徐 瑩，晏國全，張 揚，余紅秀

（復(fù)旦大學生物醫(yī)學研究院，上海 200032）

中國3個主栽煙草品種的差異蛋白質(zhì)組學研究

徐 瑩，晏國全，張 揚，余紅秀

（復(fù)旦大學生物醫(yī)學研究院，上海 200032）

【目的】從全蛋白質(zhì)組學水平研究煙草，篩選具有重要特性的蛋白質(zhì)，闡明其相關(guān)代謝通路，使得煙草的基礎(chǔ)科學研究和品種培育工作有所突破。【方法】利用苯酚法提取中國 3個主栽煙草品種紅花大金元、K326和云煙87葉片的蛋白質(zhì)，酶解后采用串聯(lián)質(zhì)量標簽技術(shù)（tandem mass tag，TMT）標記，結(jié)合二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（2D LC-MS/MS）對3個煙草品種葉片的蛋白質(zhì)組成進行分析，運用Proteome Discoverer軟件提取譜圖后在 MASCOT 搜索引擎上鑒定蛋白質(zhì)和肽段，并對鑒定的蛋白質(zhì)進行系統(tǒng)的生物信息學分析，包括數(shù)據(jù)相關(guān)性分析、分層聚類分析和主成分分析，同時按照2倍上下調(diào)的原則采用火山圖篩選不同品種煙草中表達差異顯著的蛋白質(zhì)，最后利用 KEGG通路分析煙草中重要蛋白質(zhì)的分布及功能?！窘Y(jié)果】鑒定紅花大金元、K326和云煙 87煙草樣品的蛋白質(zhì)Group總數(shù)為3 079，蛋白質(zhì)ID數(shù)為10 343。從分層聚類分析和主成分分析中蛋白質(zhì)的整體表達情況可見，K326和云煙87蛋白質(zhì)表達情況較相似，而紅花大金元與前兩者相差較大。后續(xù)的差異蛋白質(zhì)篩選也驗證了該結(jié)果，表現(xiàn)為云煙87和K326之間僅存在29個差異表達的蛋白質(zhì)，其中13個蛋白質(zhì)覆蓋8條代謝通路，包括類黃酮生物合成，參與類黃酮合成路徑的查爾酮合成酶在K326中的相對含量顯著高于云煙87。紅花大金元和云煙87之間有160個蛋白質(zhì)差異表達，其中103個蛋白質(zhì)覆蓋42條代謝通路，包括谷胱甘肽代謝，相對定量結(jié)果顯示谷胱甘肽代謝途徑相關(guān)的3種酶，谷胱甘肽過氧化物酶、磷脂過氧化氫物谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶在紅花大金元中的含量均顯著低于云煙87。紅花大金元和K326之間存在119個差異蛋白質(zhì)，其中89個蛋白質(zhì)覆蓋41條代謝通路，包括外源物質(zhì)細胞色素P450代謝。篩選獲得的重要差異蛋白質(zhì)的相對定量結(jié)果顯示一些與抗性相關(guān)的蛋白質(zhì)，如蛋白酶抑制劑，在云煙87中的表達量遠低于K326和紅花大金元，同時結(jié)果表明紅花大金元中的超氧化物歧化酶含量處于較低水平?！窘Y(jié)論】TMT技術(shù)結(jié)合2D LC-MS/MS可對不同品種煙草的葉片蛋白質(zhì)進行有效地分離和鑒定，鑒定出的蛋白質(zhì)大部分是參與光合作用、物質(zhì)代謝或者與抗逆性相關(guān)。

煙草；差異蛋白質(zhì)組學；串聯(lián)質(zhì)量標簽；二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

