謝順碧，袁　若

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715）

電化學(xué)生物傳感器中的信號(hào)放大技術(shù)的研究進(jìn)展

謝順碧，袁若*

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715）

在臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品分析和病原微生物研究等領(lǐng)域，快速、簡(jiǎn)單、靈敏的實(shí)現(xiàn)生物分子的檢測(cè)，是目前分析化學(xué)中極具吸引力的熱門研究課題之一。電化學(xué)生物傳感器由于其簡(jiǎn)單、成本低、靈敏度高和易于微型化等優(yōu)勢(shì)在生物分子檢測(cè)上得到了大力的開發(fā)和研究。關(guān)注電化學(xué)生物傳感器中的新方法和新技術(shù)，結(jié)合性能優(yōu)異的各種新型納米材料，引入有效的信號(hào)放大策略，對(duì)提高電化學(xué)生物傳感器的各項(xiàng)性能，實(shí)現(xiàn)對(duì)各種生物分子特異靈敏的檢測(cè)具有十分重要的意義。該文簡(jiǎn)要介紹了電化學(xué)生物傳感器的原理，重點(diǎn)評(píng)述了近幾年電化學(xué)生物傳感器中常用的信號(hào)放大技術(shù)的研究進(jìn)展。

電化學(xué)；生物傳感器；納米材料；信號(hào)放大技術(shù)

0　引言

生物傳感器是典型的多學(xué)科交叉和發(fā)展的產(chǎn)物，它結(jié)合了分析化學(xué)、生命科學(xué)、材料學(xué)、納米技術(shù)及信息科學(xué)技術(shù)等，是目前非常熱門的研究領(lǐng)域，具有十分重要的科學(xué)研究意義。其中，電化學(xué)生物傳感器很好地結(jié)合了電化學(xué)轉(zhuǎn)換裝置的高靈敏度以及生物識(shí)別體系的高選擇性，具有構(gòu)造簡(jiǎn)單、成本低廉、響應(yīng)速度快、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)、疾病診斷甚至活體分析等領(lǐng)域［1］。然而，隨著生命科學(xué)的大發(fā)展，對(duì)現(xiàn)有的分析方法提出了更高的要求，進(jìn)一步刺激了電化學(xué)生物傳感器的不斷進(jìn)步，對(duì)其選擇性、靈敏度、響應(yīng)速度及實(shí)用性等方面提出了極大的挑戰(zhàn)。因此，關(guān)注電化學(xué)生物傳感器中的新方法和新技術(shù)，結(jié)合性能優(yōu)異的各種新型納米材料，引入有效的信號(hào)放大策略，對(duì)提高電化學(xué)生物傳感器的各項(xiàng)性能，實(shí)現(xiàn)對(duì)各種生物分子特異靈敏的檢測(cè)具有十分重要的意義。該文擬簡(jiǎn)要介紹電化學(xué)生物傳感器的原理，重點(diǎn)評(píng)述近年來電化學(xué)生物傳感器中信號(hào)放大技術(shù)的研究進(jìn)展。

1　電化學(xué)生物傳感器

電化學(xué)生物傳感器在構(gòu)建時(shí)，通常將抗體、酶、適體、多肽等生物敏感物質(zhì)或細(xì)胞器、細(xì)胞、組織等生物本身作為識(shí)別元件，電極作為轉(zhuǎn)換元件，將生物識(shí)別元件通過生物固定化技術(shù)固定在電極上，電極將生物分子間特異性識(shí)別產(chǎn)生的各種物理、化學(xué)等信號(hào)轉(zhuǎn)換成電阻、電位、電流或電容等物理量形式作為特征檢測(cè)信號(hào)輸出，從而實(shí)現(xiàn)被測(cè)物的檢測(cè)，工作原理如圖1所示。

圖2　以MWCNTs/PPy/PAMAM為電極基底材料實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的原理圖［6］Fig.2　Schematic representation of the MWCNTs/PPy/ PAMAM as electrode substrate material for signal amplification［6］

2　電化學(xué)生物傳感器的信號(hào)放大技術(shù)

為了滿足分析方法中對(duì)痕量及超痕量生物分子檢測(cè)的要求，研制具有選擇性好、靈敏度高、響應(yīng)快速的電化學(xué)生物傳感器具有十分重要的意義。為了提高檢測(cè)靈敏度，將信號(hào)放大策略運(yùn)用到生物傳感器中是最常用的方法。近年來，隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展及多種生物技術(shù)的興起，涌現(xiàn)出了多種的信號(hào)放大策略，下面就各類信號(hào)放大方法分別作簡(jiǎn)要介紹。

2.1納米材料放大技術(shù)

近年來，納米技術(shù)飛速發(fā)展，納米材料因其特殊的物理化學(xué)性質(zhì)（如量子尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)等）而具有獨(dú)特的電化學(xué)及光學(xué)性質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于生物傳感器的構(gòu)建中，為研制性能優(yōu)良的生物傳感器開創(chuàng)了新的局面［1-4］。生物傳感器界面的修飾與構(gòu)建是制備生物傳感器最基本和最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，對(duì)生物傳感器的靈敏度，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性等有直接的影響。將不同性能、結(jié)構(gòu)和形態(tài)的納米材料引入敏感界面的構(gòu)建過程中，利用納米材料好的吸附能力，強(qiáng)的生物相容性，高的比表面積，良好的導(dǎo)電性能和催化性能等優(yōu)點(diǎn)，能夠穩(wěn)定生物傳感界面，有效放大檢測(cè)信號(hào)，顯著提高生物傳感器的各項(xiàng)分析性能。概括來講，在電化學(xué)生物傳感器中納米材料主要可以通過以下幾種途徑實(shí)現(xiàn)響應(yīng)信號(hào)的放大。

第一，作為電極基底材料構(gòu)建傳感平臺(tái)。利用納米材料強(qiáng)的吸附能力、大的比表面積可將分子識(shí)別元件有效地固載到電極表面并保持電極表面的穩(wěn)定性。此外，以納米材料為電極基底材料，能夠極大的增加電極表面的有效面積，促進(jìn)電子傳輸效率，從而改善傳感器的分析性能。由于納米金能夠與生物分子中含有的巰基和氨基作用且易于合成修飾，是生物傳感器構(gòu)建過程中最為常用的一種納米材料。Li等［5］以電沉積的樹枝狀納米金為電極基底材料，用于固載巰基修飾的捕獲DNA并改善傳感界面的導(dǎo)電性，構(gòu)建了用于Pb2+檢測(cè)的電化學(xué)傳感器。

