異（CNVs）篩查，探討基因組CNVs在顱部神經(jīng)管畸形中的致病作用。方法 在倫理同意基礎(chǔ)上，采集51例顱部神經(jīng)管畸形胚胎（病例組）和75例正常流產(chǎn)胚胎（對照組），運(yùn)用高分辨率芯片篩查全基因組CNVs，針對所發(fā)現(xiàn)的基因組CNVs，利用國際基因組CNVs多態(tài)性數(shù)據(jù)庫過濾去除良性多態(tài)性CNVs，然后根據(jù)其是否包含參考基因?qū)⑵浞謩e命名為非多態(tài)性CNV、非多態(tài)性genic CNV及非多態(tài)性ciliogenic CNV，應(yīng)用Χ2檢驗(yàn)對以上基因組CNVs與顱部神經(jīng)管畸形的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果 病例組和對照組分別檢測到48和33個(gè)非多態(tài)性CNVs，其中分別有37和26個(gè)為非多態(tài)性genic CNVs。病例組內(nèi)含非多態(tài)性CNVs和非多態(tài)性genic CNVs的樣本比例均顯著高于對照組（52.9%vs32.0%，P＜0.05；49.0%vs26.6%，P＜0.05），其中非多態(tài)性genic CNVs導(dǎo)致顱部神經(jīng)管畸形發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加2.644倍（OR=2.644）。結(jié)論 全基因組CNVs研究的證據(jù)表明，基因CNVs是顱部神經(jīng)管缺陷的危險(xiǎn)因素。

微陣列比較基因組雜交；顱部神經(jīng)管畸形；基因組拷貝數(shù)變異

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-4-19 11：04：48 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.034.html

神經(jīng)管畸形（neural tube defect，NTDs）是一類常見的嚴(yán)重出生缺陷，由胚胎發(fā)育早期神經(jīng)管閉合失敗或閉合不完全引起。NTDs是造成孕婦流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)和嬰幼兒終身殘疾的主要原因之一。最新統(tǒng)計(jì)，中國NTDs的發(fā)病率接近2.74‰，其中在山西省NTDs的發(fā)病率最高，可達(dá)13.87‰～19.94‰［1］。NTDs是一種復(fù)雜性疾病，是環(huán)境和遺傳因素共同作用的結(jié)果。研究［2］顯示人類NTDs中約70%是由遺傳因素所致。NTDs同胞發(fā)生NTDs的危險(xiǎn)性是普通人群的50倍［3］。近年來通過對小鼠及其他NTDs動物模型的研究發(fā)現(xiàn)了大量NTDs相關(guān)候選基因，但迄今為止僅證實(shí)MTHFR基因多態(tài)性和平面細(xì)胞極性（PCP）核心基因的致病性突變與人類NTDs的發(fā)生相關(guān)［4］?？截悢?shù)變異（copy number variations，CNVs）是基因組多態(tài)性的一種重要形式，在人類表型多樣性以及人類對疾病的易感性方面具有重要作用。人類基因組CNVs與人類出生缺陷疾病相關(guān)，如先天性心臟?。?］。另一方面，利用傳統(tǒng)的染色體核型分析確定6.5%～9.7%NTDs胎兒存在染色體異常［6］。這些表明基因組失衡是NTDs的遺傳基礎(chǔ)之一。過去由于傳統(tǒng)的染色體核型分析分辨率低，不能明確哪一個(gè)區(qū)域與NTDs發(fā)生相關(guān)。該研究應(yīng)用高分辨的基因組芯片技術(shù)（microarray comparative genomic hybridization，Array-CGH）對顱部神經(jīng)管畸形及正常流產(chǎn)胚胎進(jìn)行基因組CNVs篩查，探討基因組CNVs在顱部神經(jīng)管畸形中的致病作用。

