王正印，潘麗紅，汪學(xué)龍

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

日本血吸蟲SJIR-2納米微球核酸疫苗的免疫保護(hù)性研究

王正印1，潘麗紅2，3，汪學(xué)龍

目的 研究日本血吸蟲胰島素受體-2（SJIR-2）納米微球核酸疫苗對(duì)小鼠攻擊感染的免疫保護(hù)效果。方法 構(gòu)建pEGFP-SJIR-2重組質(zhì)粒，雙酶切鑒定并測(cè)序，大量提取pEGFP-SJIR-2質(zhì)粒，用殼聚糖（CHS）修飾的聚乳酸 -羥基乙酸共聚物（PLGA）微球包裹，用包裹后的SJIR-2納米微球免疫小鼠。將40只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組（n=10），分別注射PBS、空 pEGFP質(zhì)粒、CHS-PLGA微球和CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2微球各100μg免疫小鼠，末次免疫2周后，用日本血吸蟲尾蚴攻擊感染小鼠，每次免疫及感染尾蚴前收集各組小鼠血清，ELISA法檢測(cè)各組小鼠血清內(nèi)免疫球蛋白（IgG）水平的變化。小鼠感染尾蚴42 d后全部剖殺，收集成蟲和蟲卵并計(jì)算減蟲率和減卵率。結(jié)果 成功構(gòu)建了pEGFP-SJIR-2重組質(zhì)粒，與 PBS組比較，CHS-PLGA-pEGFPSJIR-2組的成蟲數(shù)和蟲卵數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2組的減蟲率和減卵率分別為37.36%和46.82%，和PBS組相比，CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2組小鼠血清內(nèi)IgG水平比明顯增高（P＜0.01），而pEGFP組和CHS-PLGA組成蟲數(shù)和蟲卵數(shù)與PBS組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 SJIR-2納米微球核酸疫苗對(duì)感染血吸蟲的BALB/c小鼠有一定的免疫保護(hù)效果，對(duì)其潛在的候選抗原疫苗的價(jià)值尚需深入研究。

日本血吸蟲；SJIR-2基因；核酸疫苗；聚乳酸-羥基乙酸共聚物

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-4-1911：04：48 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.002.html

血吸蟲病仍是21世紀(jì)嚴(yán)重危害發(fā)展中國(guó)家人民健康的寄生蟲病。多年來，控制血吸蟲病主要以化療為主，但如何降低血吸蟲病的再感染率及提高易感人群的免疫保護(hù)力等問題仍未得到解決［1］。研制血吸蟲病疫苗成了血吸蟲病研究方面的熱點(diǎn)［2-3］。目前為止已篩選出10多個(gè)亞單位候選抗原分子［4］。國(guó)內(nèi)雖也有學(xué)者在血吸蟲疫苗的研究方面取得了一定的成績(jī)，但至今都沒有理想的血吸蟲疫苗問世。如馬茜茜等［5］構(gòu)建的pET28a（+）SjBAD重組疫苗可獲得30.82%的減蟲率和42.52%的減卵率。為篩選出更具保護(hù)力的血吸蟲疫苗候選抗原分子，該實(shí)驗(yàn)采用微球包裹技術(shù)，用CHS修飾的PLGA微球?qū)EGFP-SJIR-2質(zhì)粒包裹起來作為疫苗免疫小鼠，觀察其免疫指標(biāo)，探討該疫苗在防治血吸蟲病中的作用。

1　材料與方法

1.1材料 日本血吸蟲、真核表達(dá)載體pEGFP均來自安徽醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室。含尾蚴的陽性釘螺購自江蘇省血吸蟲病防治研究所。

1.2主要試劑 TRIzol試劑和Lipo2000（美國(guó)Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Fermentas公司）；rTaq mix（日本TaKaRa公司）；XmaⅠ、PstⅠ和T4連接酶（北京NEB公司）；質(zhì)粒小量提取試劑盒（美國(guó)Axygen公司）；質(zhì)粒大量提取試劑盒（北京康為世紀(jì)公司）；DNA膠回收試劑盒（德國(guó)QIAGEN公司）；HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG（北京全式金公司）；ELISA試劑盒（武漢華美生物公司）。

1.3RT-PCR 根據(jù)TRIzol試劑說明書提取日本血吸蟲的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，SJIR-2基因擴(kuò)增引物F：5′-GCTGCAGTATGCTAAATATATTGGCTCA ACATG-3′，R：5′-CCCCGGGATAAGCTAAATCTCCATTTGTAATTGTT-3′進(jìn)行PCR反應(yīng)。取5μl PCR產(chǎn)物，用含EB的1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增結(jié)果；按DNA膠回收試劑盒的說明進(jìn)行目的片段的回收和純化。