碳納米管（CNTs）也是一種常用的電極基底材料。Miodek等［6］利用第四代聚酰胺樹形高分子修飾聚吡咯功能化的多壁碳納米管形成的納米復(fù)合材料（MWCNTs/PPy/PAMAM）為電極基底材料，構(gòu)筑了一種電化學(xué)DNA傳感器 （圖2）。PAMAM表面含有的大量氨基，它可以通過氨基與吡咯環(huán)的作用共價(jià)修飾在MWCNTs上，同時(shí)引入大量的功能基團(tuán)來共價(jià)連接電化學(xué)活性物質(zhì)二茂鐵（Fc），并進(jìn)一步共價(jià)連接捕獲DNA，用于識(shí)別目標(biāo)DNA。形成的DNA雙鏈會(huì)阻礙電子傳遞，導(dǎo)致Fc的信號(hào)減弱，通過信號(hào)減弱的程度實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的定量檢測(cè)。

石墨烯是一類具有獨(dú)特性質(zhì)的新型碳納米材料。在過去的數(shù)十年里，石墨烯及其相關(guān)材料也被廣泛作為電極材料。Liu等［7］在玻碳電極表面修飾上一層石墨稀-聚苯胺（GR-PANI）復(fù)合物作為電極基底材料。石墨烯可以吸附大量的聚苯胺，而聚苯胺含有大量的氨基基團(tuán)，這種電極材料不僅表面積大，導(dǎo)電性好，還可以利用戊二醛作為交聯(lián)劑，共價(jià)固定上大量含氨基的多巴胺適體，用于識(shí)別目標(biāo)物多巴胺（圖3）。

圖3　以石墨稀-聚苯胺為電極基底材料實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的原理圖［7］Fig.3　Schematic representation of the graphemepolyaniline as electrode substrate material for signal amplification［7］

第二，作為酶、寡核苷酸及電化學(xué)活性物質(zhì)等的優(yōu)良載體。納米材料的表面效應(yīng)和小尺寸效應(yīng)使其具有活性比表面積大、表面自由能高的特點(diǎn)。因此，納米材料與其它分子結(jié)合時(shí)表現(xiàn)出很高的化學(xué)活性，能夠有效提高生物分子的固載量。同時(shí)，納米材料具有較好的生物相容性，能為生物分子提供良好的微環(huán)境，對(duì)保持生物分子的活性起到了積極的作用。Yuan等［8］以聚酰胺（PAMMA）修飾的石墨烯為納米載體，用于固載電化學(xué)活性物質(zhì)硫堇（TH）及凝血酶第二適體，加入hemin與適體形成hemin/G-quadruplex結(jié)構(gòu)形成第二適體復(fù)合物。利用夾心結(jié)構(gòu)將第二適體復(fù)合物固載于電極表面，在檢測(cè)底液中加入NADH，由于Hemin/G-quadruplex對(duì)NADH和H2O2的催化作用，使電流響應(yīng)信號(hào)大大增強(qiáng)，從而成功制備了仿雙酶的適體傳感器 （圖4）。Hu等［9］等以碳納米管和C60形成的納米復(fù)合物為載體，固載光電活性材料剛果紅及抗體，并以此構(gòu)建了夾心型的光電化學(xué)免疫傳感器用于CEA的檢測(cè)。Qiu等［10］以納米金為載體，利用酶的剪切作用構(gòu)建了協(xié)同放大的電化學(xué)DNA傳感器。

圖4　以功能化的石墨烯為載體實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的原理圖［8］Fig.4　Schematic representation of the functionalized grapheme as nanocarrier for signal amplification［8］

第三，自身直接作為電化學(xué)活性物質(zhì)，提供放大的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)。某些納米材料本身含有可以被電化學(xué)氧化或還原的元素，其自身就能夠作為電化學(xué)活性物質(zhì)來提供放大的電化學(xué)信號(hào)，較為典型的代表是量子點(diǎn)及銀納米顆粒。

溶出伏安法（ASV）是一種非常有效地痕量檢測(cè)金屬離子的電分析檢測(cè)技術(shù)，常被用于電化學(xué)生物傳感器中。因?yàn)榫哂心軌虮谎趸慕饘俳M分，量子點(diǎn)可產(chǎn)生尖銳且易分辨的溶出伏安信號(hào)，所以量子點(diǎn)常在生物傳感器中被用作為信號(hào)標(biāo)記物，提供靈敏的響應(yīng)信號(hào)。Zheng等［11］報(bào)道了一種以CdSe0.5Te0.5量子點(diǎn)作為信號(hào)標(biāo)記物，用于檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）的電化學(xué)多肽傳感器。如圖5所示，將量子點(diǎn)標(biāo)記的DNA組裝到金納米顆粒表面，然后通過化學(xué)交聯(lián)作用將親和素結(jié)合到量子點(diǎn)表面，形成納米探針。然后，在沉積了納米金的電極表面組裝上生物素標(biāo)記的能夠被MMP-2識(shí)別剪切的多肽鏈，目標(biāo)物存在時(shí)，會(huì)剪切掉部分多肽鏈，剩余在電極表面的多肽鏈通過生物素與親和素的特殊識(shí)別作用，將組裝好的信號(hào)探針結(jié)合到電極表面，通過陽極溶出伏安法對(duì)標(biāo)記的量子點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)物的高靈敏檢測(cè)。

圖5　基于量子點(diǎn)的直接電化學(xué)活性實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的原理圖［11］Fig.5　Schematic representation of the quantum dot as redox mediators for signal amplification［11］

相比于量子點(diǎn)，銀納米顆粒（AgNPs）具有更好的電化學(xué)性能，因此，AgNPs成為更常用的納米標(biāo)記物［12］。帶正電的Ag+不需要復(fù)雜的標(biāo)記過程就可直接吸附在帶負(fù)電的DNA雙鏈上。基于這樣的機(jī)理，Wu等［13］報(bào)道了一種利用帶負(fù)電的DNA吸附帶正電的 Ag+，然后通過硼氫化鈉（NaBH4）還原Ag+生成AgNPs作為電化學(xué)活性納米標(biāo)記物的電化學(xué)生物傳感器用于檢測(cè)端粒酶的活性（圖6）。該工作中，AgNPs通過特有的固相Ag/AgCl反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，這個(gè)過程無需額外的氧化溶解步驟，得到的信號(hào)相較于溶出伏安法更尖銳、強(qiáng)度更大。

圖6　基于銀納米粒子的直接電化學(xué)活性實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的原理圖［13］Fig.6　Schematic representation of the AgNPs as redox mediators for signal amplification［13］

