邢謙哲，高英堂，駱瑩，王毅軍，杜智△

肝切除患者血清對體外培養(yǎng)肝細胞增殖能力的影響

邢謙哲1，高英堂2，駱瑩2，王毅軍1，杜智1△

目的 通過體外細胞實驗觀察肝切除患者術前及術后不同時間血清對肝細胞增殖的影響。方法 根據(jù)所采用的血清不同，將培養(yǎng)的HL-7702細胞分為胎牛血清（FBS）組、術前血清組、術后0.5 h、3 h、24 h和72 h血清組，各組細胞在Cell-IQ無標記活細胞影像分析系統(tǒng)中維持培養(yǎng)72 h，通過該系統(tǒng)對細胞進行連續(xù)計數(shù)，繪制出各組細胞擴增曲線，比較各組細胞72 h內(nèi)細胞擴增倍數(shù)，對各組培養(yǎng)72 h后的細胞進行BrdU免疫熒光染色，比較各組BrdU陽性率。結(jié)果 細胞擴增曲線顯示各組細胞均有增殖，除術后72 h血清組外，其余人血清組培養(yǎng)的HL-7702細胞增殖速度均高于FBS組，術后0.5 h和術后3 h血清組更明顯。除術后72 h血清組外，各組人血清組HL-7702細胞擴增倍數(shù)均高于FBS組，術后0.5 h和術后3 h血清組擴增倍數(shù)高于術前血清組（均P＜0.05）。人血清組HL-7702細胞BrdU陽性率均高于FBS組，術后0.5 h和術后3 h血清組細胞BrdU陽性率高于術前血清組（均P＜0.05）。結(jié)論 肝切除術后外周血清較FBS具有更強的促進肝細胞增殖的能力，肝切除術后早期血清促進肝細胞增殖作用更明顯。

肝細胞；細胞增殖；肝切除術；血清

肝功能衰竭是肝病患者死亡的重要原因之一，目前最有效的治療手段是原位肝移植，但由于供肝短缺，肝移植很難廣泛應用于臨床。肝細胞移植及生物型人工肝（bioartificial liver，BAL）作為肝功能衰竭的輔助治療手段，不僅可以為患者尋求合適的供肝來源爭取寶貴的時間，甚至可以幫助患者平安渡過危險期，通過肝再生而自然恢復，這兩種治療手段均需要一定數(shù)量有功能的肝細胞。正常成人肝細胞是這兩種治療方法理想的細胞材料，但是其在體外培養(yǎng)條件下很難增殖，肝細胞功能迅速喪失，這也限制了正常成人肝細胞的臨床應用。肝臟具有很強的再生能力，當手術、創(chuàng)傷等造成肝體積損失后，殘存肝組織可迅速再生恢復至原有體積和質(zhì)量，最終達到肝組織結(jié)構的重建及肝功能恢復［1］。目前肝切除術后肝細胞再生機制的研究已經(jīng)很多，研究認為肝切除術后肝臟再生主要是通過成熟肝細胞的增殖來完成的，其中肝切除術后外周血細胞因子水平的變化在肝細胞增殖過程中也發(fā)揮了重要作用［2］。本課題組前期在采用肝切除患者血清誘導人多能干細胞向肝細胞分化的實驗中觀察到，肝切除術后早期血清具有更強的誘導分化作用［3］。但肝切除術后血清對體外培養(yǎng)肝細胞增殖的影響尚少見相關研究。本研究旨在觀察肝切除術前及術后不同時間血清對成人正常肝細胞系HL-7702細胞增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 RPMI 1640（產(chǎn)品號11875-093）、胎牛血清（FBS，產(chǎn)品號10100139）購自Life Technologies；5-溴-2-脫氧脲苷（BrdU，產(chǎn)品號B5002）購自Sigma公司；小鼠抗人BrdU單克隆抗體（產(chǎn)品號 555627）購自 BD Biosciences；NorthernLightsTMAnti-mouse IgG-NL493（產(chǎn)品號NL009）購自R&D Systems。

1.2 主要儀器 Cell-IQ無標記活細胞影像分析系統(tǒng)（CM Technologies）；-86℃超低溫冰箱（Thermo公司）；水平層流凈工作臺（上海上凈凈化設備有限公司）；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡（Olympus公司）。

1.3 患者血清的采集 選取2012年6月—2013年1月于我院行肝切除的患者6例，其中肝血管瘤3例，局灶性結(jié)節(jié)性增生（FNH）3例，患者一般資料見表1。6例患者均無肝炎、肝硬化基礎，且不合并其他疾病。分別留取患者肝切除術前和肝切除術后0.5、3、24、72 h血清，-86℃凍存?zhèn)溆?。取血及其用途?jīng)患者本人知情同意，實驗方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批同意。

