王俊麗，李斌琦，王英條，夏炎春，楊 峂

二甲雙胍與2-脫氧-葡萄糖抑制三陰性乳腺癌細胞株的研究

王俊麗，李斌琦，王英條，夏炎春，楊 峂

目的 探討二甲雙胍和2-脫氧-葡萄糖協(xié)同抑制三陰性乳腺癌干細胞及CD44表達。方法 二甲雙胍和2-脫氧-葡萄糖分別或聯(lián)合與三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231培養(yǎng)，用CCK8檢測活細胞的比例，免疫熒光法聯(lián)合流式細胞儀檢測乳腺癌干細胞的比例和 CD44的表達。結(jié)果 二甲雙胍和 2-脫氧-葡萄糖各自對 MDAMB-231細胞均有抑制作用，對其干細胞無選擇性殺傷作用，對CD44的表達有明顯抑制，呈時間依賴性；二甲雙胍和2-脫氧-葡萄糖聯(lián)合對乳癌干細胞無選擇性殺傷作用，對CD44表達的抑制強于單藥的作用。結(jié)論 二甲雙胍和2-脫氧-葡萄糖單獨或聯(lián)合對三陰性乳腺癌干細胞無選擇性殺傷，但是對CD44表達的有抑制作用。

二甲雙胍；2-脫氧-葡萄糖；CD44；乳腺癌；腫瘤干細胞

三陰性乳腺癌預(yù)后差、生存期短，治療失敗的主要原因是化療耐藥，無法徹底殺滅潛在的微小轉(zhuǎn)移灶。目前認為引起化療耐藥的主要原因是腫瘤組織中的干細胞對化療不敏感。如果有藥物能殺傷乳腺癌干細胞，將有效提高其療效。常見體外對腫瘤干細胞有殺傷作用的藥物包括二甲雙胍、2-脫氧-葡萄糖、喹啉及甲硫達嗪等。上述藥物對多種腫瘤均有殺傷作用，但同時也存在殺傷效率不高、耐藥等問題。二甲雙胍是傳統(tǒng)的降糖藥，2-脫氧-葡萄糖是一種抗病毒藥物，相比常見的化療藥物，上述兩種藥物的毒副反應(yīng)很低。本研究目的就是探討是否可以用二甲雙胍和2-脫氧-葡萄糖聯(lián)合作用，更有效的殺傷腫瘤干細胞。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 乳腺癌細胞株 MDAMB-231購于湘雅醫(yī)學中心細胞庫，二甲雙胍和2-脫氧-葡萄糖購于Sigma公司；CD44-FITC抗體和 CD44-Isotype抗體購于BD公司，CD24-APC抗體和CD24-Isotype抗體購于Ebio公司；FBS購于hyclone，DMEM培養(yǎng)基和L-15培養(yǎng)基購于GIBCO，CCK8試劑盒購于同仁化學。

1.2 方法

1.2.1 活細胞比例檢測 收集對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞，接種96孔板，5×103/孔。分別給予梯度濃度的二甲雙胍和2-脫氧-葡萄糖或聯(lián)合給藥，設(shè)空白組，作用24、48、72h，以CCK8方法檢測。

1.2.2 CCK8檢測 各組細胞換液，輕輕吸棄原培養(yǎng)基，加入100l培養(yǎng)基-C CK8混合液（90 l無血清培養(yǎng)基+10 l CCK8溶液），37℃避光孵育1 h。酶標儀450 nm讀板，記錄OD值，根據(jù)各組與空白對照組的比值，計算活細胞比率。

1.2.3 乳腺癌干細胞比例及其CD44表達強度的檢測 收集對數(shù)生長期的MDAMB-231細胞，接種6孔板，1×105/孔。分別給予梯度濃度的二甲雙胍和2-脫氧-葡萄糖，分別于24、48、72 h。收集各組細胞，PBS洗一次，1.5 ml EP管100l PBS重懸細胞，取4管，分別加入CD44抗體、CD44 Isotype抗體、CD24抗體及CD24 Isotype抗體（單染組和同型對照組），另準備一管細胞，不加入任何抗體（陰性對照組）；各給藥組均同時加入CD44抗體和CD24抗體（雙染組）。4℃避光孵育30 min，PBS洗滌兩遍，500 l PBS重懸細胞，上機FL-1（FITC通道）和FL-4（APC）通道檢測。分別獲得細胞CD44 和CD24的熒光強度。根據(jù)與對照組熒光強度的比值，計算出CD44的相對表達強度。聯(lián)合給藥組二甲雙胍濃度為1mmol/L，2-脫氧-葡萄糖濃度為2mmol/L。

1.3 統(tǒng)計方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析。＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍和 2-脫氧-葡萄糖對MDA-MB-231細胞均有抑制作用，二甲雙胍對乳腺癌細胞株抑制作用呈現(xiàn)時間依賴性，在72 h時出現(xiàn)濃度依賴性。2-脫氧-葡萄糖對乳腺癌細胞株的抑制作用隨著濃度的增加而增加，與作用時間長短無明顯關(guān)系。見表1～2。

表1 二甲雙胍對MDA-MB-231細胞抑制作用

表2 2-脫氧-葡萄糖對MDA-MB-231細胞抑制作用

2.2 二甲雙胍和 2-脫氧-葡萄糖對MDA-MB-231干細胞的抑制作用，并非選擇性性的殺傷CD44＋CD24－的干細胞，兩種藥物沒有降低乳腺癌干細胞的百分比，與對照組差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）。見表3～4。