1　材料與方法

1.1病例資料 采用病例對照研究，收集2004年3月～2009年4月在山西省呂梁地區(qū)醫(yī)院因死胎或畸形引產(chǎn)的無腦畸形和腦膨出胚胎為病例組，同時(shí)采集因非醫(yī)學(xué)原因流產(chǎn)的正常胚胎為對照組。胎齡、胚胎的總體發(fā)育情況及胚胎B超檢查數(shù)據(jù)由當(dāng)?shù)赜薪?jīng)驗(yàn)的婦產(chǎn)科醫(yī)師記錄。NTDs的病理診斷由有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)專家根據(jù)國際疾病分類執(zhí)行。對照組進(jìn)行常規(guī)的產(chǎn)前檢查，問卷調(diào)查和尸體解剖，帶有其他病理性畸形或?qū)m內(nèi)生長發(fā)育受限的胚胎被排除。本研究通過首都兒科研究所倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得父母知情同意。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1DNA制備 無腦畸形胚胎選擇頭顱內(nèi)剩余腦組織或者脊髓組織提取基因組DNA，腦膨出胚胎選擇腦組織提取基因組DNA，采用DNeasy Blood& Tissue kit試劑盒（德國 QIAGEN公司）提取DNA。取2.0μl已提取的基因組DNA，應(yīng)用紫外分光光度儀NanoDrop2000（美國 Thermo Fisher公司）測量DNA濃度，計(jì)算基因組DNA含量。

1.2.2Array-CGH 嚴(yán)格按照Agilent寡核苷酸Array-CGH試劑盒說明書進(jìn)行操作。取3～6μg DNA于50μl體系，37℃下AluⅠ和RsaⅠ聯(lián)合消化2 h，QIAprep Spin Mini prep Kit進(jìn)行DNA純化，重新測定濃度值后，取2 500 ng DNA，用Bio Prime labeling kit進(jìn)行熒光標(biāo)記（cy 5標(biāo)記對照DNA，cy 3標(biāo)記待測DNA），37℃、2 h后終止反應(yīng)；再次MicroCon YM-30純化熒光標(biāo)記 DNA后，將參考DNA和本研究標(biāo)本DNA等量混合后加入雜交體系，94℃變性3 min，37℃孵育0.5 h，上樣到Oligo244 K芯片上，65℃雜交爐孵育72 h后先用洗脫液1洗脫5 min，再用洗脫液2洗脫1 min，迅速進(jìn)行微陣列掃描，采用Feature Extraction 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)提取至DNA Analystic 5.0軟件進(jìn)行全基因組CNVs分析。實(shí)驗(yàn)儀器和試劑均購自美國Invitrogen公司和美國Agilent公司，男女性對照DNA樣本購自美國Invitrogen公司。

1.2.3NTDs相關(guān)CNVs評估方法 Feature Extraction 9.0獲取探針雜交結(jié)果并分析染色體重復(fù)或缺失片段，查詢國際基因組拷貝數(shù)變異多態(tài)性數(shù)據(jù)庫（database of genomic variants，DGV，http：//projects. tcag.ca/variation/），若檢測的CNV與數(shù)據(jù)庫沒有重疊或重疊少于20%，則認(rèn)為這是個(gè)非多態(tài)性CNV；若非多態(tài)性CNV中包含一個(gè)及以上的基因或基因的外顯子區(qū)域則認(rèn)為這是個(gè)非多態(tài)性genic CNV，若非多態(tài)性genic CNV中存在纖毛基因則認(rèn)為這是個(gè)非多態(tài)性ciliogenic CNV（圖1）。

1.2.4NTDs相關(guān)CNVs的驗(yàn)證方法 long-range PCR驗(yàn)證雜合缺失：挑選3個(gè)基因組缺失，通過primer 3設(shè)計(jì)多個(gè)斷點(diǎn)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增（Platinum PCR SuperMix High Fidelity kit，美國Invitrogen公司），對最終得到大小為1 000～2 000 bp擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行sanger測序。real-time定量PCR驗(yàn)證重復(fù)：挑選1個(gè)基因組重復(fù)，通過primer 3在CNV的兩側(cè)和中間部分設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，正常男性為對照，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次（美國Applied Biosystems公司）。見表1。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 10.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料的組間比較采用Χ2檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1研究對象的一般情況 共收集51例無腦畸形和腦膨出胚胎為病例組，其中男25例，女26例，均為散發(fā)NTDs，無家族病史。75例正常流產(chǎn)胚胎為對照組，其中男38例，女37例。病例組與對照組性別分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.856）。