0　引言

【研究意義】煙草（Nicotiana tabacum），作為中國重要的經(jīng)濟作物［1］，實現(xiàn)其質(zhì)量、抗性等的精確改良和定向育種具有重要意義。隨著煙草基因組學的蓬勃發(fā)展，日漸發(fā)現(xiàn)，僅僅探討基因是遠遠不夠的，蛋白質(zhì)作為基因功能的直接體現(xiàn)者和最終執(zhí)行者，是生物生命活動的基礎(chǔ)［2-3］。因此，只有結(jié)合煙草基因的表達產(chǎn)物——蛋白質(zhì)展開深入研究，才能破譯其基因組序列中蘊藏的遺傳信息，從而揭示煙草生命活動的本質(zhì)［4］以突破傳統(tǒng)育種的技術(shù)瓶頸?！厩叭搜芯窟M展】早前關(guān)于煙草蛋白質(zhì)定性定量的研究，均基于二維凝膠電泳（2DE）分離結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）鑒定的技術(shù)，如GHARECHAHI等［5］利用高分辨率二維凝膠電泳檢測到930個蛋白點，但由于2DE在技術(shù)上存在一些挑戰(zhàn)，導致多種可能具有重要功能的痕量調(diào)控蛋白難以被分離［6-8］。因此，更先進、更高通量、準確性和靈敏度的技術(shù)用于煙草蛋白質(zhì)組學定性定量的研究顯得尤為重要。隨著蛋白質(zhì)組學實驗技術(shù)的日漸發(fā)展，二維凝膠電泳技術(shù)被取代，標記技術(shù)的發(fā)明極大地加速了蛋白質(zhì)組學向更廣和更深的領(lǐng)域發(fā)展。蔡永占等［9］報道利用 iTRAQ標記技術(shù)開展不同氣候條件下云煙87葉片差異表達蛋白分析，最終注釋到47個差異表達蛋白質(zhì)，并分析得出這些蛋白質(zhì)參與碳代謝、氮代謝和環(huán)境響應(yīng)等生命進程。蔡永占等［10］在2個生態(tài)點的煙草葉片中檢測到39個差異蛋白點。張柳等［1，11］采用iTRAQ標記方法共檢測到煙草不同發(fā)育階段432個差異表達蛋白質(zhì)，其中注釋到308個蛋白質(zhì)與多種生命過程相關(guān)。【本研究切入點】以上研究均是有關(guān)不同外界環(huán)境或者不同發(fā)育階段煙草的差異蛋白質(zhì)組學，而利用標記技術(shù)開展關(guān)于不同煙草品種間差異蛋白質(zhì)組學的研究卻鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以3個煙草品種紅花大金元、K326和云煙87的葉片為研究材料，采用串聯(lián)質(zhì)量標簽技術(shù)（tandem mass tags，TMT）結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，對不同品種煙草的蛋白表達進行比較研究，旨在分析不同煙草品種在蛋白質(zhì)組學水平上存在的差異，為未來研究和發(fā)展煙草生理學奠定堅實的基礎(chǔ)，也進一步為煙草品種的改良提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1 試驗材料

紅花大金元、K326和云煙87均為中國主栽煙草品種，三者各具特色。紅花大金元，因其突出的、無法替代的香型特點而受到各卷煙企業(yè)的青睞［12-13］，但其易烤性差，高感黑脛?。?4-15］；云煙 87是由云煙 2號和K326雜交選育而成，綜合了雙親的優(yōu)點［16］，K326和云煙 87均易烘烤，中抗黑脛?。?5］。煙草品種紅花大金元、K326和云煙87的中部葉片，來自湖北中煙工業(yè)有限責任公司，種植于湖北恩施州沐撫基地，屬中亞熱帶季風型山地濕潤性氣候，按照行距120 cm，株距55 cm，采用統(tǒng)一的大田管理措施。移栽后70 d（成熟前期），每個品種隨機采集 9株煙草上 9—11葉位的中部葉片，重復(fù)采樣2次，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 蛋白質(zhì)樣品的制備