第四，作為催化劑催化水解底物放大響應(yīng)信號(hào)。貴金屬如Pt［14］、Pd［15］、Au［16］、Ag［17］等構(gòu)成的納米材料都具有非常好的催化性能，在電化學(xué)生物傳感器領(lǐng)域被廣泛用做于納米催化劑。由于納米催化劑表面有很多的活性位點(diǎn)，且受環(huán)境干擾較小，催化活性穩(wěn)定，具有很強(qiáng)的信號(hào)放大能力。Zheng等［18］報(bào)道了Fe3O4和Ag-Pd合金納米籠復(fù)合而成的Fe3O4@Ag-Pd納米復(fù)合材料（圖7）。利用Fe3O4對(duì)電化學(xué)活性物質(zhì)小分子染料的催化作用及Ag-Pd合金納米籠對(duì)H2O2的催化分解作用，構(gòu)建了無酶型電化學(xué)細(xì)胞傳感器。Fe3O4@Ag-Pd對(duì)H2O2的催化活性優(yōu)于HRP生物蛋白酶，通過此納米復(fù)合材料的雙重催化作用有效的放大了電流信號(hào)。

圖7　基于納米材料的催化作用實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的原理圖［18］Fig.7　Schematic representation of the Fe3O4@Ag-Pd as catalyst for signal amplification［18］

綜上所述，納米材料通過多種途徑實(shí)現(xiàn)了電化學(xué)生物傳感器的信號(hào)放大，復(fù)合型的納米材料更是具有多種功能協(xié)同放大信號(hào)的作用。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米材料在生物傳感中也必將會(huì)有更廣闊的應(yīng)用。

2.2酶催化放大技術(shù)

酶催化放大技術(shù)是電化學(xué)信號(hào)放大技術(shù)中運(yùn)用較成熟的技術(shù)之一。酶具有極高的催化效率和高度的底物專一性，通過催化底物發(fā)生氧化還原反應(yīng)所產(chǎn)生的電子傳遞來增強(qiáng)電化學(xué)信號(hào)，能夠顯著提高電化學(xué)生物傳感器的靈敏度。常用的酶有葡萄糖氧化酶 （GOD）、辣根過氧化物酶（HRP）、堿性憐酸酯酶（ALP）等。酶催化法一般要與納米材料放大技術(shù)聯(lián)用，通過納米材料的大的比表面積實(shí)現(xiàn)酶的高效固載，利用納米材料的催化性能進(jìn)一步提高酶對(duì)底物的轉(zhuǎn)化效率，借助納米材料優(yōu)良的導(dǎo)電性促進(jìn)生物體系的電子傳輸速率，從而優(yōu)化傳感器的性能。根據(jù)酶催化作用的結(jié)果不同，可將酶催化放大途徑分為以下三種：酶催化底物水解法、酶催化產(chǎn)物沉積法和酶催化底物循環(huán)法。

酶催化底物水解法通過酶催化底物發(fā)生氧化還原反應(yīng)所產(chǎn)生的電子傳遞來增強(qiáng)電化學(xué)信號(hào)。Du等［19］用HRP酶修飾的氧化石墨烯作為第二抗體的標(biāo)記物，通過夾心免疫模式固載于電極表面后，HRP催化底液中的H2O2分解，促進(jìn)電化學(xué)活性物質(zhì)硫堇的氧化還原，從而放大信號(hào)（圖8）。Zhao等［20］用二抗復(fù)合物標(biāo)記上ALP酶，催化底液中的抗壞血酸酯原位產(chǎn)生抗壞血酸放大信號(hào)的原理，構(gòu)建了高靈敏的光致電化學(xué)免疫傳感器。

圖8　基于酶催化水解底物實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的原理圖［19］Fig.8　Schematic representation of the enzyme catalyzed substrate hydrolysis for signal amplification［19］

此外，酶的級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)在電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建過程中也被經(jīng)常采用。酶的級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)是指在兩種以上的酶存在的條件下，一種酶催化生成的產(chǎn)物恰好是另一種酶催化反應(yīng)所需要的底物，通過級(jí)聯(lián)催化可極大的放大響應(yīng)信號(hào)［21］。Park等［22］對(duì)單酶和雙酶對(duì)信號(hào)放大的能力做了對(duì)比研究（圖9）。當(dāng)信標(biāo)抗體上僅標(biāo)記上絡(luò)氨酸酶（Tyr）時(shí)，對(duì)底物的催化只能實(shí)現(xiàn)單重的信號(hào)放大作用。當(dāng)在信標(biāo)抗體上標(biāo)記β-半乳糖苷酶（Gal），并在檢測(cè)底液中加入Tyr時(shí)，Gal首先將檢測(cè)底液中的β-D-吡喃半乳糖苷轉(zhuǎn)化為苯酚，生成的苯酚又被Tyr催化生成鄰苯二酚，鄰苯二酚再次被Tyr催化生成鄰苯醌，產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)響應(yīng)。這樣就通過雙酶催化實(shí)現(xiàn)了信號(hào)的多重放大，大大提高了傳感器的靈敏度。Jeong等［23］利用葡萄糖氧化酶 （GOD）和辣根過氧化物酶（HRP）的級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)構(gòu)建了電化學(xué)蛋白質(zhì)傳感分析平臺(tái)。GOD催化底液中的葡糖糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸的同時(shí)產(chǎn)生H2O2，而產(chǎn)生的H2O2又恰好是HRP催化的底物，HRP催化H2O2分解用以放大電極表面的電化學(xué)活性物質(zhì)的信號(hào)。

酶催化產(chǎn)物沉積法是指酶催化底物形成不溶于水的產(chǎn)物附著于電極表面，從而引起傳感界面產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)的改變，通過伏安法和阻抗法等技術(shù)檢測(cè)響應(yīng)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物定量分析的方法。Li等［24］利用多壁碳納米管固載HRP酶作為第二適體標(biāo)記物，第一適體固定在電極表面，通過夾心法捕獲凝血酶并將第二適體復(fù)合物固載于電極表面，固載的HRP在H2O2存在條件下催化底物3，3-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽（DAB），生成難溶性沉淀附著于電極表面，阻礙電子傳輸，產(chǎn)生較大的阻抗值，實(shí)現(xiàn)對(duì)凝血酶的高靈敏分析（圖10）。

圖9　對(duì)比單酶和雙酶信號(hào)放大能力的原理圖［22］Fig.9　Schematic representation of the comparation of one-enzyme and two-enzyme for signal amplification［22］

圖10　基于酶催化底物沉積實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的原理圖［24］Fig.10　Schematic representation of the enzyme catalyzedsubstrate deposition for signal amplification［24］

Lai等［25］采用了金納米粒子及酶共同催化促進(jìn)銀納米粒子在電極表面的沉積，構(gòu)建了一種高靈敏的多通道免疫分析方法。以金納米粒子為載體固載ALP酶，并標(biāo)記抗體作為二抗復(fù)合物。通過夾心免疫反應(yīng)將其固載于電極表面，ALP酶催化3-吲哚磷酸鹽的水解，產(chǎn)生的中間產(chǎn)物吲哚還原銀離子，同時(shí)金納米粒子也能促進(jìn)銀離子的還原。在酶和金納米粒子的雙重作用下，在電極表面沉積大量的納米銀，通過溶出伏安法實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白質(zhì)的高靈敏檢測(cè)。

