孫慧誌，田德潤△，孟潔，趙楠，韓潔，甘椿椿，王勇

小鼠前脂肪細胞3T3-L1培養(yǎng)與四聯(lián)誘導分化方法的探討

孫慧誌1，田德潤1△，孟潔2，趙楠2，韓潔1，甘椿椿3，王勇2

目的 改進小鼠前脂肪細胞3T3-L1的培養(yǎng)并誘導分化為成熟脂肪細胞的方法。方法 使用含有10%胎牛血清（FBS）的高糖型DMEM液體培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)小鼠前脂肪細胞，2～3 d換液1次。細胞按誘導分化方式的不同分為三聯(lián)誘導組和四聯(lián)誘導組。三聯(lián)誘導組誘導分化培養(yǎng)基Ⅰ成分為常規(guī)培養(yǎng)基基礎上加用人胰島素10 mg/L，1-甲基-3-異丁基黃嘌呤（IBMX）0.5 mmol/L，地塞米松（DEX）1.0 μmol/L；四聯(lián)誘導組誘導分化培養(yǎng)基Ⅰ的成分為在三聯(lián)誘導組基礎上加入吲哚美辛0.1 mmol/L。2組均誘導分化培養(yǎng)基Ⅰ培養(yǎng)2 d，連續(xù)誘導2次后換用誘導分化培養(yǎng)基Ⅱ，成分為：高糖型DMEM培養(yǎng)基含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素混合液，人胰島素10 mg/ L。培養(yǎng)2 d，連續(xù)誘導2次。倒置顯微鏡和油紅O染色觀察誘導前及誘導后2組細胞的形態(tài)變化。結果 小鼠前脂肪細胞3T3-L1狀態(tài)良好，呈現(xiàn)鋪路石狀生長，均勻布滿培養(yǎng)瓶底，2 d傳代1次。四聯(lián)誘導組誘導分化結果優(yōu)于三聯(lián)誘導組。三聯(lián)誘導劑誘導前脂肪細胞后，細胞形態(tài)并未發(fā)生明顯變化。四聯(lián)誘導劑誘導前脂肪細胞后，可達到90%以上的成熟脂肪細胞。成熟的脂肪細胞呈圓形，有大量脂滴聚集，油紅O染色顯現(xiàn)橘紅色。結論 在三聯(lián)誘導基礎上加入吲哚美辛的四聯(lián)誘導法可以更好地促進脂肪前體細胞分化。

脂細胞；體外研究；細胞培養(yǎng)技術；3T3-L1細胞

隨著經濟的發(fā)展和生活方式的改變，低運動、高攝入、久坐等不良生活方式導致的肥胖已成為一個全球性的問題［1］。2010年我國成人超重率為29.3%，肥胖率為5.7%［2］。研究認為，肥胖癥可以導致血脂異常、高血壓、冠心病、糖尿病、呼吸睡眠暫停、骨關節(jié)炎、部分腫瘤（如乳腺癌、結腸癌、子宮內膜癌）等一系列并發(fā)癥［3-4］，但具體發(fā)病機制尚不清楚。小鼠前脂肪細胞3T3-L1是首選的研究脂肪細胞分化的模型細胞，被廣泛應用于肥胖的機制以及相關疾病的藥物篩選研究［5］。目前，常用的培養(yǎng)和誘導分化脂肪細胞的方法多為三聯(lián)誘導法，但該方法的誘導和分化效果并不理想。本研究旨在采用四聯(lián)誘導法優(yōu)化3T3-L1的培養(yǎng)和誘導分化，以期為肥胖藥物開發(fā)和研究提供更好的模型。

1 材料與方法

1.1 主要材料 小鼠前脂肪細胞系3T3-L1由天津醫(yī)科大學藥學實驗室段宏泉教授饋贈。高糖型 Dulbecco’5 modified Eagle’s medium（DMEM）液體培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司，牛血清（FBS）購自Hyclone公司；青霉素鈉100 U/mL，硫酸鏈霉素100 mg/L，0.25%胰蛋白酶含0.53 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）消化液購自Bioroc公司，二甲基亞砜（DMSO）購自Amresco公司，油紅O購自Solarbio公司；人胰島素購自Biological Industries公司，1-甲基-3-異丁基黃嘌呤（IBMX）、地塞米松（DEX）及吲哚美辛購自Sigma公司。10%甲醛PBS（成分：分析純甲醛10 mL、1×PBS緩沖液90 mL）購自天津市致遠化學試劑有限公司。誘導分化培養(yǎng)基Ⅰ，成分：高糖型DMEM培養(yǎng)基含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素混合液，人胰島素10 mg/L，IBMX 0.5 mmol/L，DEX 1.0 μmol/L。誘導分化培養(yǎng)基Ⅱ，成分：高糖型DMEM培養(yǎng)基含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素混合液，人胰島素10 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 小鼠前脂肪細胞3T3-L1置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細胞貼壁生長，伸出偽足呈梭形，胞漿均勻細膩，無脂滴，細胞長至80%時進行傳代。

