許海峰，王 楠，姜生輝，王意程，劉靜軒，曲常志，王得云，左衛(wèi)芳，張 晶，冀曉昊，張宗營，毛志泉，陳學(xué)森

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018）

新疆紅肉蘋果雜種一代4個株系類黃酮含量及其合成相關(guān)基因表達(dá)分析

許海峰，王 楠，姜生輝，王意程，劉靜軒，曲常志，王得云，左衛(wèi)芳，張 晶，冀曉昊，張宗營，毛志泉，陳學(xué)森

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018）

【目的】研究新疆紅肉蘋果（Malus sieversii f. neidzwetzkyana（Dieck）Langenf.）與‘富士’（M. domestica cv. Fuji）等蘋果品種雜交后代株系間果實(shí)類黃酮合成差異的分子機(jī)理，為進(jìn)一步完善功能型蘋果育種的理論與技術(shù)體系提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā恳宰霞t2號及紅脆1、2、4號等紅肉程度存在明顯差異的4個蘋果株系發(fā)育后期的果實(shí)為試材，進(jìn)行MYB10啟動子基因型鑒定，并測定類黃酮組分和含量，分析類黃酮合成相關(guān)基因的表達(dá)。【結(jié)果】紅脆1、2、4號MYB10啟動子基因型均是R6R1型，而紫紅2號啟動子類型為R6R6型。紅脆1號和紫紅2號果實(shí)成熟期類黃酮含量分別為3.0 mg·g-1和3.1 mg·g-1；紫紅2號花青苷含量（23.9 U·g-1FW）是紅脆1號（12.2 U·g-1FW）的2倍，其他類黃酮組分含量（1 635.3 mg·kg-1）僅是紅脆1號的69%。紫紅2號MYB10和UFGT等轉(zhuǎn)錄因子及花青苷合成基因在果實(shí)發(fā)育后期（花后110—125 d）均具有較高的表達(dá)量；紅脆4號的MYB10雖然在果實(shí)發(fā)育后期（花后110—125 d）表達(dá)量較高，但bHLH3、TTG1、ANS和UFGT表達(dá)量較低。紅脆1、2、4號類黃酮組分含量分別為2 355.0、1 247.5和1 337.5 mg·kg-1，差異顯著；紅脆1號MYB12轉(zhuǎn)錄因子及FLS、LAR和ANR等類黃酮生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量較高，而MYB16和MYB111表達(dá)量較低；紅脆2、4號MYB12轉(zhuǎn)錄因子及FLS、LAR和ANR等類黃酮生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量較低，而MYB16和MYB111轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量較高?！窘Y(jié)論】MYB10、bHLH3和TTG1等轉(zhuǎn)錄因子及ANS和UFGT等花青苷生物合成結(jié)構(gòu)基因在果實(shí)發(fā)育后期高水平表達(dá)，可能是導(dǎo)致紫紅2號成熟期果肉花青苷含量高的主要原因，而MYB12、MYB16和MYB111等轉(zhuǎn)錄因子及DFR、FLS、LAR和ANR類黃酮生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的差異表達(dá)，可能是導(dǎo)致紅脆1、2、4號等3個株系類黃酮組分及含量差異的主要原因。

新疆紅肉蘋果；雜交后代；類黃酮；MYB10 ；基因表達(dá)分析

0　引言

【研究意義】蘋果果實(shí)含有較高比例、人體比較容易吸收利用的游離多酚，營養(yǎng)保健價(jià)值高，在預(yù)防心腦血管疾病、抗腫瘤及抗氧化等方面有較好的作用，世界上許多國家都大力推薦其為主要消費(fèi)果品［1-2］。中國是世界蘋果生產(chǎn)和消費(fèi)大國，大多為‘富士’，且主要用于鮮食［3］。因此，圍繞新疆野蘋果及其紅肉變型（Malus sieversii f.neidzwetzkyana（Dieck）Langenf.）等蘋果資源的科學(xué)保護(hù)與持續(xù)高效利用及栽培蘋果品種遺傳多樣性的拓展，開展功能型蘋果育種具有重要意義［4］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】有關(guān)蘋果類黃酮及其代謝機(jī)理的研究在近幾年取得了較大的進(jìn)展。已報(bào)道的蘋果果實(shí)類黃酮達(dá)34種，分屬黃烷醇、黃酮醇、二氫查爾酮、花青苷和二氫黃酮醇等5類［5］。有關(guān)蘋果類黃酮生物合成與調(diào)控機(jī)理的研究主要集中在花青苷上，目前已克隆、鑒定了CHS、ANS、UFGT等結(jié)構(gòu)基因［6］；在蘋果轉(zhuǎn)錄因子方面，有研究發(fā)現(xiàn) MdMYB1和（MdMYBA）受光照誘導(dǎo)，能夠調(diào)控果皮花青苷的合成，并從蘋果中克隆鑒定了5個MdMYB1等位基因MdMYB1-1—5［7-9］；隨后，有研究表明MdMYB10轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控蘋果葉片和果肉的紅色發(fā)育，并且其調(diào)控活性需要轉(zhuǎn)錄因子MdbHLH3和MdbHLH33的參與［10-11］；AN等［12］研究發(fā)現(xiàn)，蘋果 MdTTG1僅與bHLH蛋白存在直接相互作用，而無法與 MdMYB1發(fā)生互作。TELIAS等［13］研究表明，‘蜜脆’蘋果品種著色模式（條紅與暈紅）的可變性主要是由于MYB10啟動子區(qū)甲基化的不穩(wěn)定性；ESPLEY等［14］研究發(fā)現(xiàn)，紅肉蘋果品種‘Red Field’MdMYB10啟動子由于6個23 bp重復(fù)序列的插入，使得MdMYB10具有自激活特性和組成型表達(dá)，枝、葉、花及果實(shí)各部分均為紅色，并將這種含有6個重復(fù)序列的啟動子基因型命名為R6；而葉片和果心均為綠（白）色、僅果實(shí)外皮層組織為紅色的‘Sangrado’和‘jpp35’蘋果品種，則由MdMYB10同源基因MdMYB110a和MdMYB110a-jp調(diào)控其紅色部位花青苷的合成［15-16］，上述研究結(jié)果表明，不同蘋果品種的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理存在明顯差異。【本研究切入點(diǎn)】新疆野蘋果及其紅肉變型不僅是蘋果品質(zhì)育種的重要基因庫，同時也是世界栽培蘋果的祖先種［17-18］。但新疆野蘋果資源正遭到嚴(yán)重破壞，瀕臨滅絕［19］；為此，筆者課題組在群體遺傳結(jié)構(gòu)等相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，于2006年率先構(gòu)建了新疆紅肉蘋果與栽培蘋果品種的雜種分離群體［20-25］。張芮等［26］研究結(jié)果表明，雜種后代綿、脆肉株系果實(shí)質(zhì)地發(fā)育受乙烯調(diào)控；JI等［27-28］探討了激素和氮對愈傷組織花青苷生物合成的影響，并對紅色和黃色愈傷組織進(jìn)行了RNA-seq分析，而WANG等［29］則對F1分離群體中的紅色和綠色單株各20株進(jìn)行了RNA-seq分析，篩選到了與類黃酮合成（圖 1）相關(guān)的差異表達(dá)基因，而有關(guān)紅肉株系間類黃酮差異和果肉著色的分子機(jī)理尚有待研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以紫紅2號及紅脆1、2、4號等紅肉程度存在明顯差異的4個株系發(fā)育后期的果實(shí)為試材（圖2），進(jìn)行MYB10啟動子類型鑒定，并測定類黃酮和組分含量及相關(guān)基因的相對表達(dá)量，旨在為進(jìn)一步完善功能型蘋果育種的理論與技術(shù)體系提供參考。