酶催化底物循環(huán)法是指在酶的催化輔助作用下，檢測(cè)底液中的多種物質(zhì)能夠讓產(chǎn)生電化學(xué)響應(yīng)的物質(zhì)不斷發(fā)生氧化還原的循環(huán)，從而明顯放大響應(yīng)信號(hào)。Bauer等［26］報(bào)道了一種利用酶催化底物循環(huán)信號(hào)增強(qiáng)體系檢測(cè)堿性磷酸酯酶ATP的電化學(xué)生物傳感器。在堿性磷酸酯，酶酪氨酸酶和葡萄糖脫氫酶的共同作用下實(shí)現(xiàn)了對(duì)生成的電化學(xué)活性物質(zhì)鄰苯醌的循環(huán)氧化還原。這種方法使得檢測(cè)方法靈敏度大大提高，相比其他方法信號(hào)放大了350倍，檢測(cè)限達(dá)3.2 fmol/L。

Xiang等［27］通過ALP和輔酶對(duì)底物的催化產(chǎn)生氧化還原循環(huán)的電流信號(hào)。如圖11所示，固載了大量ALP酶的碳納米管作為第二適體的標(biāo)記物，通過與電極表面的第一適體以及凝血酶，通過夾心法將第二適體復(fù)合物固載于電極表面。引入的ALP可催化底物4-氨基苯磷酸納 （p-APP）生成對(duì)氨基苯酚（p-AP），p-AP在電極表面經(jīng)電化學(xué)氧化生成具有電化學(xué)活性的醌（p-QI），底液中含有的輔酶DI和共存底物NADH又可將p-QI還原成p-AP，如此就形成了一個(gè)循環(huán)體系，放大p-QI的電化學(xué)信號(hào)。

圖11　基于酶催化底物循環(huán)實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的原理圖［27］Fig.11　Schematic representation of the enzyme catalyzed substrate recycling for signal amplification［27］

天然蛋白酶由于成本高、易失活、來源有限等不足，其應(yīng)用在一定程度上受到了限制。近年來，研究者們?cè)谌斯つM酶領(lǐng)域取得了一系列成果，合成了不同類型的模擬酶，且隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，基于納米材料的模擬酶也迅速崛起，在生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。與天然酶相比較，人工模擬酶具有制備過程易控制，結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)較靈活，催化活性可調(diào)節(jié)，成本低，催化活性穩(wěn)定，環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

圖12　基于hemin/G-quadruplex的仿三酶級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的原理圖［30］Fig.12　Schematic representation of the hemin/G-quadruplex DNAzyme nanowires for pseudo triple-enzyme cascade electrocatalytic amplification［30］

G-四鏈體-卟啉鐵 （hemin/G-quadruplex）辣根過氧化物模擬酶，是近些年迅速發(fā)展起來的新興DNA模擬酶，它能催化很多過氧化氫參與的反應(yīng)，極大地提高反應(yīng)速率和反應(yīng)程度。Pelossof等［28］報(bào)道了hemin/G-quadruplex的HRP模擬酶的作用。Golub等［29］報(bào)道了hemin/G-quadruplex 的NADH氧化模擬酶的作用。近年來，研究者們基于hemin/G-quadruplex這兩個(gè)模擬酶的性質(zhì)構(gòu)建了許多性能優(yōu)異的生物傳感器。

Yuan等［30］在電極表面修飾了乙醇脫氫酶（ADH），并且通過夾心反應(yīng)模式將利用雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （HCR）組裝出的含有大量 hemin/G-quadruplex催化單元和嵌入了大量的電化學(xué)活性物質(zhì)MB的DNA雙鏈組裝到電極表面。在檢測(cè)底液中含有乙醇和NAD+時(shí)，電極表面的ADH首先將乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸同時(shí)將 NAD+轉(zhuǎn)化為NADH。此時(shí)，hemin/G-quadruplex作為NADH氧化酶在溶解氧存在的條件下，將NADH氧化同時(shí)產(chǎn)生H2O2。產(chǎn)生的H2O2又被充當(dāng)HRP模擬酶的hemin/G-quadruplex催化分解，從而放大MB在電極表面的氧化還原電流信號(hào)（圖12）。這個(gè)仿三酶級(jí)聯(lián)催化放大策略，避免了多酶的標(biāo)記過程，又達(dá)到了三酶級(jí)聯(lián)催化對(duì)信號(hào)的放大效果，大大的提高了傳感器的靈敏度，對(duì)凝血酶的檢測(cè)限達(dá)到了0.6 pmol/L。

許多新型納米材料也被證實(shí)具有模擬酶的作用，除了常見的基于具有催化功能的貴金屬納米材料的模擬酶外，最近研究非?；馃?、發(fā)展非常迅速的金屬有機(jī)框架材料（MOFs）也表現(xiàn)出優(yōu)良的模擬酶的功能。Ling等［31］通過一鍋法包裹鐵卟啉（FeTCPP）于HKUST-1（Cu）的MOF原型材料中，合成了FeTCPP@MOF材料，修飾親和素（SA）之后作為信號(hào)探針（FeTCPP@MOF-SA）。所得的FeTCPP@MOF材料能夠在H2O2存在條件下仿生催化氧化鄰苯二胺（O-PD）生成具有電化學(xué)活性的2，2′-氨基偶氮苯作為化學(xué)信號(hào)指示劑。在電極表面修飾發(fā)卡DNA，在目標(biāo)DNA存在時(shí)，目標(biāo)DNA與發(fā)卡DNA互補(bǔ)雜交，引發(fā)發(fā)夾DNA的構(gòu)型變化，產(chǎn)生了對(duì)SA有特異性識(shí)別作用的適體。由此，產(chǎn)生的SA適體可將FeTCPP@MOF-SA信號(hào)探針捕獲于電極表面，催化底物產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)指示目標(biāo)物濃度（圖13）。Cui等［32］也提出了一種使用鐵-卟啉MOF材料作為催化劑的電化學(xué)傳感器用于Pb2+的測(cè)定。

圖13　基于金屬有機(jī)框架材料的催化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的原理圖［31］Fig.13　Schematic representation of the FeTCPP@MOF for electrocatalytic amplification［31］

2.3目標(biāo)物循環(huán)放大技術(shù)

目標(biāo)物循環(huán)一般是通過酶的剪切或聚合作用及DNA鏈的置換作用，將被分子識(shí)別元件捕獲的目標(biāo)物釋放出來，進(jìn)而參與下一輪的捕獲和釋放的循環(huán)過程，使得單個(gè)目標(biāo)分子被多次循環(huán)利用，達(dá)到N倍信號(hào)放大的效果。根據(jù)作用效果可將目標(biāo)物循環(huán)的方法分成：酶剪切型，酶聚合型，DNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)催化自組裝型的三類目標(biāo)物循環(huán)的方法。