2.2Array-CGH結(jié)果及數(shù)據(jù)比對分析 針對軟件所篩查出的基因組CNVs，首先對兩組的全基因組CNVs數(shù)目、全基因組CNVs平均長度進(jìn)行對比分析（圖2、3），病例組與對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。接著利用國際基因組拷貝數(shù)變異多態(tài)性數(shù)據(jù)庫，過濾去除良性多態(tài)性CNVs，27個(gè)顱部 NTDs胚胎中發(fā)現(xiàn)48個(gè)非多態(tài)性CNVs，24個(gè)正常流產(chǎn)胚胎中發(fā)現(xiàn)33個(gè)非多態(tài)性CNVs。病例組與對照組非多態(tài)性CNVs無重疊。對于以上發(fā)現(xiàn)的非多態(tài)性CNVs，比對美國波士頓兒童醫(yī)院臨床分子診斷實(shí)驗(yàn)室芯片數(shù)據(jù)庫和首都兒科研究所實(shí)驗(yàn)室300個(gè)智力低下及正常父母的CNVs數(shù)據(jù)庫，均未發(fā)現(xiàn)重復(fù)，說明病例組非多態(tài)性CNVs屬于罕見或顱部NTDs特有的。其中有63個(gè)非多態(tài)性CNVs為非多態(tài)性genic CNVs，病例組和對照組分別包含37和26個(gè)。隨機(jī)挑選4個(gè)非多態(tài)性genic CNVs用PCR方法驗(yàn)證，結(jié)果與Array-CGH相符。病例組平均每個(gè)樣本攜帶非多態(tài)性CNVs數(shù)目是對照組2.14倍（0.94 vs 0.44），非多態(tài)性genic CNVs數(shù)目是對照組2.06倍（0.72 vs 0.35）。病例組含非多態(tài)性CNVs和非多態(tài)性genic CNVs的樣本比例均顯著高于對照組（52.9%vs 32.0%，P＜0.05；49.0%vs26.6%，P＜0.05），并且非多態(tài)性genic CNVs比非多態(tài)性CNVs的差異更顯著（0.010 vs0.019）。非多態(tài)性CNVs導(dǎo)致NTDs發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加2.391倍［比值比（odd ratio，OR）= 2.391，95%置信區(qū)間（confidenceinterval，CI）：1.148～4.977］，非多態(tài)性genic CNVs導(dǎo)致NTDs發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加 2.644倍（OR=2.644，95%CI：1.248～5.601）。同時(shí)比較樣本攜帶非多態(tài)性CNVs和多態(tài)性genic CNVs的平均長度，病例組與對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2　病例組和對照組　CNVs比較分析

圖3　病例組與對照組CNV平均長度比較A：病例組；B：對照組

圖3　病例組與對照組CNV平均長度比較A：病例組；B：對照組

病例組攜帶的非多態(tài)性genic CNVs中共發(fā)現(xiàn)77個(gè)基因，是對照組的1.75倍（77 vs 44），見表2。尤其，在77個(gè)基因內(nèi)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)microRNA-miR223（圖4）。另外有7個(gè)基因是已報(bào)道的NTDs候選基因的同源基因（表3），提示NTDs特有非多態(tài)性genic CNVs中某些基因可能是部分NTDs的致病原因。CALR基因缺陷型小鼠具有NTDs表型，本研究中CALR3缺失（圖5）患者表型有無腦畸形，具有表型一致性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)18例樣本攜帶非多態(tài)性ciliogenic CNVs，但病例組和對照組間的非多態(tài)性ciliogenic CNVs的樣本數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.054）。

圖4　Array-CGH顯示一例顱部NTDs患者攜帶m iR223重復(fù)