圖1　蘋果類黃酮代謝途徑［30-31］Fig. 1 Metabolic pathway of flavonoid in apple［30-31］

圖2　4個蘋果株系成熟期截面圖Fig. 2 Sectional drawing of 4 apple strains in the mature period

1　材料與方法

試驗(yàn)于 2012—2015年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及泰安市橫嶺果樹育種基地進(jìn)行。

1.1 植物材料及試劑

1.1.1 植物材料 從新疆紅肉蘋果（Malus sieversii f. neidzwetzkyana）中的‘塔爾阿爾瑪’與‘煙富3號’（M. domestica cv. Fuji）雜種一代選育出紫紅2號及紅脆1、2、4號等紅肉程度存在明顯差異的4個株系，以其發(fā)育后期（近成熟期）的果實(shí)（圖 2）為試材，從果實(shí)近成熟期到果實(shí)完全成熟期，共采3次樣，分別為花后110、117和125 d。每次采樣均采10個果實(shí)，用液氮研磨成粉后，分裝成3份作為重復(fù)，在-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑盒及菌株等 DNA提取試劑盒、RNA提

取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR染料、phusion高保真DNA擴(kuò)增酶、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、零背景快速克隆試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購自天根生化科技北京有限公司，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（rutin；Sigma chemical，St，Louis，USA，≥98%）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 MYB10啟動子基因型鑒定及序列分析基因的啟動子序列為2 000 bp左右，以NCBI中登錄號為 AB557643.1的序列為模板，設(shè)計(jì)上下游引物分別為F：5′-CAATGTGTTAGGTGTAGCGT-3′，R：5′-CAGAAGCAAACACTGACAAG-3′。以紅脆1、2、4號及紫紅2號果肉的DNA為模板，phusion高保真酶擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定MYB10啟動子類型，膠回收后，按照天根零背景快速克隆試劑盒做連接、轉(zhuǎn)化，搖菌活化涂板，挑取單克隆，菌液PCR鑒定選擇6個陽性克隆測序。測序后序列比對采用ClustalX2軟件［32］，每個克隆間測序結(jié)果一致。

1.2.2 花青苷含量的測定 參考馮守千等［33］的方法，取0.5 g克果肉液氮研磨成粉后，用10 mL 1%HCl/甲醇于4℃浸提4 h，12 000 r/min離心10 min，取上清液用分光光度計(jì)測定提取液在553 nm和600 nm處吸光值。以每g果肉鮮質(zhì)量的提取液的吸光度變化值D553-D600=0.01作為1個花青苷單位，以U表示。

1.2.3 類黃酮含量的測定 參考JIA［34］的方法，稱取1 g果肉，用液氮研磨成粉后，加入10 mL 65%預(yù)冷的乙醇，4℃避光浸提4 h，12 000 r/min離心 20 min，保留上清。吸取0.5 mL上清液于試管中，按順序分別加入 1 mL NaNO2（5%）、1 mL Al（NO3）3（10%），4 mL NaOH（2 mol·L-1），混勻靜置15 min，在510 nm下測定吸光值（以80%乙醇作為空白對照）。以蘆丁為標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，類黃酮含量表示為mg蘆丁·g-1FW。重復(fù)3次，操作步驟同上。

1.2.4 類黃酮組分的測定 參考陳學(xué)森等［4］的方法，去除果皮，稱取10 g用液氮研磨成粉的果肉，加入50 mL 0.5%鹽酸甲醇溶液，4℃浸提2 h，過濾，濾液4℃暫時避光保存，殘?jiān)尤?0 mL 0.5%鹽酸甲醇溶液，4℃浸提1 h，過濾，合并濾液后37℃旋蒸去除丙酮，殘留部分5 000 r/min離心，上清液用甲醇定溶至10 mL。取5 mL定容后的溶液，用購自Waters公司的C18Sep-Pak小柱進(jìn)行純化［35］。進(jìn)樣前，所有流動相和樣品均過0.22 μm的有機(jī)濾膜。

液相色譜條件：色譜儀（WATERS ACQUITY UPLC）采用BEH C18柱（100 mm×2.1 mm）為色譜柱，1.7 μm填料粒徑，柱溫45℃，進(jìn)樣體積1 μL。流動相：已過濾的乙腈（A），體積分?jǐn)?shù)為0.2%的甲酸溶液（B）；梯度：A：0—0.1 min 5%；A：20 min，20%；A：22 min，80%；A：22.1 min，5%；A：25 min，5%，流速為0.3 mL·min-1。350 nm下分析黃酮醇類物質(zhì)，在280 nm下分析黃烷醇和二氫查爾酮類物質(zhì)。為確定各類物質(zhì)在紫外-可見光下的吸收特征，采用WATERS ACQUITY PDA檢測器，PAD掃描波長范圍200—700 nm。