1.4PCR產(chǎn)物和載體pEGFP的酶切及純化 取PCR產(chǎn)物和pEGFP載體各10μl，用限制性內(nèi)切酶XmaⅠ和PstⅠ進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，按照DNA膠回收試劑盒說明書進(jìn)行酶切片段的回收和純化。

1.5SJIR-2基因與pEGFP的重組與鑒定 將雙酶切后膠回收的SJIR-2基因和pEGFP載體按摩爾比3～10∶1的比例用1μl T4連接酶于16℃過夜進(jìn)行連接反應(yīng)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，從培養(yǎng)12～16 h的卡那抗性培養(yǎng)平板上挑取若干單克隆分別放入3 ml含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37℃，200 r/min振搖過夜，按照質(zhì)粒小量提取試劑盒的步驟提取質(zhì)粒。采用雙內(nèi)切酶切法、PCR法鑒定重組基因，把雙酶切、PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒送公司測(cè)序，并進(jìn)行Blast比對(duì)分析。

1.6pEGFP-SJIR-2質(zhì)粒的大量提取及PLGA包裹質(zhì)粒微球的制備 按照質(zhì)粒大量提取試劑盒的步驟提取大量質(zhì)粒，寄給無錫納生生物科技有限公司，由公司制備實(shí)驗(yàn)所需的PLGA納米微球。

1.7免疫動(dòng)物 將40只5～6周的雌性SPF級(jí)BALB/c小鼠（18～20 g）隨機(jī)分為PBS組、pEGFP組、CHS-PLGA組和CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2組，每組10只，分別在4組小鼠左后肢股四頭肌注射100 μg PBS、pEGFP、CHS-PLGA和 CHS-PLGA-pEGFPSJIR-2，每組小鼠免疫3次，每次間隔2周，每次免疫前進(jìn)行尾靜脈采血，分離血清，ELISA法檢測(cè)各組小鼠血清內(nèi)IgG水平的變化。

1.8攻擊感染 末次免疫2周后，每只小鼠經(jīng)腹壁感染（40±1）條日本血吸蟲尾蚴，42 d后剖殺全部小鼠，以門靜脈灌注法收集成蟲并計(jì)數(shù)，稱取肝臟后加入5%的NaOH消化2 h，置于顯微鏡下進(jìn)行蟲卵計(jì)數(shù)計(jì)算每克肝的蟲卵數(shù)，按以下公式計(jì)算減蟲率和減卵率。減蟲率（%）=（對(duì)照組平均蟲體數(shù)-實(shí)驗(yàn)組平均蟲體數(shù)）/對(duì)照組平均蟲體數(shù)×100%；減卵率（%）=（對(duì)照組平均蟲卵數(shù)-實(shí)驗(yàn)組平均蟲卵數(shù)）/對(duì)照組平均蟲卵數(shù)×100%。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 將數(shù)據(jù)錄入Excel表中，采用GraphPad Prism 6.01進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以ˉx±s表示，多組間比較采用 ANOVA分析，組間兩兩比較用Dunnett′s法，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2　結(jié)果

2.1目的基因SJIR-2 PCR擴(kuò)增結(jié)果 提取日本血吸蟲的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，用SJIR-2基因擴(kuò)增引物SJIR-2-F、SJIR-2-R，得到目的基因片段1 575 bp，電泳結(jié)果與預(yù)期一致。見圖1。

2.2重組質(zhì)粒pEGFP-SJIR-2的鑒定 經(jīng)過限制性內(nèi)切酶XmaⅠ和PstⅠ雙酶切可以得到2個(gè)片段，即1 575 bp目的基因片段和約4 700 bp的載體pEGFP片段（圖1），經(jīng)上海生物工程試劑公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast比對(duì)與SJIR-2基因序列同源性為100%。

2.3PLGA納米微球的制備及粒徑分布與分散性的檢測(cè) 按照質(zhì)粒大量提取試劑盒說明提取大量pEGFP-SJIR-2質(zhì)粒并寄給無錫納生生物科技有限公司，由公司制備實(shí)驗(yàn)所需的PLGA納米微球，取適量的CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2納米微球，利用激光粒度分析儀檢測(cè)微球的粒徑分布和多分散性，測(cè)得微球的平均粒徑大小為232.5 nm，多分散指數(shù)為0.395，分散性較好。見圖2。