Tab.1 General information of the patients who provided serum表1 提供血清患者一般資料

1.4 HL-7702細胞培養(yǎng)液的配制及細胞培養(yǎng)方法 本實驗常規(guī)采用RPMI 1640培養(yǎng)基添加10%FBS作為HL-7702細胞的培養(yǎng)液。本實驗中不同培養(yǎng)組的HL-7702細胞在RPMI 1640培養(yǎng)基中分別添加10%FBS及肝切除患者術前、術后0.5、3、24和72 h血清。HL-7702細胞復蘇、培養(yǎng)及傳代：37℃水浴預熱培養(yǎng)基；從液氮中取出凍存細胞放入37℃水浴快速解凍后在超凈臺中加入5 mL培養(yǎng)基重懸細胞，1 000 r/min離心5 min；棄上清，加入5 mL培養(yǎng)基重懸細胞后轉(zhuǎn)入T25培養(yǎng)瓶中，輕輕晃勻；置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；當細胞融合度達到90%以上時，將細胞傳代至24孔培養(yǎng)板中；在超凈臺中，棄掉舊培養(yǎng)基，加入2～5 mL PBS清洗細胞后，再加入1 mL胰酶消化細胞；顯微鏡下觀察到細胞變圓，有細胞開始脫離瓶壁時，加入5 mL新培養(yǎng)基終止消化；將細胞移入離心管中，1 000 r/min離心5 min；棄上清，加入新培養(yǎng)基重懸細胞后轉(zhuǎn)入24孔培養(yǎng)板，細胞密度約1×105/孔，混勻細胞懸液，確保細胞均勻分布。

1.5 Cell-IQ無標記活細胞影像分析系統(tǒng)觀察細胞增殖 傳代至24孔板中（約1×105/孔）的細胞貼壁24 h后，PBS洗滌3遍，更換為含10%FBS或肝切除術前、術后不同時間血清的RPMI 1640培養(yǎng)基（1 mL/孔）。每種血清培養(yǎng)4孔細胞，將培養(yǎng)板放入Cell-IQ無標記活細胞影像分析系統(tǒng)中連續(xù)培養(yǎng)72 h，每1 h采集圖像1次。

1.6 BrdU免疫熒光染色 細胞培養(yǎng)終止前，在培養(yǎng)液中加入BrdU（終濃度為10 μmol/L），37℃下繼續(xù)培養(yǎng)60 min。吸棄培養(yǎng)液，PBS洗滌3次后加入95%乙醇1 mL/孔。固定30 min。吸棄后PBS洗滌3次，然后加入新鮮配制的2 mol/L的鹽酸1 mL/孔，37℃孵育20 min。吸棄并PBS洗滌3次，加入0.1%TritonX-100 200 μL/孔，室溫透膜20 min。吸棄并PBS洗滌3次后，1%BSA封閉1 h。然后加入小鼠抗人BrdU單克隆抗體（工作濃度1∶100）200 μL/孔，4℃過夜。吸棄并PBS洗3次，加入NorthernLightsTMAnti-mouse IgG（1∶200稀釋），4℃放置2 h。PBS洗滌3次，加入0.5 μg/L DAPI，染核1 min，PBS洗滌后熒光顯微鏡下觀察。在顯微鏡下隨機讀取5個高倍視野，計數(shù)細胞總數(shù)及BrdU陽性細胞數(shù)，計算BrdU陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)比例。

1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

Fig.1 Proliferation of HL-7702 cell cultured for 72 h in different groups（×40）圖1 HL-7702細胞在不同血清中培養(yǎng)72 h后細胞增殖情況（×40）

2.1 各組HL-7702細胞增殖情況比較 在FBS和人血清培養(yǎng)條件下HL-7702細胞均有增殖，術后72 h血清組HL-7702細胞出現(xiàn)明顯細胞凋亡，見圖1。從72 h細胞數(shù)量擴增趨勢圖可見，除術后72 h血清組外，其余人血清組HL-7702細胞增殖速度均明顯高于FBS組；術后0.5 h和3 h血清組HL-7702細胞增殖速度明顯高于術前血清組，術后24 h血清組肝細胞增殖速度又降至接近術前血清水平，術后72 h血清組HL-7702細胞增殖速度已經(jīng)明顯低于術前血清組，見圖2。除術后72 h血清組外，其余人血清組72 h內(nèi)細胞擴增倍數(shù)均高于FBS組；術后0.5 h和術后3 h血清組高于術前血清組（均P＜0.05），術后24 h血清組與術前血清組差異無統(tǒng)計學意義，術后72 h血清組低于術前血清組（P＜0.05），見表2。