1.2.5 實(shí)時熒光定量PCR 熒光定量PCR儀型號為伯樂 CFX96，熒光定量 PCR 反應(yīng)體系按 SYBR? Green PCR Master Mix 說明書配制，每個樣品設(shè)3個重復(fù)。反應(yīng)體系為20 μL：10 μL 2.5×RealMasterMix/ 20×SYBR Solution，1 μL cDNA（50 ng·μL-1），上下游引物各1 μL（5 μmol·L-1），7 μL ddH2O。反應(yīng)條件如下：①95.0℃預(yù)變性30 s；②95.0℃變性5 s；③58℃退火10 s；④72.0℃延伸30 s（②—④共45個循環(huán)）；⑤65℃孵育20 s；⑥溶解溫度從55℃到95℃，每升高0.5℃保持1 s；⑦停止反應(yīng)。以MdActin為內(nèi)參，每個基因擴(kuò)增均有內(nèi)參同時擴(kuò)增，默認(rèn)條件下讀取Ct值，采用2-ΔΔCT方法［36］進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 熒光定量引物設(shè)計(jì)

CHI、F3H、DFR、ANR、UFGT、bHLH3、Actin熒光定量引物參考文獻(xiàn)［37］，MYB12熒光定量引物參考文獻(xiàn)［38］，F(xiàn)LS（AF119095）、LAR（AY830131）、ANS（DQ139835）、MYB10（EU518249.2）、TTG1 （GU173814.1）、MYB16（HM122617.1）、MYB111 （HM122615.1）利用Beacon Designer7（http：//www.premierbiosoft.com/molecular_beacons/）設(shè)計(jì)熒光定量引物（表1）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，用DPS 7.05軟件（http：//www.chinadps.net）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1 4個蘋果株系MYB10啟動子基因型鑒定

4個蘋果株系MYB10啟動子基因型鑒定結(jié)果見圖3、4、5、6。圖3（DNA Marker為天根D2000）顯示紅脆1、2、4號瓊脂糖凝膠電泳為兩條帶，紫紅2號為一條帶；圖4顯示紅脆1、2、4號和紫紅2號在 659—681 bp有一個 23 bp重復(fù)序列（GTTAGACTGGTAGCTATTAACAA）［14］，紫紅2號在520—630 bp比紅脆1、2、4號多5個重復(fù)序列；圖5顯示，紅脆1、2、4號R6與紫紅2號R6基本一致，均含有 6個重復(fù)序列。因此，根據(jù) R6型的序列（圖6），推測紅脆1、2、4號MYB10啟動子為R6R1型，而紫紅2號MYB10啟動子類型為R6R6型。

表1　蘋果類黃酮生物合成相關(guān)基因qPCR擴(kuò)增引物序列Table 1 Primer sequence for qPCR amplification of flavonoids -biosynthesis genes in apple fruit

圖3　4個蘋果株系果實(shí)MYB10啟動子基因型鑒定Fig. 3 Genotype of MYB10 promoter in 4 apple strains

圖4　紅脆1、2、4號MYB10啟動子R1序列與紫紅2號R6序列比對結(jié)果Fig. 4 Sequence alignment consequence of MYB10 promoter in R1 of Hongcui NO.1、2、4 and R6 of Zihong NO. 2

2.2 4個蘋果株系果實(shí)發(fā)育后期類黃酮、類黃酮組分及花青苷含量

由圖7可以看出，在果實(shí)近成熟期（花后110—125 d），紅脆1號和紫紅2號果實(shí)類黃酮含量總體呈上升趨勢，其中成熟期（花后125 d），二者果實(shí)類黃酮含量分別為（3.0±0.16）mg·g-1和（3.1±0.18）mg·g-1；而紅脆2號和紅脆4號果實(shí)類黃酮含量總體呈下降趨勢，其中成熟期（花后125 d），二者果實(shí)類黃酮含量分別僅為（2.1±0.05）mg·g-1和（1.9±0.08）mg·g-1，紅脆1號和紫紅2號與紅脆2號和紅脆4號差異極顯著（P＜0.01）。由圖8可以看出，4個株系果實(shí)發(fā)育后期花青苷含量存在極顯著差異（P＜0.01），在成熟期紫紅2號最高（23.9±0.63 U·g-1FW），紅脆1號、紅脆4號和紅脆2號分別為（12.2±0.37）、（7.5±0.43）和（2.2±0.14）U·g-1FW。

圖5　紅脆1、2、4號MYB10啟動子R6序列與紫紅2號R6序列比對結(jié)果Fig. 5 Sequence alignment consequence of MYB10 promoter in R6 of Hongcui NO.1， 2， 4 and R6 of Zihong NO.2

圖6　R6型MYB10啟動子6個重復(fù)序列［14］Fig. 6 6 repeat sequences of R6 promoter in MYB10［14］

圖7　4個蘋果株系發(fā)育后期類黃酮含量變化Fig. 7 Change of flavonoid contents in 4 apple strains during the latter growth period

4個蘋果株系成熟期果實(shí)除花青苷之外的其他類黃酮組分及其含量的HPLC檢測結(jié)果見表2（合計(jì)為每個樣品每個重復(fù)值對應(yīng)相加后的平均值）。由表2可以看出，4個功能型蘋株系成熟期果實(shí)類黃酮組分及其含量存在明顯差異，其中從紅脆1號成熟果實(shí)中檢測到黃烷醇、二氫查爾酮和黃酮醇等 3類11種組分，總含量高達(dá)（2 355.01±15.9）mg·kg-1，而紅脆 2號成熟果實(shí)中檢測到黃烷醇、二氫查爾酮和黃酮醇等3類8種組分，總含量僅為（1 247.4± 12.4）mg·kg-1。

圖8　4個蘋果株系發(fā)育后期花青苷含量變化Fig. 8 Change of anthocyanin contents in 4 apple strains during the latter growth period

表2　4個蘋果株系成熟期果肉類黃酮組分及其含量Table 2 Comparison in composition and content of flavonoid among 4 apple strain’s flesh in the mature period （mg·kg-1）

2.3 4個蘋果株系果實(shí)發(fā)育后期類黃酮生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)分析

由圖9、10可以看出，紫紅2號MYB10、bHLH3、TTG1等轉(zhuǎn)錄因子及花青苷合成相關(guān)基因 ANS和UFGT在果實(shí)發(fā)育后期（花后110—125 d）均具有較高的表達(dá)量，而CHI、F3H、DFR、FLS、LAR等6個類黃酮生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量較低；紅脆4號的MYB10雖然在果實(shí)發(fā)育后期（花后110—125 d）表達(dá)量較高，但bHLH3、TTG1、ANS和UFGT均表達(dá)量較低；紅脆1號MYB12轉(zhuǎn)錄因子及FLS、LAR和ANR等類黃酮生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量較高，而MYB16和MYB111表達(dá)量較低；紅脆2、4號MYB12轉(zhuǎn)錄因子及FLS、LAR和ANR等類黃酮生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量較低，而 MYB16和MYB111轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量較高。