用于目標(biāo)物循環(huán)的剪切酶又分為限制性內(nèi)切酶和核酸外切酶兩類。限制性內(nèi)切酶可識(shí)別特異的堿基序列并在識(shí)別位點(diǎn)或其附近序列進(jìn)行切割，一般作用于雙鏈DNA的中間部分，剪切雙鏈中的其中一條鏈或兩條DNA均剪切。Yuan等［33］利用限制性內(nèi)切酶的剪切作用實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物循環(huán)構(gòu)建了多功能的DNA檢測(cè)平臺(tái)（圖14）。首先在電極表面修飾殼聚糖分散的金-鈀納米合金，再次修飾一層金-鈀納米合金后作為電極基底材料用于固載probe DNA，加入helper DNA1 與probe DNA互補(bǔ)雜交，在target DNA1存在時(shí)，target DNA1與helper DNA1完全互補(bǔ)雜交釋放到溶液中，被核酸內(nèi)切酶N.BstNB I識(shí)別剪切，釋放出的目標(biāo)物參與下一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)置換反應(yīng)。經(jīng)過多次循環(huán)，電極表面只剩下信號(hào)探針，加入hemin后形成hemin/G-quadruplex。hemin/G-quadruplex同時(shí)作為NADH氧化酶和HRP模擬酶，用以放大電化學(xué)活性物質(zhì)的響應(yīng)信號(hào)。Target DNA2的檢測(cè)過程同上Target DNA1相同。

圖14　基于限制性內(nèi)切酶實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物循環(huán)的信號(hào)放大原理圖［33］Fig.14　Schematic representation of the target recycling for signal amplification based on restriction endonuclease［33］

核酸外切酶是指能夠從DNA鏈的末端順次水解磷酸二酯鍵而生成單核苷酸的酶，水解底物可以是雙鏈DNA也可以是單鏈DNA。該類酶不需要特異的堿基識(shí)別序列，故采用此類酶構(gòu)建目標(biāo)物循環(huán)檢測(cè)方案將具有較強(qiáng)的靈活性。Xiong等［34］設(shè)計(jì)了在環(huán)部和莖部分別標(biāo)記Fc和MB的發(fā)夾型DNA并將其組裝于金電極表面。目標(biāo)物存在時(shí)，與發(fā)夾DNA從標(biāo)記了MB的自由末端互補(bǔ)至標(biāo)記了Fc的環(huán)部，從而打開其發(fā)夾結(jié)構(gòu)。核酸外切酶III識(shí)別此互補(bǔ)序列，并從被打開的發(fā)夾DNA的3′-OH末端將參與互補(bǔ)的DNA序列水解掉，釋放出目標(biāo)物，啟動(dòng)下一輪雜交、剪切的過程。此過程中標(biāo)記的MB脫離電極表面，同時(shí)電極表面含有Fc的未被剪切掉的部分，通過自身的雜交互補(bǔ)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使Fc靠近電極表面。通過MB信號(hào)的減弱及Fc信號(hào)的增強(qiáng)，構(gòu)建了比例型的電化學(xué)DNA傳感器（圖15）。

圖15　基于核酸外切酶實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物循環(huán)的信號(hào)放大原理示意圖［34］Fig.15 Schematic representation of the target recycling for signal amplification based on exonuclease［34］

圖16　基于聚合酶的循環(huán)鏈置換反應(yīng)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物循環(huán)的信號(hào)放大原理圖［35］Fig.16　Schematic representation of the target recycling for signal amplification based on CSRP［35］

另外一種實(shí)現(xiàn)目標(biāo)循環(huán)的方法是基于聚合酶的循環(huán)鏈置換反應(yīng)（circular strand-replacement polymerization，CSRP）。通常情況下，此類反應(yīng)需要設(shè)計(jì)一條發(fā)夾型的DNA探針，目標(biāo)分子能夠打開其發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使其裸露出一段粘性末端進(jìn)一步結(jié)合一段短的DNA引物，在dNTPs和聚合酶作用下以DNA探針為模板引發(fā)聚合酶反應(yīng)，DNA引物沿著DNA探針聚合延伸的過程中，將目標(biāo)分子從DNA探針上擠脫下來，重新誘導(dǎo)參與下一輪的聚合反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的循環(huán)放大。

Gao等［35］利用聚合酶對(duì)DNA鏈的聚合延伸反應(yīng)誘導(dǎo)的目標(biāo)物循環(huán)和納米金催化銀沉積的方法構(gòu)建了電化學(xué)DNA傳感器。如圖16所示，將發(fā)夾型DNA探針固載于殼聚糖修飾的電極表面。目標(biāo)DNA存在時(shí)，目標(biāo)DNA與電極表面的DNA探針部分互補(bǔ)，打開其發(fā)夾結(jié)構(gòu)并裸露其粘性末端，裸露出的粘性末端進(jìn)一步與納米金標(biāo)記的引物DNA互補(bǔ)結(jié)合。在聚合酶和dNTPs存在的條件下，以DNA探針為模板，引物DNA發(fā)生聚合反應(yīng)，將目標(biāo)DNA釋放出來打開更多的發(fā)夾型DNA探針，在電極表面引入更多的納米金，誘導(dǎo)更多的聚合酶反應(yīng)。引入電極表面的納米金通過促進(jìn)銀沉積，產(chǎn)生電信號(hào)響應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的高靈敏檢測(cè)。Ren等［36］也利用CSRP構(gòu)建了癌細(xì)胞檢測(cè)的適體傳感器，并得到了良好的檢測(cè)結(jié)果。

DNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)催化自組裝（catalyzed hairpin assembly，CHA）是第三種實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物循環(huán)的方法。這種方法中需要設(shè)計(jì)兩條發(fā)夾型的DNA探針H1和H2，當(dāng)目標(biāo)物DNA不存在時(shí)，發(fā)夾DNA形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。當(dāng)目標(biāo)物存在時(shí)，目標(biāo)DNA打開H1的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，被打開的H1又會(huì)進(jìn)一步打開H2的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在此過程中，由于H1與H2的互補(bǔ)堿基數(shù)目大于目標(biāo)DNA與H1的互補(bǔ)堿基數(shù)，因此目標(biāo)DNA會(huì)被置換下來并引發(fā)下一輪的鏈置換反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大。此反應(yīng)中全程沒有酶的參與，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作過程，降低了傳感器構(gòu)建成本，具有很好的應(yīng)用前景。