1.2.2 細胞誘導分化 小鼠前脂肪細胞3T3-L1生長至完全匯合后開始計時，接觸抑制2 d即誘導分化0 d開始，細胞按誘導分化方式的不同分為2組。（1）三聯(lián)誘導組。誘導分化0 d起加入誘導分化培養(yǎng)基Ⅰ，2 d后更換新的誘導分化培養(yǎng)基Ⅰ，繼續(xù)培養(yǎng)2 d后換成誘導分化培養(yǎng)基Ⅱ，2 d后更換新的誘導分化培養(yǎng)基Ⅱ，繼續(xù)培養(yǎng)2 d，完成誘導分化過程。（2）四聯(lián)誘導組。原誘導分化培養(yǎng)基Ⅰ中加入吲哚美辛0.1 mmol/L，余誘導方法和步驟同三聯(lián)誘導組。

1.2.3 結果觀察 倒置顯微鏡觀察誘導前及誘導后2組的細胞形態(tài)。油紅O染色：染色前將飽和油紅O原液按 3∶2（油紅O∶蒸餾水）加入去離子水，混勻，配制工作液，室溫放置5～10 min，過濾后使用。將誘導完成后的細胞棄去原培養(yǎng)基，4%多聚甲醛室溫固定10 min，去離子水充分洗滌，60%異丙醇浸洗，取配制好的油紅O工作液進行染色，室溫放置10 min，去離子水沖洗多余的油紅O染料，Mayer蘇木素復染細胞核，去離子水沖洗后顯微鏡下觀察。前脂肪細胞誘導分化成為脂肪細胞后，使用油紅O染色，可見油紅O將脂滴染成紅色。

2 結果

2.1 誘導分化前3T3-L1形態(tài) 倒置顯微鏡下可見小鼠前脂肪細胞3T3-L1呈梭形，傳代后約2 h貼壁，4 h可伸出多偽足，呈片狀生長，24 h長滿細胞培養(yǎng)皿底面，呈鋪路石樣排列，可見細胞生長狀態(tài)各不相同，部分處于分裂過程中，細胞生長狀態(tài)良好，見圖1。細胞鋪滿培養(yǎng)皿底面后會出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象，退出細胞周期，有絲分裂過程停止，此時前脂肪細胞進入向成熟脂肪細胞分化階段，提示此時可以進行誘導劑的分化培養(yǎng)。

Fig.1 The appearance of mouse preadipocytes 3T3-L1 before being induced differentiation（×100）圖1 誘導分化前小鼠前脂肪細胞3T3-L1形態(tài)（×100）

2.2 誘導分化后2組細胞形態(tài)學變化

2.2.1 三聯(lián)誘導組 誘導分化前，前脂肪細胞3T3-L1呈梭形的成纖維細胞形態(tài)，細胞漿均勻細膩無脂滴；誘導完成時，前脂肪細胞3T3-L1胞漿內并未出現(xiàn)明顯的小脂滴，細胞形態(tài)也并未發(fā)生明顯變化，仍然呈梭形的成纖維細胞形態(tài)，見圖2。

2.2.2 四聯(lián)誘導組 誘導分化第4天即誘導分化培養(yǎng)基Ⅰ誘導完成時，細胞體積變大、變圓，胞質中出現(xiàn)散在細小脂滴；誘導分化第6天即使用人胰島素誘導分化2 d后，細胞體積進一步增大、變圓，脂滴聚集明顯增多，分布于細胞核周圍，形成“戒環(huán)”樣結構，在形態(tài)上轉變?yōu)槌墒熘炯毎?；誘導分化第8天時，細胞質中積聚更多的脂滴，90%以上細胞已分化成熟，見圖3。

3 討論

小鼠前脂肪細胞3T3-L1是1974年從Swiss 3T3-L1小鼠胚胎中分離克隆的細胞系，該細胞系具有單一分化潛能，體外培養(yǎng)時適當的誘導劑作用下可以分化為成熟脂肪細胞。脂肪細胞的分化是指胞漿均勻細膩不含脂滴的前體脂肪細胞定向分化為胞漿充滿脂滴的成熟脂肪細胞的過程，其分化過程包括細胞有絲分裂停止、細胞形態(tài)增大變圓、脂類合成酶表達增加、脂質聚集以及增加胰島素敏感性等生物學變化過程［6］。在前脂肪細胞向脂肪細胞轉化的過程中，各種轉錄因子表達模式的轉變發(fā)揮了重要作用，其中過氧化物增殖活化受體（Peroxisome proliferative activated receptor，PPARs）家 族 和CCAAT/增強子結合蛋白家族（CCAAT/enhance binding proteins，C/EBPs）轉錄因子的順序激活開啟了前脂肪細胞的分化過程，另外轉錄因子間的相互調控也促進了脂肪細胞的成熟［7］。脂肪細胞分化過程中的相關分子機制研究，為能量代謝及相關代謝疾病發(fā)生的分子機制和有效治療提供了思路和方法。