圖9　4個蘋果株系果實(shí)發(fā)育后期相關(guān)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量的變化Fig. 9 Changes of expression of structure-related genes in 4 functional apple strains during the latter period

圖10　4個蘋果株系果實(shí)發(fā)育后期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)量的變化Fig. 10 Changes of expression of transcription factors-related genes in 4 functional apple strains during the latter period

3　討論

3.1 蘋果果實(shí)花青苷合成差異及其與相關(guān)結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)系

花青苷與蘋果多種組織器官的呈色有關(guān)［39］，同時在人類醫(yī)療保健方面有重要的營養(yǎng)價(jià)值和藥理作用［40-41］。花青苷合成是類黃酮合成途徑的一個分支，其合成代謝涉及多個結(jié)構(gòu)基因、轉(zhuǎn)錄因子以及紫外輻射、干旱、低溫、茉莉酸、蔗糖、低氮等環(huán)境信號的誘導(dǎo)［42-43］。在蘋果花青苷合成途徑中，結(jié)構(gòu)基因ANS和UFGT對蘋果花青苷的合成具有決定性作用［44-45］；在蘋果轉(zhuǎn)錄因子方面，MdMYB10能夠調(diào)控果肉的顏色，其調(diào)控活性需要轉(zhuǎn)錄因子 MdbHLH3 和MdbHLH33的參與，且MdMYB10具有自激活特性［10，14］；AN［12］及 BRUEGGEMANN［46］等研究發(fā)現(xiàn)，MYB、bHLH和WD40轉(zhuǎn)錄因子能夠形成MBW復(fù)合體促進(jìn)花青苷的合成，但 MdTTG1僅與 bHLH類（MdbHLH3和MdbHLH33）轉(zhuǎn)錄因子相互作用，而無法與 MdMYB1發(fā)生互作。上述研究結(jié)果表明，MdMYB10（MdMYB1）、bHLH和MdTTG1是蘋果花青苷生物合成的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。

在本研究中，從‘紅富士’（R1R1）等蘋果品種與新疆紅肉蘋果（R6R1）雜種一代群體選育的紫紅2號，MYB10啟動子基因型為R6R6型，在參試的4個株系中紅肉程度最大，果肉深紅色，成熟期果實(shí)花青苷含量（23.9 U·g-1FW）是紅脆1號（12.2 U·g-1FW）的2倍，MYB10、bHLH3、TTG1等轉(zhuǎn)錄因子及ANS 和UFGT等花青苷合成關(guān)鍵基因在果實(shí)發(fā)育后期（花后110—125 d）均具有較高的表達(dá)量；MYB10啟動子類型為R6R1型的紅脆4號，雖然在果實(shí)發(fā)育后期（花后110—125 d）MYB10表達(dá)量較高，但bHLH3、TTG1、ANS和UFGT表達(dá)量較低。因此，其成熟期果實(shí)花青苷含量（7.5 U·g-1FW）僅是紫紅2號的31.4%。上述研究結(jié)果表明，MdMYB10、bHLH和MdTTG1是紫紅2號蘋果花青苷生物合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，這與已有的研究結(jié)果一致。因此，進(jìn)一步探討MdMYB10、bHLH和MdTTG1在調(diào)控紫紅2號蘋果花青苷生物合成進(jìn)程中的互作關(guān)系是今后研究的重要切入點(diǎn)。

STEVEN等［47］對4個資源圃的3 000份紅肉蘋果種質(zhì)資源進(jìn)行了MYB10啟動子類型的鑒定和分類，其中包含了栽培種、野生種和雜交種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，幾個R6R1類型的果肉深紅，而R6R6類型的果肉卻只是輕微粉紅，表明 R6位點(diǎn)起作用也要取決于它們的遺傳背景，具體有待進(jìn)一步研究。

3.2 蘋果果實(shí)類黃酮含量和組分差異及其與相關(guān)結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)系

已報(bào)道的蘋果果實(shí)類黃酮達(dá)34種，分屬黃烷醇、黃酮醇、二氫查爾酮、花青苷和二氫黃酮醇等5類［4］。張小燕等［20］研究發(fā)現(xiàn)，新疆野蘋果多酚物質(zhì)含量的遺傳多樣性極為豐富，總酚及主要多酚物質(zhì)含量顯著高于‘紅星’蘋果品種，表現(xiàn)出明顯的高黃酮特性。聶繼云等［48］研究發(fā)現(xiàn)，冬紅果和山荊子等 22種蘋果屬野生種質(zhì)資源的果實(shí)總黃酮含量均明顯高于栽培品種。

除了花青苷之外，有關(guān)蘋果黃烷醇及黃酮醇生物合成及調(diào)控機(jī)理的研究報(bào)道相對較少。LIN-WANG等［49］將 MdMYB16和 MdMYB111轉(zhuǎn)入過表達(dá) bHLH3+ MdMYB10的煙草葉片中，發(fā)現(xiàn)能夠抑制DFR啟動子的活性，認(rèn)為MdMYB16和MdMYB111屬于蘋果類黃酮代謝途徑的負(fù)調(diào)控因子；周蘭等［38］在蘋果中克隆出與擬南芥 AtMYB12同源的 MdMYB12，其功能與AtMYB12相同，都能夠促進(jìn)黃酮醇的合成，認(rèn)為MdMYB12是蘋果類黃酮代謝途徑的正調(diào)控因子；AN等［50］發(fā)現(xiàn)，蘋果MdMYB9和MdMYB11能夠促進(jìn)原花青素的合成；WANG等［29］則對新疆紅肉蘋果F1分離群體中的紅色和綠色單株各 20株進(jìn)行了RNA-seq分析，篩選到了與類黃酮合成相關(guān)的差異表達(dá)基因，推測MdMYB12和MdMYB6可能參與了類黃酮代謝途徑。