Liu等［37］聯(lián)合DNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)催化自組裝（CHA）和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）兩種信號(hào)放大手段構(gòu)建了一種無酶超靈敏的核酸分析方法 （圖17）。在金電極表面固載巰基修飾的發(fā)夾型Immobilized DNA，Target DNA存在時(shí)，Target DNA與Immobilized DNA部分互補(bǔ)打開其發(fā)夾結(jié)構(gòu)，被打開的Immobilized DNA進(jìn)一步打開發(fā)夾型的Capture DNA，通過鏈置換反應(yīng)將目標(biāo)物釋放出來引發(fā)下一輪的鏈置換反應(yīng)。電極表面的捕獲探針裸露的粘性末端作為引物，可以引發(fā)MB標(biāo)記的Signal探針和Auxiliary探針之間的HCR反應(yīng)，將大量的電化學(xué)活性物質(zhì)MB引入電極表面，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的超靈敏檢測(cè)。

圖17　基于DNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)催化自組裝實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物循環(huán)的信號(hào)放大原理圖［37］Fig.17　Schematic representation of the target recycling for signal amplification based on CHA［37］

圖18　基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)放大的電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)原理圖［39］Fig.18　Schematic representation of the electrochemical immunesensor based on HCR for signal amplification［39］

2.4DNA自組裝放大技術(shù)

DNA分子由于具有獨(dú)特的理化性質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于各種DNA納米材料的構(gòu)建過程，它為納米器件的制作提供了一種新技術(shù)、新方法，目前已成為分子生物學(xué)和納米科學(xué)中最為活躍的研究領(lǐng)域。DNA納米技術(shù)是一種嚴(yán)格遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則的自下而上的分子自組裝技術(shù)，通過合理地設(shè)計(jì)堿基序列來達(dá)到精密控制納米結(jié)構(gòu)的目的，研究人員在這個(gè)領(lǐng)域已經(jīng)建立起諸多二維、三維的復(fù)雜納米結(jié)構(gòu)并將其作為信號(hào)放大手段運(yùn)用于生物傳感器中。

Dirks等［38］提出的雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）能夠在等溫?zé)o酶的條件下，以鏈置換為驅(qū)動(dòng)力，由一段引物DNA引發(fā)兩條發(fā)夾型DNA單體交互組裝，形成一段長(zhǎng)的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)。此反應(yīng)無酶參加卻能實(shí)現(xiàn)DNA的快速組裝擴(kuò)增，且條件溫和、操作簡(jiǎn)單，擴(kuò)增的產(chǎn)物又能結(jié)合多種信號(hào)放大設(shè)計(jì)，是當(dāng)前非常熱門的DNA組裝技術(shù)。Zhang等［39］利用該技術(shù)構(gòu)建了超靈敏檢測(cè)目標(biāo)抗原IgG電化學(xué)免疫傳感器（圖18）。首先，將一抗通過交聯(lián)作用修飾于磁性微球表面，二抗和HCR的引發(fā)鏈S1修飾于納米金表面。接著，通過夾心免疫反應(yīng)將一抗復(fù)合物-目標(biāo)物IgG-二抗復(fù)合物結(jié)合到一起。然后該復(fù)合物進(jìn)一步與電活性物質(zhì)Fc標(biāo)記的發(fā)夾型DNA單體H1*和H2*作用，引發(fā)HCR反應(yīng)形成含有大量Fc的聚合雙鏈結(jié)構(gòu)，得到明顯增強(qiáng)的電化學(xué)信號(hào)用以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的超靈敏檢測(cè)。Chen等［40］基于核酸穩(wěn)定的銀納米團(tuán)簇（DNA/AgNCs）的模擬酶催化性能和HCR反應(yīng)，構(gòu)建了一個(gè)免標(biāo)記型的電化學(xué)適體傳感器用于溶菌酶的靈敏檢測(cè)。溶菌酶適體及其互補(bǔ)鏈形成的DNA雙鏈?zhǔn)紫裙梯d于電極表面，目標(biāo)物存在時(shí)，適體與目標(biāo)物結(jié)合從而脫離電極表面。此時(shí)留在電極表面的互補(bǔ)鏈作為引發(fā)鏈，誘導(dǎo)兩條發(fā)夾型DNA發(fā)生HCR反應(yīng)，形成含有大量含環(huán)狀富C序列的雙鏈DNA，并以此為DNA模板原位生成具有H2O2模擬酶作用銀納米簇，用于催化H2O2分解。

Ge等［41］將三維DNA四面體納米結(jié)構(gòu)結(jié)合二維的HCR的信號(hào)放大作用，構(gòu)建了miRNA的超靈敏檢測(cè)平臺(tái)（圖19）。以電極表面組裝的三維DNA四面體納米結(jié)構(gòu)為捕獲探針的支架，使目標(biāo)物更易被捕獲而增加反應(yīng)性。目標(biāo)物捕獲于電極表面后作為引物引發(fā)生物素標(biāo)記發(fā)夾DNA H1 和H2之間的HCR反應(yīng)，從而可以通過生物素-親和素的作用將大量的HRP標(biāo)記到雙鏈上，利用該酶催化底物3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）的氧化還原，從而得到放大的電化學(xué)信號(hào)。該方案中三維DNA四面體納米結(jié)構(gòu)和HCR協(xié)同效應(yīng)大大提高了miRNA的檢測(cè)靈敏度。

圖19　基于DNA納米結(jié)構(gòu)和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)放大的電化學(xué)DNA傳感器檢測(cè)原理圖［41］Fig.19　Schematic representation of the electrochemical DNA sensor based on etrahedral DNA nanostructure and HCR for signal amplification［41］

圖20　基于動(dòng)力學(xué)控制DNA/肽核酸（PNA）組裝形成樹枝狀DNA的納米結(jié)構(gòu)放大的電化學(xué)DNA傳感器檢測(cè)原理圖［42］Fig.20　Schematic representation of the electrochemical DNA sensor based on kinetically controlled dendritic DNA/ PNA Assembly for signal amplification［42］

Xuan等［42］采用動(dòng)力學(xué)控制 DNA/肽核酸（PNA）組裝形成樹枝狀DNA的納米結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)了一種無酶免固載的電化學(xué)核酸傳感分析平臺(tái)。如圖20所示，在沒有目標(biāo)物時(shí)，F(xiàn)c標(biāo)記的PNA探針和四條特殊設(shè)計(jì)的DNA序列（SP，PC，A1和A2）能夠各自穩(wěn)定存在，自由活動(dòng)的PNA探針能夠靠近帶負(fù)電荷的電極表面，產(chǎn)生一個(gè)較強(qiáng)的信號(hào)響應(yīng)。在目標(biāo)序列存在時(shí)，F(xiàn)c標(biāo)記的PNA探針和四條DNA鏈經(jīng)過一連串的支點(diǎn)-介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)，能夠自發(fā)組裝形成樹枝狀的DNA納米結(jié)構(gòu)。組裝的樹枝狀DNA納米結(jié)構(gòu)帶有負(fù)電荷，與帶負(fù)電的電極表面發(fā)生電荷排斥，使組裝于納米結(jié)構(gòu)中的Fc遠(yuǎn)離電極表面，從而只能產(chǎn)生一個(gè)較弱的信號(hào)響應(yīng)。根據(jù)目標(biāo)物存在前后的信號(hào)變化可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的高靈敏檢測(cè)，檢測(cè)下限達(dá)100 fmol/L。

