李盼盼，何婧琳，李　婷，楊　嬋，肖　慧，黃思穎，曹　忠

（長沙理工大學化學與生物工程學院，電力與交通材料保護湖南省重點實驗室，微納生物傳感與食品安全檢測協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙410114）

基于核酸適配體和核酶的功能化核酸傳感方法研究

李盼盼，何婧琳*，李婷，楊嬋，肖慧，黃思穎，曹忠*

（長沙理工大學化學與生物工程學院，電力與交通材料保護湖南省重點實驗室，微納生物傳感與食品安全檢測協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙410114）

在生物分子的研究中，核酸適配體和DNA核酶是具有特殊功能的核酸分子。該綜述討論了這些功能分子、其傳統(tǒng)篩選過程、獨特的性質和它們在生物傳感領域中的應用。核酸適配體和DNA核酶在分子識別的研究方面起到非常大的作用，這些特別的應用顯示功能核酸在基因學和蛋白質學中具有極大潛力。

核酸適配體；SELEX技術；DNA核酶；傳感分析

0　引言

隨著科學研究的快速發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)核酸分子除了能夠和序列互補的核酸分子進行雜交外，某些特定序列還具有特殊功能，如能高特異性結合靶分子或類似輔酶的催化功能，人們把這類具有特殊功能的核酸分子稱為功能核酸［1-3］。功能核酸的出現(xiàn)拓寬了人們的視野，打破了人們對核酸只作為遺傳信息存儲和轉運載體的傳統(tǒng)觀念，加深了對核酸的進一步理解，并且為生物分子的研究提供了新的視角［4］。由于功能核酸在分子識別方面的特殊功能，在生化分析和生物傳感領域的研究者越來越多的應用功能核酸，并建立了一系列以功能核酸為分子探針的檢測體系。在生物傳感體系中，由于功能核酸不僅保持了核酸本身的特性，而且還能高特異性結合某些特定的目標分子或以其作為輔酶對某些反應進行催化，因此功能核酸大大擴展了人們對核酸分子的研究和利用。

隨著分析科學、分子生物學等學科的發(fā)展及計算機技術的不斷更新，為人們研究功能核酸與其靶分子目標物之間的結合作用機理提供了更多可能性。在通常情況下，體外的功能核酸是以隨機自由態(tài)的空間構象存在，然而有目標分子存在時，功能核酸通過堿基之間的互補配對、靜電作用力、氫鍵、疏水堆積作用、范德華力等與目標分子緊密結合，使核酸鏈折疊引發(fā)構象改變，最終形成熱力學穩(wěn)定的空間構象，如發(fā)夾（hairpin）、莖環(huán)（stem-loop）、假結（pseudoknot）、G-四鏈體（G-quartet）等結構［5-7］。這種空間構象、微環(huán)境的變化為生物傳感器的設計與建立提供了良好的平臺。

1　功能核酸的產生-SELEX技術

20世紀90年代，Ellington［8］和Tuerk［9］等報道通過利用一種基于隨機寡核苷酸文庫進行體外篩選和擴增相結合的方法，成功篩選出了能高特異性吸附噬菌體T4 DNA聚合酶和有機染料分子的寡核苷酸配基，并將這種新的篩選技術稱為指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）。SELEX技術是一種分子進化工程技術，其篩選過程類似于達爾文進化理論。利用SELEX技術可以篩選出由體外化學合成的具有一定特殊功能的寡核苷酸。SELEX技術篩選過程如圖1所示［10］，首先通過體外化學合成一個高容量的單鏈寡核苷酸文庫，該文庫可以是由DNA文庫、RNA文庫或者是修飾化的RNA文庫組成；其次通過模擬大自然的進化，采用特定方法純化分離將文庫中弱親和力和無特異性的核酸序列排除，再用PCR儀進行擴增，進入下一輪篩選，經過多次重復篩選、分離、擴增可將高親和力的核酸序列指數(shù)放大富集，最終獲取與靶分子具有高親和力的功能核酸。

SELEX技術創(chuàng)立至今經過了20多年的發(fā)展，已經出現(xiàn)了多種靈活的篩選方式。其中篩選的靶分子也從最初的重金屬離子、有機小分子、蛋白質、核酸等發(fā)展到細胞、組織，甚至整個有機體。SELEX技術不僅在生物分子領域有著廣泛的應用，在環(huán)境檢測、疾病診斷、藥物篩選等領域也顯示出良好的應用前景［11-12］。