在本研究中，紫紅2號和紅脆1號果實(shí)成熟期類黃酮含量相當(dāng)，分別為3.0 mg·g-1和3.1 mg·g-1，但紫紅2號花青苷含量（23.9 U·g-1FW）是紅脆1號（12.2 U·g-1FW）的2倍，黃烷醇和黃酮醇等類黃酮組分含量（1 635.3 mg·kg-1）僅是紅脆1號（2 355.0 mg·kg-1）的69%，而紫紅2號FLS、LAR及ANR等類黃酮生物合成結(jié)構(gòu)基因的低表達(dá)水平可能是其類黃酮組分含量低的主要原因；HAN等［51］研究發(fā)現(xiàn)，蘋果MdANR在轉(zhuǎn)基因煙草中過表達(dá)，導(dǎo)致兒茶素和表兒茶素（黃烷醇）含量增加，而抑制了CHI和DFR的表達(dá)及花青苷的合成；因此，紫紅2號MYB10、bHLH3、TTG1等轉(zhuǎn)錄因子及ANS和UFGT等花青苷合成關(guān)鍵基因在果實(shí)發(fā)育后期的高水平表達(dá)，可能是FLS、LAR及ANR等類黃酮生物合成結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量低的主要原因，其調(diào)控關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

紅脆1、2、4號的MYB10啟動子基因型均為R6R1，類黃酮組分含量分別為 2 355.0 mg·kg-1、1 247.5 mg·kg-1和1 337.5 mg·kg-1，差異顯著；紅脆1號MYB12、CHI、F3H、DFR、FLS、LAR和ANR等轉(zhuǎn)錄因子及類黃酮生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量較高，而MYB16 和MYB111表達(dá)量較低；紅脆2、4號MYB12表達(dá)量較低，而MYB16和MYB111表達(dá)量較高。因此，MYB12、MYB16和MYB111等轉(zhuǎn)錄因子及DFR、FLS、LAR和ANR類黃酮生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的差異表達(dá)，可能是導(dǎo)致MYB10啟動子基因型均為R6R1型的紅脆1、2、4號等3個株系類黃酮及組分含量差異的主要原因。進(jìn)一步探討MYB12、MYB16和MYB111等轉(zhuǎn)錄因子在功能型蘋果株（品）系類黃酮生物合成中的調(diào)控機(jī)理，是今后研究的重要切入點(diǎn)之一。

4　結(jié)論

紅脆1、2、4號的MYB10啟動子基因型均為R6R1，而紫紅2號MYB10啟動子類型為R6R6型。紫紅2號和紅脆1號果實(shí)成熟期類黃酮含量相當(dāng)，但紫紅2號花青苷含量是紅脆1號的2倍。MYB10、bHLH3和TTG1等轉(zhuǎn)錄因子及ANS和UFGT等花青苷生物合成結(jié)構(gòu)基因在果實(shí)發(fā)育后期的高水平表達(dá)，可能是導(dǎo)致紫紅 2號成熟期果肉花青苷含量高的主要原因；而MYB12、MYB16和MYB111等轉(zhuǎn)錄因子及DFR、FLS、LAR和 ANR類黃酮生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的差異表達(dá)，可能是導(dǎo)致MYB10啟動子基因型均為R6R1型紅脆1、2、4號等3個株系類黃酮及組分含量差異的主要原因。

References

［1］ 陳學(xué)森， 韓明玉， 蘇桂林， 劉鳳之， 過國南， 姜遠(yuǎn)茂， 毛志泉， 彭福田， 束懷瑞. 當(dāng)今世界蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展趨勢及我國蘋果產(chǎn)業(yè)優(yōu)質(zhì)高效發(fā)展意見. 果樹學(xué)報(bào)， 2010， 27（4）： 598-604. CHEN X S， HAN M Y， SU G L， LIU F Z， GUO G N， JIANG Y M，MAO Z Q， PENG F T， SHU H R. Discussion on today’s world apple industry trends and the suggestions on sustainable and efficient development of apple industry in China. Journal of Fruit Science，2010， 27（4）： 598-604. （in Chinese）

［2］ 陳學(xué)森， 郭文武， 徐娟， 叢佩華， 王力榮， 劉崇懷， 李秀根， 吳樹敬，姚玉新， 陳曉流. 主要果樹果實(shí)品質(zhì)遺傳改良與提升實(shí)踐. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015， 48（17）： 3524-3540. CHEN X S， GUO W W， XU J， CONG P H， WANG L R， LIU C H， LI X G， WU S J， YAO Y X， CHENX L. Genetic improvement and promotion of fruit quality of main fruit trees. Scientia Agricultura Sinica， 2015， 48（17）： 3524-3540. （in Chinese）

［3］ VRHOVSEK U， RIGO A， TONON D， MATTIVI F. Quantitation of polyphenols in different apple varieties. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2004， 52（21）： 6532-6538.

［4］ 陳學(xué)森， 張晶， 劉大亮， 冀曉昊， 張宗營， 張芮， 毛志泉， 張艷敏，王立霞， 李敏. 新疆紅肉蘋果雜種一代的遺傳變異及功能型蘋果優(yōu)株評價(jià). 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014， 47（11）： 2193-2204. CHEN X S， ZHANG J， LIU DA L， JI X H， ZHANG Z Y， ZHANG R，MAO Z Q， ZHANG Y M， WANG L X， LI M. 2014. Genetic variation of F1 population between Malus sieversii f. neidzwetzkyana and apple varieties and evaluation on fruit characters of functional apple excellent strains. Scientia Agricultura Sinica， 2014， 47（11）：2193-2204. （in Chinese）

［5］ 聶繼云， 呂德國， 李靜， 劉鳳之， 李萍. 蘋果果實(shí)中類黃酮化合物的研究進(jìn)展. 園藝學(xué)報(bào)， 2009， 36（9）： 1390-1397. NIE J Y， Lü D G ， LI J， LIU F Z， LI P. Advances in studies on flavonoids in apple fruit. Acta Horticulturae Sinica， 2009， 36（9）：1390-1397. （in Chinese）

［6］ CHIKAKO H， NOBUHIRO K， MASATO W， SATORU K， SHOZO K， JUNICHI S， ZILIAN Z， TOMOMI T， TAKAYA M. Anthocyanin biosynthetic gene are coordinately expressed during red coloration in apple skin. Plant Physiology and Biochemistry， 2002， 40： 955-962.

［7］ TAKOS A M， JAFFé F W， JACOB S R， BOGS J， ROBINSON S P，WALKER A R. Light-induced expression of a MYB gene regulates anthocyanin biosynthesis in red apples. Plant Physiology， 2006，142（3）： 1216-1232.