Fig.2 The chart of HL-7702 cell volume expansion trend cultured in different serum groups圖2 不同血清培養(yǎng)HL-7702細胞數(shù)量擴增趨勢圖

2.2 各組HL-7702細胞BrdU增殖實驗結(jié)果 人血清組HL-7702細胞BrdU陽性率均高于FBS組，術后0.5 h和術后3 h血清組細胞BrdU陽性率高于術前血清組（均P＜0.05），術后24 h和術后72 h血清組細胞BrdU陽性率與術前血清組差異無統(tǒng)計學意義，見表2、圖3。

Tab.2 Comparison of amplification and BrdU positive rate of HL-7702 cells cultured in different serum表2 各組HL-7702細胞培養(yǎng)72 h后擴增倍數(shù)和BrdU陽性率的比較 （n=5±s）

Tab.2 Comparison of amplification and BrdU positive rate of HL-7702 cells cultured in different serum表2 各組HL-7702細胞培養(yǎng)72 h后擴增倍數(shù)和BrdU陽性率的比較 （n=5±s）

＊＊P＜0.01；a與FBS組比較，b與術前血清組比較，P＜0.05

擴增倍數(shù)BrdU陽性率（%）組別2.15±0.24 5.52±0.35a6.09±0.48ab6.06±0.46ab5.68±0.23a2.45±0.45b132.796＊＊17.98±2.73 31.09±1.24a44.92±4.09ab38.79±0.22ab32.01±0.45a27.70±0.96a21.615＊＊FBS組術前血清組術后0.5 h血清組術后3 h血清組術后24 h血清組術后72 h血清組F

3 討論

3.1 人血清促HL-7702細胞增殖能力較FBS更強 由于動物源性血清培養(yǎng)人類細胞將來應用于臨床時可能面臨動物源性病原感染及異種免疫排斥等問題，現(xiàn)在已越來越多地采用人血清代替FBS來培養(yǎng)人類細胞。Dahl等［4］研究顯示自體血清培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞在維持表型和基因型穩(wěn)定性方面要優(yōu)于FBS。Fani等［5］研究顯示在誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化的過程中采用人血清比FBS誘導效率更高。Goodarzi等［6］將自體人血清和FBS在雪旺細胞的培養(yǎng)中進行了對比，顯示兩者在維持細胞數(shù)量、純度和活性方面無明顯差別，認為自體人血清在雪旺細胞的培養(yǎng)中能夠很好地替代FBS。Mazlyzam等［7］的研究顯示人血清和FBS同時培養(yǎng)人纖維母細胞14 d時，人血清培養(yǎng)的細胞較FBS多擴增近1倍。到目前為止，人血清已經(jīng)應用于包括胚胎干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞、軟骨細胞、皮膚纖維母細胞、結(jié)膜上皮細胞等多種細胞的維持培養(yǎng)中，但尚少見人血清在肝細胞培養(yǎng)中應用的報道。本研究結(jié)果顯示，采用人血清培養(yǎng)（除術后72 h血清組）的HL-7702細胞在培養(yǎng)72 h后，細胞擴增倍數(shù)約為FBS的3倍，且細胞BrdU陽性率明顯高于FBS組，表明人血清培養(yǎng)的細胞DNA復制更活躍，人血清具有更強的促肝細胞增殖的作用，其原因可能是人血清所含的同源性生長因子較FBS所含的異源性生長因子更能發(fā)揮其生理作用，同源性生長因子之間的相互作用更能夠增強細胞內(nèi)的生物化學反應。