圖5　Array-CGH顯示一例顱部　NTDs患者攜帶　CALR3基因缺失

表3　已報(bào)道神經(jīng)管畸形候選基因的同源基因

3　討論

NTDs是胎兒致死及致殘的常見病因，明確其病因?qū)χ委?、隨訪以及再次生育風(fēng)險(xiǎn)咨詢均有重要意義。CNVs一般指長度為1 000 bp以上的基因組大片段的拷貝數(shù)增加或者減少，是引起人類遺傳和表型多樣性的重要因素之一。研究［6］表明采用細(xì)胞遺傳學(xué)方法即染色體核型分析方法進(jìn)行產(chǎn)前診斷的顱部NTDs中發(fā)現(xiàn)6.5%存在染色體異常，其中三體型最常見。但通過染色體核型分析檢測出的基因組失衡片段都在5×106bp以上，不利于定位NTDs致病基因。Array-CGH技術(shù)具有自動化、高通量、高密度探針等特點(diǎn)，可以篩查小于5×105bp，甚至1× 104bp的基因組微失衡，從而可以發(fā)現(xiàn)片段更小的NTDs相關(guān)CNVs，便于尋找新的NTDs致病基因。經(jīng)過檢測與分析，本研究所有樣本攜帶的CNVs均小于3×106bp，大部分集中于1×105～5×105bp之間，且未發(fā)現(xiàn)三體型。而西方國家NTDs患者中相當(dāng)一部分?jǐn)y帶大片段染色體異常，包括三體型［6］。這種現(xiàn)象可能提示山西地區(qū)和以往研究病例采集地區(qū)之間存在遺傳差異。同時(shí)在病例組發(fā)現(xiàn)一類非多態(tài)性CNVs，以往未見報(bào)道，并且在非NTDs的智力低下患者CNVs數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)，表明該類CNVs是顱部NTDs特有的，對發(fā)現(xiàn)NTDs致病基因至關(guān)重要。由于缺少父母樣本，無法評估這些非多態(tài)性CNVs是否為新生。故采用病例-對照研究方法，對病例組和對照組樣本攜帶非多態(tài)性CNVs的數(shù)目進(jìn)行比較，特別是非多態(tài)性genic CNVs，發(fā)現(xiàn)顱部NTDs患者存在非多態(tài)性genic CNVs富集現(xiàn)象。但本研究沒有在病例組內(nèi)發(fā)現(xiàn)像16p11.2這樣的再發(fā)性基因組（recurrent CNV）［10］。

本研究對非多態(tài)性genic CNVs內(nèi)基因進(jìn)一步研究，病例組有1例樣本攜帶非多態(tài)性genic CNV重復(fù)，其中包括miR223基因。miRNA是一類廣泛存在于真核系統(tǒng)中的非編碼小RNA，在基因表達(dá)和基因調(diào)控的整個(gè)過程中起重要作用。Chen et al［11］在研究造血系統(tǒng)分化相關(guān)的miRNA時(shí)首次發(fā)現(xiàn)miR223，并且在骨髓中優(yōu)勢表達(dá)。隨后，相關(guān)文獻(xiàn)［12］報(bào)道m(xù)iR223與造血系統(tǒng)增殖分化密切相關(guān)，如髓系祖細(xì)胞增殖和招募紅系祖細(xì)胞及維持其干性等；miR223異常表達(dá)與免疫系統(tǒng)疾病/血液系統(tǒng)及實(shí)體性惡性腫瘤相關(guān)，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，急性淋巴細(xì)胞白血病，胃癌等。目前尚未見miR223與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的報(bào)道。本研究首次在NTDs患者中發(fā)現(xiàn)該基因，提示miR223可能在神經(jīng)管發(fā)育方面起重要作用。