［8］ BAN Y， HONDA C， HATSUYAMA Y， IGARASHI M， BESSHO H，MORIGUCHI T. Isolation and functional analysis of a MYB transcription factor gene that is a key regulator for the development of red coloration in apple skin. Plant and Cell Physiology， 2007， 48：958-970.

［9］ SEKIDO K， YAMADA K， SHIRATAKE K， FUKUI H， MATSUMOTO S. MdMYB alleles responsible for apple skin and flesh color. Current Topics in Plant Biology， 2010， 11： 17-21.

［10］ ESPLEY R V， HELLENS R P， PUTTERILL J， STEVENSON D E，KUTTY-AMMA S， ALLAN A C. Red colouration in apple fruit is due to the activity of the MYB transcription factor MdMYB10. The Plant Journal， 2007， 49： 414-427.

［11］ XIE X B， LI S， ZHANG R F， ZHAO J， CHEN Y C， ZHAO Q， YAO Y X， YOU C X， ZHANG X S， HAO Y J. The bHLH transcription factor MdbHLH3 promotes anthocyanin accumulation and fruit colouration in response to low temperature in apple. Plant， Cell and Environment， 2012， 35： 1884-1897.

［12］ AN X H， TIAN Y， CHEN K Q， WANG X F， HAO Y J. The apple WD40 protein MdTTG1 interacts with bHLH but not MYB proteins to regulate anthocyanin accumulation. Journal of Plant Physiology， 2012，169（7）： 710-717.

［13］ TELIAS A， LIN-WANG K， STEVENSON D E， COONEY J M，HELLENS R P， ALLAN A C， HOOVER E E， BRADEEN J M. Apple skin patterning is associated with differential expression of MYB10. BMC Plant Biology， 2011， 11： 93.

［14］ ESPLEY R V， BRENDOLISE C， CHAGNé D， KUTTY-AMMA S，GREEN S， VOLZ R， PUTTERILL J， SCHOUTEN H J， GARDINER S E， HELLENS R P， ALLAN A C. Multiple repeats of a promoter segment causes transcription factor autoregulation in red apples. The Plant Cell， 2009， 21： 168-183.

［15］ CHAGNé D，LIN-WANG K，ESPLEY R V，VOLZ R K，HOW N M，ROUSE S，BRENDOLISE C，CARLISLE C M，KUMAR S， DE SILVAN，MICHELETTI D， GHIE T， ROWHURST R N， TOREY D，LASCO R， ENS R P， INER S E. An ancient duplication of apple MYB transcription factors is responsible for novel red fruit-flesh phenotypes. Plant Physiology， 2013， 161： 225-239.

［16］ UMEMURA H， OTAGAKI S， WADA M， KONDO S，MATSUMOTO S. Expression and functional analysis of a novel MYB gene， MdMYB110a_JP， responsible for red flesh， not skin colorin apple fruit. Planta， 2013， 238： 65-76.

［17］ NOCKER S V， BERRY G， NAJDOWSKI J， MICHELUTTI R，LUFFMAN M， FORSLINE P， ALSMAIRAT N， BEAUDRY R，NAIR M G， ORDIDGE M. Genetic diversity of red-fleshed apples （Malus）. Euphytica， 2012， 185： 281-293.

［18］ CHEN X S， FENG T， ZHANG Y M， HE T M， FENG J R， ZHANG C Y. Genetic diversity of volatile components in Xinjiang wild apple （Malus sieversii）. Journal of Genetic and Genomics， 2007， 34（2）：171-179.

［19］ 馮濤， 張艷敏， 陳學(xué)森. 新疆野蘋果居群年齡結(jié)構(gòu)及郁閉度研究.果樹學(xué)報(bào)， 2007， 24（5）： 571-573. FENG T， ZHANG Y M， CHEN X S. Study on the age structure and density of the wild apple forest of Malus sieversii. Journal of Fruit Science， 2007， 24（5）： 571-573. （in Chinese）

［20］ 張小燕， 陳學(xué)森， 彭勇， 王海波， 石俊， 張紅. 新疆野蘋果酚類物質(zhì)組分的遺傳多樣性. 園藝學(xué)報(bào)， 2008， 35（9）： 1351-1356. ZHANG X Y， CHEN X S， PENG Y， WANG H B， SHI J， ZHANG H. Genetic diversity of phenolic compounds in Malus sieversii. Acta Horticulturae Sinica， 2008， 35（9）： 1351-1356. （in Chinese）

［21］ 張小燕， 陳學(xué)森， 彭勇， 王海波， 石俊， 張紅. 新疆野蘋果礦質(zhì)元素與糖酸組分的遺傳多樣性. 園藝學(xué)報(bào)， 2008， 35（2）： 277-280. ZHANG X Y， CHEN X S， PENG Y， WANG H B， SHI J， ZHANG H. Genetic diversity of mineral elements， sugar and acid components in Malus sieversii （Ldb.） Roem. Acta Horticulturae Sinica， 2008， 35（2）：277-280. （in Chinese）

［22］ ZHANG C Y， CHEN X S， HE T M， LIU X L， FENG T， YUAN Z H. Genetic structure of Malus sieversii population from Xinjiang， China，revealed by SSR markers. Journal of Genetics and Genomics， 2007，34（10）： 947-955.

［23］ 張艷敏， 馮濤， 張春雨， 何天明， 張小燕， 吳傳金， 劉遵春， 王艷玲，束懷瑞， 陳學(xué)森. 新疆野蘋果研究進(jìn)展. 園藝學(xué)報(bào)， 2009， 36（3）：447-452. ZHANG Y M， FENG T， ZHANG C Y， HE T M， ZHANG X Y， WU C J， LIU Z C， WANG Y L， SHU H R， CHEN X S. Advances in research of the Malus sieversii （Lebed.） Roem. Acta Horticulturae Sinica， 2009， 36（3）： 447-452. （in Chinese）

［24］ 馮濤， 張紅， 陳學(xué)森， 張艷敏， 何天明， 馮建榮， 許正. 新疆野蘋果果實(shí)形態(tài)與礦質(zhì)元素含量多樣性以及特異性狀單株. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)， 2006， 7（3）： 270-276. FENG T， ZHANG H， CHEN X S， ZHANG Y M， HE T M， FENG J R，XU Z. Genetic diversity of fruit morphological traits and content of mineral element in Malus sieversii （Ldb.） Roem and its elite seedlings. Journal of Plant Genetic Resources， 2006， 7（3）： 270-276. （in Chinese）