表3 二甲雙胍對MDA-MB-231干細胞的影響

表4 2-脫氧-葡萄糖對MDA-MB-231干細胞的影響

2.3 二甲雙胍和 2-脫氧-葡萄糖對MDA-MB-231干細胞的CD44表達有明顯的抑制作用(以下CD44表達強度的結(jié)果均針對CD44＋CD24－細胞群的記錄)，作用效果呈時間依賴性，與藥物濃度相關(guān)性較小，72 h各濃度組與對照組差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）。見表5～6。

表5 二甲雙胍對MDA-MB-231干細胞的CD44表達強度的抑制

表6 2-脫氧-葡萄糖對MDA-MB-231干細胞的CD44表達強度的抑制

2.4 二甲雙胍聯(lián)合 2-脫氧-葡萄糖對MDA-MB-231干細胞的抑制不明顯，與對照組差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）；聯(lián)合給藥對CD44表達的抑制強于每個單藥的效果，48、72h時不同濃度和對照差異均有統(tǒng)計學意義（均＜0.05）。見表7～8。

3 討論

尋找非細胞毒性藥物來殺傷腫瘤細胞和影響腫瘤細胞的生物學功能是目前研究的熱點[1]。研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍和2-脫氧-葡萄糖對多種腫瘤細胞有殺傷作用。二甲雙胍主要通過激活A(yù)MP激酶，抑制腫瘤細胞糖酵解所獲得的能量；而2-脫氧-葡萄糖主要作用是耗竭細胞內(nèi)的ATP，從而導致細胞死亡[2-3]。從作用機制上看，筆者提出兩者聯(lián)合使用會有協(xié)同效應(yīng)[4]。

根據(jù)Hirsh等[5]的實驗發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可選擇性的殺傷乳腺癌干細胞，而MDA-MB-231在所有乳腺癌細胞系中含干細胞比例是最高的[6]，因此本文選擇MDA-MB-231株作為實驗對象。本研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍、2-脫氧-葡萄糖單獨或聯(lián)合并不能選擇性的殺傷 MDAMB-231的乳腺癌干細胞；通過流式細胞儀觀察到 CD44和 CD24抗體結(jié)合MDA-MB-231細胞后的熒光強度，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍或2-脫氧-葡萄糖作用細胞后，MDA-MB-231干細胞表面糖蛋白CD44表達的強度明顯下降，而且呈時間依賴性。

表7 聯(lián)合給藥對MDA-MB-231干細胞的影響

表8 聯(lián)合給藥對MDA-MB-231干細胞CD44＋表達強度的影響

查閱文獻發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231細胞株的干細胞比例差別很大，40%～90%[6-7]，本實驗MDA-MB-231細胞株的干細胞比例為99%，而Hirsch等[5]使用的MDAMB-231細胞株的干細胞比例為30%。相應(yīng)的，兩者CD44表達強度可能也會有差異。二甲雙胍和2-脫氧-葡萄糖可能通過直接抑制CD44的表達而影響乳癌干細胞（CD44＋CD24－）的比例。由于本實驗采用的MDA-MB-231細胞株CD44表達過高，藥物雖然抑制了CD44部分表達，但其抑制率不足以達到判斷陽性或陰性的臨界值，所以干細胞的比例未發(fā)生明顯變化。而在某些CD44表達強度較弱的MDA-MB-231細胞株或者其它細胞株如MCF-7（CD44的表達強度約為MDA-MB-231細胞的1/4～1/10）[8]，藥物對CD44的抑制效果足以達到臨界值，表現(xiàn)為干細胞比例降低。本實驗設(shè)計考慮二甲雙胍和2-脫氧-葡萄糖對乳腺癌細胞抑制有較強的協(xié)同作用，而試驗結(jié)果表明兩者的協(xié)同作用不如預(yù)期般顯著[9]。上述兩種藥物實際的作用機制可能與文獻報道有差異，需要進一步研究，比如：以往的研究認為二甲雙胍和2-脫氧-葡萄糖是通過耗竭細胞內(nèi)能量殺傷細胞，CD44可以受NF-B、HIF-1等調(diào)控[10-11]，而本實驗發(fā)現(xiàn)這兩種藥物抑制CD44表達，這些機制之間存在著何種聯(lián)系，通過何種信號途徑實現(xiàn)，均需要進一步實驗探索。

CD44是一類重要的粘附分子，分布于細胞表面，在乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤表面均有表達，與腫瘤分裂增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)。CD44在乳腺癌細胞的表達做為干細胞的重要標志，CD44＋CD24－的細胞群被認為具有自我復(fù)制和克隆形成的功能，對多種化療藥物耐藥，是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因[12]。如果通過各種方法使該細胞亞群失去CD44的表達，其干細胞的特性也會隨之消失[8，13]。因此CD44可能是逆轉(zhuǎn)乳腺癌化療耐藥性的潛在靶點。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.06.040

R737.9

A

1671-0800(2016)06-0772-03

2015-12-26

（本文編輯：陳志翔）

寧波市自然科學基金（2013A610224）

315040寧波，中國人民解放軍第113醫(yī)院（王俊麗、李斌琦、王英條、夏炎春）；寧波市第二醫(yī)院（楊峂）

楊峂，Email：tongyang1@ 163.com