2　功能核酸的分類及特點

目前，利用SELEX技術可以篩選出能高特異性結合靶分子，具有分子識別功能的一類DNA或者RNA分子，即核酸適配體（aptamer）［13］。同樣，該技術還可以篩選出另一類功能核酸，它們是具有催化活性和結構識別能力的單鏈RNA或DNA片段，即核酶（RNAzyme）和脫氧核酶（DNAzyme）［14-15］。除此之外，還有一些具有其他功能的核酸，如富含T的核酸序列能特異性識別Hg2+形成“T-Hg2+-T”結構［16-19］；富含C的核酸序列能特異性識別Ag+形成“C-Ag+-C”結構［20-21］；富含G的核酸序列能特異性識別K+或Pb2+形成G-四鏈體結構［22-23］及具有發(fā)夾結構的莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針的分子信標［24-26］。

圖1　SELEX技術篩選過程示意圖［10］Fig.1　Scheme for a selection process by SELEX［10］

由于功能核酸的空間結構及與配體相互作用的多樣性，通過SELEX技術篩選的靶標物不僅有金屬離子、有機小分子、肽、蛋白質，甚至發(fā)展到了細菌、細胞、病毒、組織等。通過體外篩選和擴增得到的功能核酸不但和抗體一樣能與靶分子高特異性結合，而且還具有許多抗體、蛋白質沒有的優(yōu)點，其特點主要體現(xiàn)在如下方面：

（1）所識別的靶分子范圍廣。從金屬離子、有機小分子到生物大分子，如酶、氨基酸、生長因子、毒素、核苷酸、細胞粘附分子等，甚至于病毒、細菌和細胞均已篩選出相應的功能核酸。

（2）親和力強，特異性高。篩選出的一些核酸適配體與靶分子之間的解離常數(shù) （Kd）可以達nmol/L到pmol/L水平，甚至fmol/L。例如NeXstar Pharmaceuticals公司和科羅拉多大學篩選的100種蛋白質的適配體中，75%以上的適配體的解離常數(shù)都小于 1 nmol/L；血管內皮生長因子（VEGF165/164）與其適配體的解離常數(shù)為49 pmol/L［27］；細胞生長因子與其適配體的解離常數(shù)甚至達到0.3 pmol/L［28］。另外，功能核酸不僅能識別靶標物的一個羥基或甲基的細小變化，甚至還能夠區(qū)分旋光異構體。例如，咖啡因和茶堿僅有一個甲基的差別，然而茶堿與其適配體的結合力比咖啡因的強出10000倍［29］；L-精氨酸與其適配體的親和力比D-精氨酸高12000倍［30］。

（3）體外合成與篩選、易于修飾。蛋白質（如抗體）的經典制備方法是在生物體系中通過對目標物進行誘導免疫應答獲得，當目標分子和內源性蛋白結構相似或抗原具有毒性時，可能會導致免疫應答反應失敗，即受到免疫原性、機體耐受性等多種因素的限制。而功能核酸的篩選可利用SELEX技術在生物體外進行，并能進行精確的位點修飾，如同位素標記、熒光標記、生物素標記、電化學探針及猝滅基團修飾等。

（4）性質穩(wěn)定，便于運輸和保存。功能核酸在多數(shù)情況下即使變性后其活性也可恢復，且保存時間長，凍成干粉后還可以在室溫保存數(shù)年甚至更久。而蛋白質對環(huán)境的耐受程度低，在高溫、強酸、強堿等比較苛刻的化學環(huán)境下很容易產生變性，且該變性多為不可逆過程，其保存時間也相對較短。

（5）功能核酸大多數(shù)具有靶分子誘導構象變化，無毒性，無免疫原性，組織滲透性好。由于功能核酸具有核苷酸固有的性質，可以與某些DNA 或RNA分子相互融合，形成具有復合功能的序列，既能特異性識別目標物，同時又能產生可檢測的信號［31］。

3　功能核酸在生物傳感器中的應用

隨著SELEX技術的快速發(fā)展，功能核酸的應用也越來越受到研究者們的關注。由于功能核酸制備簡單快速、穩(wěn)定性強、易于修飾、對目標分子特異性強等優(yōu)點，在分離分析、納米技術、有機合成、藥物研發(fā)、臨床診斷、靶向藥物輸送以及構建生物傳感器等領域有著非常大的應用前景，是目前科學研究的熱門課題。在構建的功能核酸傳感器中，根據(jù)功能核酸的分類不同，將其分為基于核酸適配體的傳感器，基于脫氧核酶的傳感器和基于其他功能核酸的傳感器。

3.1基于核酸適配體的傳感器

核酸通過堿基配對、靜電作用、氫鍵及疏水堆積等原因發(fā)生折疊，形成較為穩(wěn)定的空間結構，這些空間結構由于氫鍵、范德華力及形狀匹配等作用與目標分子特異性結合，可以成為該目標分子的識別元件。人們把含有這種識別元件的生物傳感器稱為基于核酸適配體的傳感器。