［25］ 王延玲， 張艷敏， 馮守千， 宋楊， 徐玉亭， 張友朋， 陳學(xué)森. 新疆紅肉蘋果果皮果肉呈色差異機(jī)理. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 45（13）：2771-2778. WANG Y L， ZHANG Y M， FENG S Q， SONG Y， XU Y T， ZHANG Y P， CHEN X S. The mechanism of red coloring difference between skin and cortex in Malus sieversii f. neidzwetzkyana （Dieck） Langenf. Scientia Agricultura Sinica， 2012， 45（13）： 2771-2778. （in Chinese）

［26］ 張芮， 張宗營， 高利平， 冀曉昊， 毛志泉， 許海峰， 王楠， 吳樹敬，陳學(xué)森. 蘋果綿肉與脆肉株系果實(shí)質(zhì)地差異的分子機(jī)理. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015， 48（18）： 3676-3688. ZHANG R， ZHANG Z Y， GAO L P， JI X H， MAO Z Q， XU H F，WANG N， WU S J， CHEN X S. Study on the molecular mechanism controlling differences in fruit texture formation of apple soft/crisp strains. Scientia Agricultura Sinica， 2015， 48（18）： 3676-3688. （in Chinese）

［27］ JI X H ， WANG Y T ， ZHANG R， WU S J ， AN M M， LI M，WANG C Z ， CHEN X L ， ZHANG Y M ， CHEN X S. Effect of auxin，cytokinin and nitrogen on anthocyanin biosynthesis in callus cultures of red-fleshed apple （Malus sieversii f. niedzwetzkyana）. Plant Cell，Tissue and Organ Culture， 2015， 120： 325-337.

［28］ JI X H， ZHANG R， WANG N， YANG L， CHEN X S. Transcriptome profiling reveals auxin suppressed anthocyanin biosynthesis in red-fleshed apple callus （Malus sieversii f. niedzwetzkyana）. Cell，Tissue and Organ Culture， 2015， 123： 389-404.

［29］ WANG N， ZHENG Y， DUAN N B， ZHANG Z Y， JI X H， JIANG S H， SUN S S， YANG L， BAI Y， FEI Z J， CHEN X S.Comparative transcriptomes analysis of red and white-fleshed apples in an F1 populationof Malus sieversii f. niedzwetzkyana crossed with M. domestica ‘Fuji’. PLoS One， DOI：10.1371/journal.pone.0133468， July 24， 2015.

［30］ CHRISTIAN G， HEIDI H， JASMIN K， SILVIJA M， KARL S. Biosynthesis of phloridzin in apple （Malus domestica Borkh）. Plant Science， 2009， 6： 223-231.

［31］ IRIS S， HENRYK F， LI H H， HEIDRUN H， DIETER T， IONELA R，HANKE M V， KARL S， THILO C F. Shift in polyphenol profile and sublethal phenotype caused by silencing of anthocyanidin synthase in apple （Malus sp）. Planta， 2009， 229： 681-692.

［32］ LARKIN M A， BLACKSHIELDS G， BROWN N P， CHENNA R，MCGETTIGAN P A， MCWILLIAM H， VALENTIN F， WALLACE I M， WILM A， LOPEZ R， THOMPSON J D， GIBSON T J， HIGGINS D G. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics， 2007， 23：2947-2948.

［33］ 馮守千， 陳學(xué)森， 張春雨， 劉曉靜， 劉遵春， 王海波， 王延玲， 周朝華. 砂梨品種‘滿天紅’及其芽變品系‘奧冠’花青苷合成與相關(guān)酶活性研究. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2008， 41（10）： 3184-3190. FENG S Q， CHEN X S， ZHANG C Y， LIU X J， LIU Z C， WANG H B，WANG Y L， ZHOU Z H. A Study of the relationship between anthocyanin biosynthesis and related enzymes activity in Pyrus pyrifolia ‘Mantianhong’ and its bud sports ‘Aoguan’. Scientia Agricultura Sinica， 2008， 41（10）： 3184-3190. （in Chinese）

［34］ JIA Z S， TANG M C， WU J M. The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxideradicals. Food Chemistry， 1999， 64（4）： 555-559.

［35］ LONGO L， SCARDINO A， VASAPOLLO G. Identification and quantification of anthocyanin in the berries of Pistacia lentiscus L. Phillyrea latifolia L. and Rubia peregrina L. Innovative Food Science &Emerging Technologies， 2007， 8： 360-364.

［36］ KENNETH J L， THOMAS D S. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-CT△△method. Methods， 2001， 25： 402-408.

［37］ XU Y T， FENG S Q， JIAO Q Q， LIU C C， ZHANG W W， CHEN W Y， CHEN X S. Comparison of MdMYB1 sequences and expression of anthocyanin biosynthetic and regulatory genes between Malus domestica Borkh. cultivar ‘Ralls’ and its blushed sport. Euphytica，2012， 185： 157-170.

［38］ 周蘭. 蘋果果實(shí)發(fā)育中類黃酮含量變化及相關(guān)基因的研究［D］. 北京： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 2013. ZHOU L. Study on the concentration changes and related genes of flavonoids in apple ［D］. Beijing： Chinese Academy of Agricultural Sciences， 2013. （in Chinese）

［39］ KOES R， VERWEIJ W， QUATTROCCHIO F. Flavonoids： A colorful model for the regulation and evolution of biochemical pathways. Trends in Plant Science， 2005， 10（5）： 236-242.

［40］ PETRONI K， TONELLI C. Recent advances on the regulation of anthocyanin synthesis in reproductive organs. Plant Science， 2011，181（3）： 219-229.

［41］ 劉曉芬， 李方， 殷學(xué)仁， 徐昌杰， 陳昆松. 花青苷生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究進(jìn)展. 園藝學(xué)報(bào)， 2013， 40（11）： 2295-2306. LIU X F， LI F， YIN X R， XU C J， CHEN K S. Recent advances in the transcriptional regulation of anthocyanin biodynthesis. Acta Horticulturae Sinica， 2013， 40（11）： 2295-2306. （in Chinese）

［42］ JAAKOLA L. New insights into the regulation of anthocyanin biosynthesis in fruits. Trends in Plant Science， 2013，18（9）： 477-483.