圖1　SJIR-2的　PCR擴(kuò)增結(jié)果及pEGFP-SJIR-2重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果M：DL5000 DNA Marker；1：雙酶切驗(yàn)證；2：pEGFP-SJIR-2重組質(zhì)粒；3：PCR驗(yàn)證；4：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2　CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2納米微球的粒徑分布

2.4小鼠體內(nèi)IgG動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 與PBS組比較，每次免疫前和感染前pEGFP組和CHS-PLGA組IgG抗體水平變化不明顯，CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2組隨著免疫次數(shù)的增加IgG抗體水平明顯增高，與PBS組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖3。

2.5PLGA納米微球核酸疫苗對(duì)小鼠的免疫保護(hù)效果 4組小鼠感染血吸蟲尾蚴后，CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2組平均獲蟲數(shù)和每克肝卵數(shù)與PBS組、pEGFP組和CHS-PLGA組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），該疫苗可誘導(dǎo) BALB/c小鼠產(chǎn)生37.36%的減蟲率（F=49.89，P＜0.01）和 46.82%的減卵率（F=223.1，P＜0.01），見表1。

表1　PLGA納米微球核酸疫苗免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)的減蟲率和減卵率（xˉ±s，n=10）

表1　PLGA納米微球核酸疫苗免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)的減蟲率和減卵率（xˉ±s，n=10）

與　PBS組比較：**P＜0.01

組別攻擊尾蚴數(shù)（條）平均獲蟲數(shù)（條）減蟲率（%）平均每克肝卵數(shù)減卵率（%）PBS組40±1　27.30±2.83　-　78 831.90±5 192.89　-pEGFP組　40±1　26.70±2.11　-　78 224.40±3 464.39　-CHS-PLGA組　40±1　26.10±2.03　-　77 167.20±3 375.72　-CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2組　40±1　17.10±1.45**　37.36　41 929.50±2 876.20**46.82

圖3　小鼠體內(nèi)　IgG的動(dòng)力學(xué)檢測(cè)與PBS組比較：**P＜0.01

3　討論

和其他材料相比，納米載體可以使藥物的包埋率增加，由于藥物包埋在納米材料中使得藥物在血液中緩慢釋放，延長(zhǎng)了藥物的半衰期，從而改善生物利用率和提高治療效果，是目前制備疫苗的最佳輔助材料之一。PLGA是一種可生物降解高分子聚合物，在20世紀(jì)70年代即被用作外科縫線及體內(nèi)埋植材料，其生物相容性好，無免疫反應(yīng)性。PLGA在體內(nèi)緩慢降解為乳酸、乙醇酸，最后轉(zhuǎn)化為水和二氧化碳，安全性也較高，近年來，已被美國(guó)食品及藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)應(yīng)用于制藥行業(yè)［6］。CHS也有良好的生物相容性、可降解性和組織黏附性，并有助于大分子穿過組織黏膜表面，是良好的非病毒基因載體。同時(shí)利用CHS修飾的PLGA納米微球在溫和條件下凝集（或濃縮）DNA分子可以減少有機(jī)溶劑以及乳液分散時(shí)的剪切力對(duì)DNA穩(wěn)定性和完整性的破壞，國(guó)內(nèi)有很多學(xué)者成功制備了PLGA陽離子納米微球，如楊恩蕓等［7］制備出粒徑為142 nm的 CHS/PLGA（PTX）陽離子納米微球；鄒家龍等［8］采用復(fù)乳法成功制備了用不同濃度CHS修飾的PLGA（OVA）陽離子納米微球；馬方奎等［9］采用乳化溶劑揮發(fā)技術(shù)和共價(jià)交聯(lián)技術(shù)合成了殼聚糖聚乳酸羥基乙酸（殼聚糖PLGA）的3種納米載體等等。