目前，科學研究者已構建了多種核酸適配體傳感器用于各種目標物的檢測。

如核酸適配體與熒光共振能量轉移、電致發(fā)光以及比色法等不同的信號傳導機制結合，可以直接用于無機離子和小分子的快速檢測。例如，鉀離子（K+）適配體（5'-GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3'）是一條富含G的單鏈核苷酸序列。當該適配體與目標K+結合后，適配體通過鳥嘌呤G分子間的氫鍵作用力折疊成四鏈體構型。Wang等［32］基于該原理設計了一種使用金納米顆粒作為比色法指示劑的檢測K+的方法。如圖2所示，當K+不存在時，核酸適配體包裹金納米顆粒，加鹽后金納米顆粒不團聚，溶液呈紅色；當加入K+后，核酸適配體與K+結合，不能有效地保護金納米顆粒，加鹽后產生團聚，溶液顏色呈藍色。核酸適配體序列 （5'-CCTGGGGGAGTATTGCCGAGGAGGGT-3'）能高特異性結合腺苷形成三維結構。同樣，Li等［33］基于金納米顆粒和功能核酸適配體建立了一種檢測腺苷的方法。如圖3所示，在該實驗中，腺苷核酸適配體被分裂為兩段，分別修飾在不同的金納米顆粒表面，利用核酸適配體片段與目標腺苷之間高親和力，拉近金納米顆粒之間的距離，通過表面等離子體共振改變溶液顏色，從而實現(xiàn)對腺苷的定量檢測。

圖2　核酸適配體傳感器比色法檢測K+原理示意圖［32］Fig.2　The schematic of potassium ion detection based on Aptamer［32］

圖3　基于金納米顆粒的核酸適配體傳感器用于腺苷的檢測原理示意圖［33］Fig.3　The schematic of adenosine detection based on Aptamer［33］

3.2基于脫氧核酶的傳感器

長期以來，人們都認為只有某些特殊的蛋白質才具有生物催化活性，研究者們也一直采用“酶的化學本質為蛋白質”的理論。1981年，Cech小組［34］報道了四膜蟲26SRNA前體的體外自我剪切，提出了RNA具有酶的催化活性，打破了 “生物酶的化學本質是蛋白質”的傳統(tǒng)理念。1994年，Joyce等［35］利用催化洗脫手段和體外篩選技術發(fā)現(xiàn)了具有特異性催化Pb2+切割RNA底物的DNA單鏈，即為脫氧核酶（DNAzyme）。同年，Cuenoud等［36］也發(fā)現(xiàn)了這種具有較高催化活性和良好結構識別能力的單鏈DNA。

隨著脫氧核酶的發(fā)現(xiàn)，許多脫氧核酶的熒光傳感器被設計來用于各種目標物的檢測，并且這些傳感器均具有靈敏度高、無生物毒性等優(yōu)點。例如，Li小組［37］設計了一種基于8-17脫氧核酶選擇性識別鉛離子（Pb2+）的熒光傳感器，其原理如圖4所示，將熒光基團（TAMRA）與猝滅基團（Dabcyl）分別標記于酶底物鏈的兩側，當有Pb2+存在時，脫氧核酶底物鏈會被切斷，3'端和5'端相互遠離，致使熒光基團和猝滅基團相互分離，體系熒光信號增強，從而實現(xiàn)對Pb2+的靈敏檢測。Plaxco等［38］利用8-17脫氧核酶把其5'端固定在金電極表面，同時在3'端標記了亞甲基藍，以此防止亞甲基藍接近電極傳遞電子。如圖5所示，在Pb2+存在下，催化脫氧核酶底物鏈裂解，使底物鏈斷裂為兩段，底物鏈兩片段解離后，亞甲基藍可以接近電極與其發(fā)生電子傳遞，從而產生可以檢測到的電信號。另外，Yang等［39］構建了一種基于脫氧核酶功能化金納米粒子的信號擴增反應檢測Pb2+的電化學傳感器，該方法的檢測下限達到0.028 nmol/L。

圖4　基于Pb2+的酶底物鏈兩標記的脫氧核酶傳感器設計原理圖［37］Fig.4　The schematic of lead ion detection based on DNAzyme［37］

圖5　基于Pb2+特異性切割的脫氧核酶及其電化學檢測傳感示意圖［38］Fig.5　The schematic of lead ion detection based on DNAzyme and electrochemical detection［38］

圖6　基于分子信標的脫氧核酶傳感器用于輔助因子ATP及NAD+的檢測原理示意圖［40］Fig.6　Design strategy of the DNAzyme cascade for amplified fluorescence detection of cofactor［40］

Lu等［40］設計將8-17脫氧核酶先分成兩個獨立的寡核苷酸片段，如圖6所示，在（ATP或 NAD+）輔助因子和連接酶的作用下使其連接起來，隨后引入一條外來的DNA鏈雜交使原8-17脫氧核酶被釋放出來，釋放出的8-17脫氧核酶與一具有發(fā)夾結構的分子信標底物結合生成具有催化功能的體系，從而實現(xiàn)對目標輔助因子ATP和NAD+的檢測。