3.2 肝切除術后血清促肝細胞增殖作用具有明顯的時效性 結(jié)果顯示，術后0.5和3 h血清組細胞擴增倍數(shù)及BrdU陽性率均高于術前血清組，而術后24 h血清組細胞擴增倍數(shù)和BrdU陽性率與術前血清組無明顯差異，術后72 h血清組細胞擴增倍數(shù)低于術前血清組，BrdU陽性率與術前血清組無明顯差異，提示肝切除術后0.5和3 h血清較術前血清培養(yǎng)的細胞DNA復制更活躍，細胞增殖更快，術后24 h血清的促增殖作用已經(jīng)下降至接近術前血清水平。早期研究證實，肝部分切除術后除了肝組織內(nèi)細胞因子、生長因子水平發(fā)生迅速變化，外周血中肝細胞生長因子（HGF）、去甲腎上腺素、腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-6、膽汁酸、胰島素、瘦素等也會迅速發(fā)生變化，在早期啟動肝組織再生過程中發(fā)揮重要作用［8］。Lindroos等［9］研究顯示，大鼠外周血中HGF在肝切除術后1 h即迅速升至峰值。Matsumoto等［10］通過對人親體肝移植供體肝切除后血清中細胞因子水平變化的觀察發(fā)現(xiàn)，在肝切除術后早期的外周血中HGF、瘦素和巨噬細胞集落刺激因子明顯升高，提示這些細胞因子在該時期肝細胞增殖中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果可能預示著肝切除術后0.5 h外周血中即已經(jīng)出現(xiàn)了促進肝細胞增殖的生長因子。肝切除術后24 h外周血中促進肝細胞增殖的生長因子水平可能已經(jīng)開始下降，或者此時抑制肝細胞增殖的一些因子已經(jīng)出現(xiàn)，而術后72 h外周血中抑制肝細胞增殖的因子進一步增加。轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β是肝再生的強力負性調(diào)控因子，對抑制肝細胞無限制生長發(fā)揮著重要作用。但TGF-β在肝切除術后4 h就開始升高，術后72 h達高峰，并不是在肝細胞增殖接近尾聲時才開始發(fā)揮作用［11］。TGF-β除了能夠抑制肝細胞增殖，還能夠通過Smad和p38/MAPK途徑誘導肝細胞凋亡［12］。這可能也是本研究中雖然術后72 h血清組BrdU陽性率較術前血清組無明顯差別，但擴增倍數(shù)明顯減少的主要原因。

本實驗直觀地展示了肝切除術前及術后不同時間血清對肝細胞增殖能力的影響，也從一定程度上揭示了肝切除術后不同時間肝細胞增殖的情況。但肝切除術后不同時間血清對細胞凋亡的影響以及血清成分的變化仍然需要進一步研究。

（圖3見插頁）

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（2016-05-01收稿 2016-07-04修回）

（本文編輯 陳麗潔）

Effects of serum came from hepatectomized patient on proliferation of cultured hepatocytes

XING Qianzhe1，GAO Yingtang2，LUO Ying2，WANG Yijun1，DU Zhi1△
1 Department of Hepatobiliary Surgery，2 Key Laboratory of Artificial Cell，The Third Central Hospital of Tianjin，Tianjin 300170，China△

Objective To observe the influence of peripheral serum came from patients with hepatectomy at different time points on hepatocyte proliferation in vitro.Methods According to the different types of cultured serum，cultured HL-7702 cells were divided into fetal bovine serum（FBS）group，preoperative serum group，0.5 h，3 h，24 h and 72 h post operative serum groups.All groups of cells were cultured for 72 hours in the Cell-IQ unmarked living cell image analysis system，and the amplification curves of each group were mapped by continuous counting of cells.The cell amplification multiple was compared between all groups after culturing for 72 hours.BrdU immunofluorescence staining was performed and BrdU positive rate was calculated for comparing the cell proliferation of all groups.Results Amplification curves showed that HL-7702 cell proliferation rates of all human serum groups except for 72 h post operative group were higher than those of FBS group.Human serum 0.5 h and 3 h postoperative groups were more obvious.The amplification multiples of human serum groups，except for 72 h post operative group were all significantly higher than those of FBS group（P＜0.01），and 0.5 h and 3 h post operative groups were both significantly higher than those of preoperative group（P＜0.05）.BrdU positive rates of all human serum groups were significantly higher than those of FBS group（P＜0.01），which were significantly higher in 0.5 h and 3 h post operative groups than those of preoperative group（P＜0.05），but there were no statistical differences between 24 h and 72 h post operative groups and the preoperative group.Conclusion Human serum can promote the proliferation of hepatocytes compared with that of FBS.The influence of serum acquired post hepatectomy is closely associated with the post operative time.

hepatocytes；cell proliferation；hepatectomy；serum

R333.4

A

10.11958/20160363

天津市衛(wèi)生局科技基金資助項目（2013KR01）

1天津市第三中心醫(yī)院肝膽外科（郵編300170），2人工細胞重點實驗室

邢謙哲（1975），男，主治醫(yī)師，博士，主要從事干細胞向肝細胞誘導分化方面的研究

△通訊作者 E-mail:zhi-du@163.com