同時(shí)發(fā)現(xiàn)1例NTDs樣本攜帶非多態(tài)性genic CNV缺失，其中包括CALR3基因。CALR3屬于鈣網(wǎng)蛋白基因。目前研究［13］證實(shí)CALR3突變（R73Q/K82R）可導(dǎo)致肥厚性心肌病的發(fā)生。對其同源基因CALR研究［7］顯示，50%的CALR基因敲除小鼠有心肌病的表型，16%有無腦兒表型。CALR3呈顯性遺傳模式，目前發(fā)現(xiàn)的變異均為新發(fā)突變。本研究該樣本為無腦兒，因缺少父母樣本，無法排除其父母來源。但在美國波士頓兒童醫(yī)院臨床分子診斷實(shí)驗(yàn)室CNVs數(shù)據(jù)庫和首都兒科研究所分子遺傳實(shí)驗(yàn)室300個(gè)智力低下及正常父母CNVs數(shù)據(jù)庫及對照組中均未發(fā)現(xiàn)該片段的缺失或者重復(fù)，這些表明CALR3基因可能是神經(jīng)管發(fā)育畸形新的候選基因，有必要做進(jìn)一步的人群驗(yàn)證研究。

綜上所述，本研究應(yīng)用Array-CGH方法發(fā)現(xiàn)非多態(tài)性genic CNVs的富集是NTDs發(fā)生的危險(xiǎn)因素。Array-CGH方法作為一種細(xì)胞遺傳學(xué)方法在研究NTDs的發(fā)病原因上具有重要的應(yīng)用價(jià)值，可以幫助尋找新的人類NTDs候選基因。province：a combined epidemiological approach［J］.Birth Defects Res A Clin Mol Teratol，2007，79（10）：702-7.

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Application ofm icroarray com parative genom ic hybridization to investigate the relationship between cranial neural tube defects and genom ic copy number variations

Wang Jing1，Guo Liu2，Cai Chunquan3，et al
（1Reproductive Medicine Center，Clinical College of PLA Affiliated AnhuiMedical University，The 105th Hospital of PLA，Hefei 230031；2Dept of Neurology，Children Hospital of Capital Institute of Pediatrics，Beijing 100020；3Dept of Neurosurgery，Children's Hospital of Tianjin，Tianjin 300074）

Objective To investigate the pathogenic role of genomic copy number variations（CNVs）in the cranialneural tube defects，the genomic CNVswere screened in the caseswith cranial neural tube defects and matched controls usingmicroarray comparative genomic hybridization（Array-CGH）.Methods The genomic DNA from 51 cases with cranial neural tube defects cases and 75 matched controlswere subjected for whole genome CNVs analysis via the Oligo 244 k microarray chip.For genomic CNVs detected，the database of genomic variantswas used as a filter to remove the benign polymorphic CNVs.To the remained non-polymorphic CNVs，non-polymorphic genic CNVs or non-polymorphic ciliogenic CNVswere named depending on whether the non-polymorphic CNVs contained a reference gene or a cilia gene.ThenΧ2test was applied to analyze the correlation between genomic CNVs and cranial neural tube defects.Results 48 and 33 non-polymorphic CNVswere detected in cases and controls respectively.Among them，37 and 26 CNVs involved genes（non-polymorphic genic CNVs）.Significantly more nonpolymorphic CNVs and non-polymorphic genic CNVs were detected in cranial neural tube defects patients than in the control（52.9%vs32.0%，P＜0.05；49.0%vs26.6%，P＜0.05）.Non-polymorphic genic CNVswere associated with a 2.644-fold increased risk for cranial neural tube defects（OR=2.644）.Conclusion Evidence from the genome-wide CNV study suggests that genic CNVs are associated with cranial neural tube defects.

array comparative genomic hybridization；cranial neural tube defects；genomic copy number variations

R 714.7；R 715.5

A

1000-1492（2016）05-0686-06

2013-03-14接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81370708、81401207）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃（編號：14JCYBJC25000）；天津市衛(wèi)生行業(yè)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（編號：12KG116）；天津市衛(wèi)計(jì)委科技基金（編號：2015K1212）

1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬解放軍臨床學(xué)院生殖中心，合肥230031

2首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院神經(jīng)科，北京 1000203天津市兒童醫(yī)院神經(jīng)外科，天津 300074

4首都兒科研究所北京市兒童發(fā)育和營養(yǎng)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100020

5鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州450001

6哈佛醫(yī)學(xué)院波士頓兒童醫(yī)院，麻省，美國 02112

汪 靜，女，碩士研究生；

姜 宏，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：jiangh105@sina.com