［43］ PATRA B， SCHLUTTENHOFER C， WU Y， PATTANAIK S， YUAN L. Transcriptional regulation of secondary metabolite biosynthesis in plants. Biochimicaet Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms，2013， 1829（11）： 1236-1247.

［44］ KIM S Y， LEE J R， KIM S R. Characterization of an apple anthocyanidin synthase gene in transgenic tobacco plants. Journal of Plant Biology， 2006， 49（4）： 326-330.

［45］ KONDO S， HIRAOKA K， KOBAYASHI S， HONDA C， TERAHARA N. Changes in the expression of anthocyanin biosynthetic genes during apple development. Journal of the American Society for Horticultural Science， 2002， 127： 971-976.

［46］ BRUEGGEMANN J， WEISSHAAR B， SAGASSER M. A WD40-repeat gene from Malus×domestica is a functional homologue of Arabidopsis thaliana TRANSPARENT TESTA GLABRA1. Plant Cell Reports， 2010， 29（3）： 285-294.

［47］ StevenV N， Garrett B， James N， Roberto M， Margie L， Philip F，Nihad A， Randy B， Nair M G， Matthew O. Genetic diversity of red-fleshed apples （Malus）. Euphytica， 2012， 185： 281-293

［48］ 聶繼云， 呂德國， 李靜， 劉鳳之， 李海飛， 王昆. 22種蘋果種質(zhì)資源果實(shí)類黃酮分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010， 43（21）： 4455-4462. NIE J Y， Lü D G， LI J， LIU F Z， LI H F， WANG K. A preliminary study on the flavonoids in fruits of 22 apple germplasm resources. Scientia Agricultura Sinica， 2010， 43（21）： 4455-4462. （in Chinese）

［49］ LIN-WANG K， MICHELETTI D， PALMER J， VOLZ R， LOZANO L，ESPLEY R V， HELLENS R P， CHAGNè D， ROWAN D D，TROGGIO M， IGLESIA I， ALLEN A C. High temperature reduces apple fruit colour via modulation of the anthocyanin regulatory complex. Plant， Cell and Environment， 2011， 34： 1176-1190.

［50］ AN X H， TIAN Y， CHEN K Q， LIU X J， LIU D D， XIE X B， CHENG C G， CONG P H， HAO Y J. MdMYB9 and MdMYB11 are involved in the regulation of the JA-induced biosynthesis of anthocyanin and proanthocyanidin in apples. Plant Cell Physiology， 2015， 56（4）：650-662.

［51］ HAN Y P， VIMOLMANGKANG S， SORIA-GUERRA R E，KORBAN S S. Introduction of apple ANR genes into tobacco inhibits expression of both CHI and DFR genes in flowers， leading to loss of anthocyanin. Journal of Experimental Botany， 2012， 63（7）： 2437-2447.

（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Content and Analysis of Biosynthesis-Related Genes of Flavonoid Among Four Strains of Malus sieversii f. neidzwetzkyana F1Population

XU Hai-feng， WANG Nan， JIANG Sheng-hui， WANG Yi-cheng， LIU Jing-xuan， QU Chang-zhi， WANG De-yun，ZUO Wei-fang， ZHANG Jing， JI Xiao-hao， ZHANG Zong-ying， MAO Zhi-quan， CHEN Xue-sen
（College of Horticultural Science and Engineering， Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology，Tai’an 271018， Shandong）

【Objective】In order to develop the theory and breeding technology of functional apple， the molecular mechanism of the differences of flavonoid biosynthesis in several cross progenies of Malus sieversii f.neidzwetzkyana and M. domestica cv. Fuji was studied. 【Method】 Four apple stains （Zihong NO.2， Hongcui NO.1， Hongcui NO.2 and Hongcui NO.4） with significantdifference in red-flesh degree during the latter growth period were used as materials. The type of MYB10 promoter was identified，and the components and contents of flavonoids and the relative expressions of related genes were determined.【Result】The type of MYB10 promoter in Hongcui NO.1， Hongcui NO.2， and Hongcui NO.4 was R6R1， and that of Zihong NO.2 was R6R6. The contents of flavonoids in the mature period between Hongcui NO.1 （3.0 mg.g-1）and Zihong NO.2 （3.1 mg·g-1） were equivalent， while the anthocyanin content in Zihong NO.2 （23.9 U·g-1FW） was twice as that in Hongcui NO.1 （12.2 U·g-1FW）， and other contents of flavonoid of anthocyanin in Zihong NO.2 （1 635.3 mg·kg-1） was only 69% of that in Hongcui NO.1 （2 355.0 mg·kg-1）. The transcription factors and anthocyanin biosynthesis genes such as MYB10 and UFGT in Zihong NO.2 had higher expression during the latter growth period （110-125 d）. The expression of MYB10 in Hongcui NO.4 during the latter growth period （110-125 d） was higher，but the expression of bHLH3， TTG1， ANS and UFGT were lower. The contents of flavonoid components among Hongcui NO.1 （2 355.0 mg·kg-1）， Hongcui NO.2 （1 247.5 mg·kg-1） and Hongcui NO.4 （1 337.5 mg·kg-1） indicated significant differences. In Hongcui NO.1， the MYB12， FLS， LAR and ANR showed higher expression， while the expression of MYB16 and MYB111 were lower. The MYB12， FLS， LAR and ANR in Hongcui NO.2 and Hongcui NO.4 showed lower expression， while the expression of MYB16 and MYB111 were higher.【Conclusion】The transcription factors， such as MYB10， BHLH3， TTG1， and the structure genes which were associated with anthocyanin biosynthesis including ANS， UFGT were obviously up-regulated during the latter growth period， and it might be the main reason that caused high anthocyanin content in Zihong NO.2 flesh in the mature period. Meanwhile， the transcription factors， for example， MYB12， MYB16， MYB111， and the structure genes that relative to flavonoid biosynthesis such as DFR， FLS， LAR， ANR had different expressions， and it might be the main reason that led to the difference in the components and contents of flavonoid among the 3 strains of Hongcui NO.1， Hongcui NO.2 and Hongcui NO.4.

M.sieversii f. neidzwetzkyana； cross progeny； flavonoid； MYB10； gene expression analysis

2016-01-31；接受日期：2016-04-15

國家自然科學(xué)基金（31572091）、國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303093）、山東省水果創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-03-022-01）

聯(lián)系方式：許海峰，E-mail：997524744@qq.com。通信作者陳學(xué)森，E-mail：chenxs@sdau.edu.cn