2.5DNA等溫?cái)U(kuò)增放大技術(shù)

核酸分子體外擴(kuò)增技術(shù)是分子生物學(xué)常用的研究方法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是最廣泛的一種核酸擴(kuò)增技術(shù)，它通過重復(fù)的熱循環(huán)實(shí)現(xiàn)DNA數(shù)量的指數(shù)型增長(zhǎng)。但此擴(kuò)增技術(shù)需要提供溫度循環(huán)的昂貴設(shè)備及專業(yè)的技術(shù)人員，檢測(cè)成本較高。因此，發(fā)展一些高效的放大方法來替代PCR技術(shù)成為非常重要的課題。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，新的核酸擴(kuò)增技術(shù)不斷涌現(xiàn)，其主要區(qū)別在于擴(kuò)增條件、擴(kuò)增酶的類型及是否有溫度變化循環(huán)三個(gè)方面。其中DNA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，由于在恒溫條件下即可實(shí)現(xiàn)DNA擴(kuò)增，在一定程度上克服了PCR的缺點(diǎn)而獲得廣泛關(guān)注［43］。利用DNA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的高擴(kuò)增能力，結(jié)合電化學(xué)檢測(cè)的高靈敏度并與各種放大策略聯(lián)用的電化學(xué)生物傳感器被廣泛地應(yīng)用于超靈敏檢測(cè)中。

DNA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中最為典型的是滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（rolling circle amplification，RCA）。RCA以有缺口的環(huán)狀單鏈DNA作為模板，以一段部分連接于環(huán)狀DNA缺口處的單鏈DNA作為引物，在恒溫條件下通過連接酶和聚合酶的作用，將引物DNA擴(kuò)增延長(zhǎng)，擴(kuò)增出一段長(zhǎng)的含有大量與模板DNA互補(bǔ)的DNA片段的單鏈DNA。這種技術(shù)由于具有中性的反應(yīng)條件、高的擴(kuò)增效率、好的靈敏度和特異性等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛用于臨床和微生物分子診斷領(lǐng)域。

Ji等［44］將酶剪切目標(biāo)物循環(huán)放大技術(shù)與RCA擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合構(gòu)建了超靈敏的電化學(xué)傳感器用于DNA的檢測(cè)。目標(biāo)DNA和輔助DNA與組裝在電極表面的發(fā)夾DNA的環(huán)部相互雜交形成Y型結(jié)構(gòu)，該Y型結(jié)構(gòu)中包含位于發(fā)夾DNA環(huán)部的Nt.BbvCI酶的剪切位點(diǎn)。在剪切酶的作用下，將發(fā)夾型DNA的環(huán)部剪開，并以序列長(zhǎng)的一部分作為引物，在連接酶、聚合酶、環(huán)狀模板和dNTPs存在的條件下發(fā)生RCA擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生長(zhǎng)的單鏈，繼而與大量修飾互補(bǔ)短DNA鏈的量子點(diǎn)結(jié)合，最后檢測(cè)量子點(diǎn)的溶出峰，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的高靈敏分析。Zhu等［45］采用“抗體-目標(biāo)分析物-適體”的夾心反應(yīng)模型，利用RCA實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，構(gòu)建了電化學(xué)生物傳感器用于前列腺特異抗原（PSA）的檢測(cè)（圖21）?？贵w固載于電極表面用于結(jié)合PSA，PSA進(jìn)一步結(jié)合短鏈DNA和納米金修飾的PSA適體。短鏈DNA作為滾環(huán)復(fù)制的引物，在帶缺口的環(huán)狀DNA模板、DNA聚合酶和連接酶的作用下進(jìn)行恒溫滾環(huán)擴(kuò)增，產(chǎn)生長(zhǎng)長(zhǎng)的帶負(fù)電的DNA單鏈用于吸附帶正電的Cu2+，Cu2+在抗壞血酸的還原作用下，在擴(kuò)增出的DNA鏈上產(chǎn)生Cu納米顆粒，用差示脈沖溶出伏安法檢測(cè)Cu納米顆粒的信號(hào)用于指示目標(biāo)抗原濃度。

圖21　基于滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)放大的電化學(xué)傳感器檢測(cè)原理示意圖［45］Fig.21　Schematic representation of the electrochemical sensor based on RCA for signal amplification［45］

圖22　基于鏈置換反應(yīng)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)放大的電化學(xué)傳感器檢測(cè)原理示意圖［46］Fig.22　Schematic representation of the electrochemiluminescence iosensor based on SDA for signal amplification［46］

另一種常用的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是鏈置換反應(yīng)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) （trand displacement amplification，SDA）。SDA是一種基于酶促的DNA體外等溫?cái)U(kuò)增的方法。首先，目標(biāo)物與模板鏈雜交，在聚合酶的作用下沿著模板鏈聚合形成含有核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的一條DNA鏈。然后，聚合成的DNA鏈在內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)處被內(nèi)切酶識(shí)別切割產(chǎn)生3'-OH端缺口。缺口處的DNA作為引物在聚合酶的作用下沿著3'端到5'端方向聚合，從而置換出之前聚合的DNA鏈。通過循環(huán)上述的 “切割-聚合-置換”反應(yīng)過程，釋放出大量剪切置換下來的單鏈DNA產(chǎn)物，從而實(shí)現(xiàn)DNA的高效擴(kuò)増。Chen等［46］利用SDA擴(kuò)增出的大量單鏈的DNA作為輔助探針，與Fc標(biāo)記的DNA鏈共同和電極表面的捕獲DNA探針作用，相互雜交形成Y型結(jié)構(gòu)。利用Fc對(duì)電極表面的Ru（dcbpy）32+的電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)的淬滅作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)miRNA的定量檢測(cè)（圖22）。Yang等［47］結(jié)合SDA 和HCR的雙重信號(hào)放大能力設(shè)計(jì)了一種電化學(xué)檢測(cè)miRNA的方法。利用目標(biāo)物引發(fā)SDA擴(kuò)增出的大量DNA單鏈，與電極表面的捕獲探針部分互補(bǔ)雜交后作為HCR的引發(fā)鏈，引發(fā)H1和H2在電極表面發(fā)生HCR擴(kuò)增，生成大量含環(huán)狀富C序列的DNA雙鏈，并以此為DNA雙鏈模版吸附Ag+，在環(huán)狀富C序列處原位還原Ag+生成銀納米簇作為電化學(xué)活性物質(zhì)，產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)。這兩種信號(hào)放大方法有效結(jié)合，極大地提高了傳感器的靈敏度，對(duì)目標(biāo)物miRNA-199a的檢測(cè)限達(dá)到了0.64 fmol/L。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是 Notomi等在2000年開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件（60～65℃）下特異、高效、快速地完成DNA的擴(kuò)增，能在1 h內(nèi)擴(kuò)增出109靶序列拷貝，擴(kuò)增產(chǎn)物是一系列方向重復(fù)的靶序列構(gòu)成的頸環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰菜結(jié)構(gòu)的DNA片段的混合物［48］。該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測(cè)范圍等指標(biāo)上能媲美甚至優(yōu)于PCR技術(shù)，但不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、不依賴任何專門的儀器設(shè)備實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)，檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR，已經(jīng)應(yīng)用于寄生蟲、病原菌、病毒、疾病和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)等領(lǐng)域，并且還將廣泛應(yīng)用于臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食源安全等領(lǐng)域，具有更為廣闊的發(fā)展應(yīng)用前景［49-50］。