研究［10］表明血吸蟲胰島素受體和人類胰島素受體在配體區(qū)域有相同的結(jié)合機(jī)制，在酪氨酸激酶區(qū)域有一樣的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)加工。血吸蟲胰島素受體雖然和人類胰島素受體相似也是由2個(gè)α亞基和兩個(gè)β亞基組成，α亞基位于細(xì)胞外，其上有胰島素結(jié)合位點(diǎn)，β亞基位于細(xì)胞內(nèi)，其上有酪氨酸激酶區(qū)，負(fù)責(zé)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。但是在血吸蟲胰島素受體的酪氨酸激酶區(qū)有一段由102個(gè)氨基酸組成的插入序列，該段序列有螺旋結(jié)構(gòu)，有很特異的抗原性，這是人類胰島素受體所并不具備的，并且研究［10］還顯示血吸蟲胰島素受體和人類胰島素受體從α亞基的配體區(qū)到β亞基的酪氨酸激酶區(qū)整個(gè)三維結(jié)構(gòu)的相似度只有17.3%～44.6%，所以，使用血吸蟲胰島素受體疫苗可以避免宿主自身免疫的發(fā)生。另外，血吸蟲除了能應(yīng)答自身內(nèi)在的內(nèi)分泌激素外，也能接受宿主激素信號(hào)調(diào)控增殖、發(fā)育和交配［11］。在血吸蟲童蟲和成蟲表面表達(dá)的膜蛋白是疫苗和藥物研制合理的目標(biāo)［12］，而胰島素受體就是膜蛋白，可以作為疫苗的候選抗原分子。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了pEGFP-SJIR-2重組質(zhì)粒，通過乳化技術(shù)用CHS修飾的PLGA納米微球包裹 pEGFP-SJIR-2重組質(zhì)粒，制備成緩釋微球，用該納米微球核酸疫苗免疫小鼠，結(jié)果顯示這種納米微球核酸疫苗可以使小鼠產(chǎn)生較高的抗體水平，可獲得37.36%的減蟲率和46.82%的減卵率，對(duì)小鼠有一定的免疫保護(hù)效果，但是在以后的應(yīng)用中還有待更進(jìn)一步的研究。

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Immuno-protection of SJIR-2 DNA vaccine w ith m icrospheres ad juvant in m ice challenged w ith Schistosoma japonicum

Wang Zhengyin1，Pan Lihong2，3，Wang Xuelong1
（1Dept of Parasitology，AnhuiMedical University，Hefei 230032；2Dept of Microbiology and Parasitology，Anqing Medical and Pharmaceutical College，Anqing 246052；3Dept of Microbiology and Parasitology，Zhejiang Medical College，Hangzhou 310053）

Objective To research the immuno-protection of SJIR-2 DNA vaccine with nanometermicrospheres against Schistosoma japonicum infection in mice.Methods To construct eukaryotic expression plasmid pEGFPSJIR-2，identified by double digestion and sequenced delivery.The recombinant plasmid pEGFP-SJIR-2 was extracted and was encapsulated into PLGA nanometermicrosphereswhich weremodified by CHS.40 female BALB/c mice were randomly divided into 4 groups（n=10），each group ofmice were injected with PBS，empty pEGFP plasmid，CHS-PLGA nanometermicrospheres and CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2 nanometermicrospheres100μg，respectively.Two weeks after the last immunization，each mouse was infected by cercaria of Schistosoma japonicum，sera ofmice in each group were collected before each immunization and challenge infection.ELISA was used to detect the change of IgG in each group ofmicesera.42 days later，allmicewere sacrificed.The adultworms and eggs were collected and counted，and the worm and egg reduction rateswere calculated aswell.Results The recombinant plasmid pEGFP-SJIR-2 was successfully constucted，and there was significant difference in the numbers of worm and egg between CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2 group and PBS group（P＜0.01）.The worm andegg reduction rates in CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2 group were 37.36%and 46.82%respectively.The IgG levels in mice sera of CHS-PLGA-pEGFP-SJIR-2 group were remarkably higher（P＜0.01）compared with PBS group.On the contrary，there was no significant difference between both pEGFP plasmid group and CHS-PLGA group in the numbers of worm and egg compared with PBS group.Conclusion SJIR-2 nanometer microspheres nucleic acid vaccine has some immuno-protection against Schistosoma japonicum infection in BALB/cmice，while it isworth further studying for it's potential value to be a candidate antigen molecule of Schistosoma japonicum vaccine.

Schistosoma japonicum；SJIR-2 gene；nucleic acid vaccine；poly（lactic-co-glycolic acid）

R 383.24

A

1000-1492（2016）05-0611-04

2016-01-18接收

安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào)：KJ2013A183）

1安徽醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室，合肥 230032

2安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校微生物與寄生蟲學(xué)教研室，安慶246052

3浙江醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校微生物與寄生蟲學(xué)教研室，杭州310053

王正印，男，碩士研究生；

汪學(xué)龍，男，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wangxl1964@163.com；

潘麗紅，女，教授，責(zé)任作者，E-mail：panlh1114@126.com