本研究顯示，小鼠前體脂肪細胞3T3-L1在分化過程中，細胞鋪滿培養(yǎng)皿底面后出現(xiàn)接觸抑制，停止有絲分裂，退出細胞周期，提示此時可以進行誘導劑的分化培養(yǎng)。傳統(tǒng)的脂肪細胞觀察方法有2種，即倒置顯微鏡明場下直接觀察脂肪空泡的出現(xiàn)和使用油紅O將脂滴染成紅色后再進行觀察。本研究同時使用了2種方法驗證脂肪細胞的出現(xiàn)，結果顯示，使用三聯(lián)誘導劑至誘導完成時，前脂肪細胞3T3-L1胞漿內并未出現(xiàn)明顯的小脂滴，細胞形態(tài)也并未發(fā)生明顯變化，仍然呈梭形的成纖維細胞形態(tài)。在四聯(lián)誘導劑的刺激下，前體脂肪細胞再次進入細胞周期進入第二輪細胞分裂，隨后調控分化的一系列轉錄因子相繼表達，長梭形細胞轉變?yōu)閳A球形，細胞體積增大，胞漿內出現(xiàn)大量脂滴，分布于細胞核周圍，隨著誘導時間的延長，脂滴逐漸由小變大，并融合形成“戒環(huán)”樣結構，最后細胞進入脂滴永久性累積的終端分化狀態(tài)。細胞形態(tài)的改變與文獻［8］報道一致。與以往脂肪前體細胞誘導方法［9］不同，以往的方法中3T3-L1細胞體外成脂需10 d，本研究誘導分化培養(yǎng)基Ⅰ加入吲哚美辛0.1 mmol/L，可以在更短的時間內將前脂肪細胞誘導為成熟脂肪細胞，并達到90%以上的誘導成功率。吲哚美辛屬于非甾體類抗炎藥。研究顯示，部分非甾體類藥物具有激活PPARγ的活性［10］。PPARγ是調控脂肪細胞分化主要核受體，主要存在于脂肪細胞中，是脂肪細胞分化的重要調控因子，并與胰島素增敏存在密切關系。吲哚美辛是PPARγ的配體，能夠活化PPARγ，從而發(fā)揮成脂誘導作用［11］。因此，結合本研究結果，筆者認為加入吲哚美辛可以更好地促進脂肪前體細胞分化。

綜上所述，隨著體外細胞培養(yǎng)模型的改建與相關研究的不斷深入，小鼠前脂肪細胞3T3-L1的成功培養(yǎng)和更好的誘導分化是后續(xù)相關研究的基本前提。本研究為肥胖相關疾病的藥物開發(fā)和研究，小鼠前脂肪細胞3T3-L1的培養(yǎng)及誘導分化提供了可靠的參考方法。

（圖2、3見插頁）

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（2016-03-26收稿 2016-05-24修回）

（本文編輯 陸榮展）

Discussion on cultivation and methodology of four-drug combination-induced differentiation in mouse preadipocytes 3T3-L1 cells

SUN Huizhi1，TIAN Derun1△，MENG Jie2，ZHAO Nan2，HAN Jie1，GAN Chunchun3，WANG Yong2
1 Department of Anatomy and Histology and Embryology，2 Department of Pathology，3 Department of Pharmacy，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China△

Objective To optimize and establish the methodology for culturing and inducing differentiation of mouse preadipocytes 3T3-L1.Methods The mouse cells 3T3-L1 were incubated in DMEM medium contained with 10%FBS，during which the incubation medium was refreshed every 2 to 3 days.Two methods were used to introduce differentiation，including three-drug combination group and four-drug combination group.The protocol of mediumⅠin three-drug combination group including insulin 10 mg/L，IBMX 0.5 mmol/L and DEX 1.0 μmol/L.The protocol of mediumⅠin fourdrug combination group including indometacin 0.1 mmol/L based on those of three-drug combination group.Both of them were incubated for 2 days and continuous for 2 times.And mediumⅡincluded insulin 10 mg/L for 2-day culturing and continuous for 2 times.Oil red O staining was used to observe the morphological changes of two groups of cells before and after treatment under inverted microscope.Results Mouse preadipocytes 3T3-L1 appeared in good conditions and grew in a paving stone fashion.These cells covered homogeneously the bottom of incubators，the culture medium refreshed every 2 days.The results of four-drug combination group were better than those of three-drug combination group.After three-drug combination induced differentiation，there was no significant change in cell morphology.Comparing with three-drug combination induced differentiation，four-drug combination was successfully achieved in over 90%of the cell inducing，which were round-shaped，with jacinth ester droplets by oil-red O staining.Conclusion We have optimized the method for culturing and inducing differentiation of mouse preadipocytes 3T3-L1 by adding indometacin on the basis of the three-drug combination induced differentiation.

adipocytes；in vitro；cell culture techniques；3T3-L1 cells

R329.24

A

10.11958/20160214

1國家自然科學基金項目（81270927）；2天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院大學生科研基金

1天津醫(yī)科大學人體解剖與組織胚胎學系（郵編300070），2病理教研室，3藥學院

孫慧誌（1998），女，臨床七年制在讀，主要從事肥胖發(fā)生機制的研究

△通訊作者 E-mail：tianderun@aliyun.com