LAMP技術(shù)雖然是一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，但其在分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用非常廣泛，相對(duì)于現(xiàn)有的其他核酸擴(kuò)增技術(shù)，LAMP具有許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：（1）LAMP技術(shù)可在等溫條件對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行擴(kuò)增，因此不需要對(duì)模板DNA進(jìn)行熱變性，減少了升降溫帶來的影響以及對(duì)昂貴、精密實(shí)驗(yàn)儀器的要求，在恒溫箱或者水浴鍋中即可完成擴(kuò)增反應(yīng)。（2）擴(kuò)增效率高，可在1 h內(nèi)能擴(kuò)增出109靶序列拷貝；（3）用兩條特異的外部引物和兩條特異的內(nèi)部引物，識(shí)別靶序列上6個(gè)不同的區(qū)域，對(duì)靶序列具有高度的選擇性，因此擴(kuò)增具有高度的特異性；（4）陽性擴(kuò)增反應(yīng)中會(huì)產(chǎn)生大量的類似花椰菜結(jié)構(gòu)的DNA產(chǎn)物和白色焦磷酸鎂沉淀，擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方法多樣，可用凝膠電泳檢測(cè)、直接用肉眼檢測(cè)或在反應(yīng)體系中加人染料，根據(jù)顏色的變化進(jìn)行檢測(cè)，還可以利用濁度儀，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物混濁度的不同對(duì)原始核酸分子進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析。近年來，LAMP高效的DNA擴(kuò)增優(yōu)勢(shì)結(jié)合電化學(xué)檢測(cè)的簡(jiǎn)單靈敏的檢測(cè)設(shè)備，提高了LAMP擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)速度，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，為核酸檢測(cè)提供了新的發(fā)展途徑。

Hsieh等［51］通過微流控電化學(xué)定量環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)發(fā)展了在臨床領(lǐng)域的一種快速、靈敏和定量檢測(cè)致病基因DNA的方法。其電化學(xué)檢測(cè)原理如圖23所示，基因DNA、四條引物鏈、鏈置換DNA聚合酶以及相關(guān)反應(yīng)試劑組成LAMP反應(yīng)體系，在反應(yīng)體系中加入電化學(xué)活性物質(zhì)MB。在LAMP反應(yīng)擴(kuò)增前，大量游離的MB能夠自由擴(kuò)散至電極表面，產(chǎn)生一個(gè)較強(qiáng)的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)。在恒溫65℃的條件下，啟動(dòng)LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，在此過程中逐漸產(chǎn)生大量的類似花椰菜結(jié)構(gòu)的DNA，MB嵌入DNA鏈中，能夠自由移動(dòng)的MB減少，從而產(chǎn)生一個(gè)降低的電化學(xué)信號(hào)。由MB信號(hào)的減弱程度來反應(yīng)LAMP擴(kuò)增程度，從而可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的實(shí)時(shí)、定量測(cè)定。Ahmed等［52］采用類似的原理，以能夠與DNA結(jié)合的Ru （NH3）63+為電化學(xué)信號(hào)指示劑，發(fā)展了一種以LAMP擴(kuò)增為基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)檢測(cè)病原體DNA的方法。Nagatani等［53］采用轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法用USB供電的便攜式儀器發(fā)展了半實(shí)時(shí)的電化學(xué)監(jiān)測(cè)流感病毒RNA的方法。

圖23　基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)放大的電化學(xué)傳感器檢測(cè)原理示意圖［51］Fig.23　Schematic representation of the electrochemical sensor based on LAMP for signal amplification［51］

3　展望

近年來，生物傳感器的研究得到了飛速的發(fā)展，在傳感器的設(shè)計(jì)、分析性能以及應(yīng)用范圍等研究方面取得了顯著的進(jìn)展。然而，隨著生命科學(xué)的不斷發(fā)展，對(duì)現(xiàn)有的分析方法提出了更高的要求，進(jìn)一步刺激了電化學(xué)生物傳感器的不斷進(jìn)步，對(duì)其選擇性、靈敏度、響應(yīng)速度及實(shí)用性等方面提出了極大的挑戰(zhàn)。進(jìn)一步尋找新的高特異性高親合力的分子識(shí)別元件，開發(fā)設(shè)計(jì)新的傳感模式，不斷與其它技術(shù)連用，將電化學(xué)生物傳感器向超靈敏化、微型化、功能多樣化、集成化的方向發(fā)展，推廣電化學(xué)生物傳感器在臨床醫(yī)學(xué)診斷和藥物篩選等方面的實(shí)際應(yīng)用，將無疑是電化學(xué)生物傳感器發(fā)展的主要方向。

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Proceedings of the signal amplification strategies in electrochemical biosensors

Xie Shun-bi，Yuan Ruo*
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Southwest University，Chongqing 400715，China）

The fast，simple and sensitive detection of biological molecular in clinical diagnosis，environmental monitoring，food analysis and pathogenic microorganisms research is one of the most attractive research areas in analytical chemistry.Electrochemical biosensor has been vigorously developed and studied for biological molecules detection due to its inherent advantages such as simplicity，low cost，high sensitivity and easy miniaturization. Concerning new methods and new technology in electrochemical biosensors construction，combining novel nanomaterials with excellent performance，introducing effective signal amplification strategies to improve the performance of electrochemical biosensors，has very important significance for a variety of biological molecules specific and sensitive detection.The principle of electrochemical biosensor is presented，and the proceedings of signal amplification strategies in electrochemical biosensors in recent years are extensively reviewed.

electrochemical；biosensor；nanomaterials；signal amplification

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21575116，21275119，51473136）

*通信聯(lián)系人，E-mail:yuanruo@swu.edu.cn