3.3基于其他功能核酸的傳感器

核酸適配體與目標物通過分子間作用力可以特異性結合，人們發(fā)現(xiàn)，金屬陽離子也能直接與堿基作用發(fā)生特異性結合，其中較為典型的有汞離子（Hg2+）和銀離子（Ag+）。Hg2+能特異性結合胸腺嘧啶（Thymine，T）與其產生強的相互作用力，若單鏈中富含堿基T，在Hg2+存在的條件下，可以使單鏈DNA的構型發(fā)生轉變，形成T-Hg2+-T錯配結構。Ono等設計了一條兩端分別修飾了熒光基團和猝滅基團的富含T的DNA探針，當Hg2+存在時，由于形成T-Hg2+-T結構使熒光基團與猝滅基團相互靠近，繼而發(fā)生熒光共振能量轉移，使體系的熒光被猝滅，從而依據(jù)體系熒光信號的變化對Hg2+進行定量檢測。

類似的，Ag+與核酸鏈中的胞嘧啶（Cytosine，C）之間也有強的相互作用，能形成C-Ag+-C穩(wěn)定結構。如圖7所示，Yang等［41］設計合成了富含胞嘧啶C的DNA序列，在Ag+存在情況下，使單鏈DNA的構型轉變，形成C-Ag+-C錯配結構，在加入雙鏈嵌入劑熒光染料SYBR Green1（SG）后，SG可嵌入到C-Ag+-C雙鏈復合物中，使得SG的熒光增強。

圖7　基于形成C-Ag+-C熒光傳感器用于Ag+的檢測原理示意圖［41］Fig.7　Schematic description of the fluorescent Ag+sensing mechanism［41］

圖8　基于形成T-Hg2+-T及G-四鏈體結構傳感器用于檢測Hg2+的原理示意圖［42］Fig.8　Schematic description of the fluorescent Hg2+sensing mechanism［42］

另外，富含G的核酸序列能特異性識別K+或Pb2+形成G-四鏈體結構，例如，Wang等［42］設計利用T-Hg2+-T調節(jié)G-四鏈體DNA抑制脫氧核酶的活性，構建了一種比色法檢測Hg2+的傳感器，如圖8所示，當Hg2+存在時，富含T的DNA單鏈構型轉變，形成T-Hg2+-T結構，抑制了G-四鏈體DNA的形成，即無DNAzyme的生成。然而，當不存在Hg2+時，DNA單鏈在K+及血紅素的作用下，形成G-四鏈體DNA，伴隨ABTS的H2O2介導氧化反應，體系比色信號發(fā)生變化，從而實現(xiàn)對Hg2+的檢測。

4　結論與展望

SELEX技術自問世以來，在篩選技術上不斷豐富和完善，應用領域不斷拓展。功能核酸的出現(xiàn)拓寬了人們的視野，打破了人們對核酸只作為遺傳信息存儲和轉運載體的傳統(tǒng)觀念，加深了對核酸的進一步理解，并且為生物分子的研究提供了一種新的活性物質。由于功能核酸的特殊功能，在生化分析和生物傳感領域的研究者越來越多的應用功能核酸，并建立了一系列以功能核酸為分子探針的檢測體系。功能核酸制備簡單快速、穩(wěn)定性強、易于修飾、對目標分子特異性強等優(yōu)點，在分離分析、納米技術、有機合成、藥物研發(fā)、臨床診斷、靶向藥物輸送以及構建生物傳感器等領域有著非常大的應用前景。

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Study of aptamer and DNAzyme based functional nucleic acid sensing methods

Li Pan-pan，He Jing-lin*，Li Ting，Yang Chan，Xiao Hui，Huang Si-ying，Cao Zhong*
（Collaborative Innovation Center of Micro/nano Bio-sensing and Food Safety Inspection，Hunan Provincial Key Laboratory of Materials Protection for Electric Power and Transportation，School of Chemistry and Biological Engineering，Changsha University of Science and Technology，Changsha 410114，China）

This opinion covers the field of aptamers and DNAzymes，in which nucleic acids are molecularly engineered to have unique functions for the investigation of biomolecules.This review discusses these functional nucleic acids，their traditional selection approaches，special characteristics and the application in the analysis of biological sensing field.The aptamers and DNAzymes are highly useful for studies with molecular recognition.These unique applications have shown that functional nucleic acids hold great potential in genomics and proteomics.

aptamer；SELEX；DNAzyme；sensing analysis

國家自然科學基金（31527803，21545010）、中國科學院環(huán)境監(jiān)測STS項目（KFJ-SW-STS-173）

*通信聯(lián)系人，Tel/Fax：0731-85258733，E-mail：jinglin_he@163.com，zhongcao2004@163.com