每個煙草品種每份稱取1 g葉片，液氮冷凍條件下，在預(yù)先冷卻的研缽中將材料研磨成細碎的粉末。

1.3 蛋白質(zhì)提取

林世鋒等［17］通過比較 4種總蛋白的提取方法證明苯酚法提取分離得到的蛋白數(shù)量較多，雜質(zhì)較少，分離效果較好，更適合后續(xù)分析。因此，利用苯酚法［18］進行葉片全蛋白提取。在離心管中加入3 mL提取緩沖液（500 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液、500 mmol·L-1EDTA溶液、700 mmol·L-1蔗糖溶液、100 mmol·L-1KCl溶液，用HCl溶液調(diào)pH至8.0，使用前加入β-巰基乙醇和苯甲基磺酰氟，最終濃度分別為2%和1 mmol·L-1），并加入1 g研碎的煙草葉片，渦旋后在冰浴中振蕩10 min，再加入等體積的Tris飽和酚，室溫下振蕩10 min后將樣品離心（10 min、5 500 r/min、4℃），分層后最上層的苯酚轉(zhuǎn)移至新的離心管中。在含蛋白質(zhì)的苯酚液中加入3 mL的提取緩沖液進行反萃取，振蕩3 min后渦旋；樣品離心（10 min、5 500 r/min、4℃）后轉(zhuǎn)移上層酚相至新離心管中，并加入4倍體積的沉淀液（預(yù)冷的0.1 mmol·L-1乙酸銨甲醇溶液）。顛倒振蕩離心管，-20℃沉淀過夜。離心沉淀蛋白質(zhì)（10 min、5 500 r/min、4℃）。離心后，用預(yù)冷沉淀液漂洗沉淀3次，最后用預(yù)冷丙酮漂洗。每一次漂洗后，樣品均要離心（5 min、5 500 r/min、4℃）。真空干燥沉淀，-80℃貯藏充分干燥的蛋白質(zhì)沉淀。

1.4 蛋白定量

根據(jù) BRADFORD［19］的方法測定提取后的樣品蛋白質(zhì)濃度，以牛血清蛋白（BSA）作為蛋白標準品，作標準曲線，在λ=595 nm時，應(yīng)用UV mini 1240紫外分光光度計測定出每個蛋白質(zhì)樣品在595 nm波長下的OD值，通過標準曲線方程計算相應(yīng)蛋白質(zhì)樣品的濃度，剩余樣品分裝于-80℃冰箱冷藏備用。

1.5 酶解與標記

對提取的蛋白質(zhì)樣品進行還原烷基化處理，打開二硫鍵以便于蛋白質(zhì)樣品變性并利用蛋白酶進行水解。按照 1∶30比例在蛋白質(zhì)樣品中加入胰蛋白酶，37℃的條件下酶解16 h；TMT標記試劑平衡至室溫，每管標記試劑中加入41 μL乙腈，渦旋1 min，離心甩至管底，將標記試劑分別加入對應(yīng)肽段溶液中，不同樣品用不同的同位素標記。126標記云煙蛋白質(zhì)樣品1（Y1），127標記云煙蛋白質(zhì)樣品2（Y2），128標記紅花大金元蛋白質(zhì)樣品1（H1），129標記紅花大金元蛋白質(zhì)樣品2（H2），130標記K326蛋白質(zhì)樣品1（K1），131標記K326蛋白質(zhì)樣品2（K2）。肽段與標記試劑混勻后，甩至管底，室溫靜置2 h，加入8 μL 5%羥胺，室溫靜置15 min以終止反應(yīng)。將標記好的多個樣品混合成一個樣品，轉(zhuǎn)移至新的離心管中。對真空抽干標記后的樣品進行液相串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.6 液質(zhì)聯(lián)用

色譜條件：采用 Waters納升級超高效液相色譜（UPLC?）系統(tǒng)。

第一維色譜條件：高pH流動相A為20 mmol·L-1甲酸銨，pH=10.0（色譜純氨水調(diào)節(jié)）；高pH流動相B為20 mmol·L-1甲酸銨，90%乙腈，pH=10.0（色譜純氨水調(diào)節(jié)）。使用52 μL A相溶解除鹽后的標記肽段粉末。在Waters公司H-Class超高壓液相色譜系統(tǒng)上使用超高效色譜柱（BEH C18 1.7 μm，2.1 mm×50 mm）進行分離，上樣50 μL。流速600 μL·min-1，在紫外光波長為215 nm條件下檢測。從2 min開始，每0.5 min收集一管餾分。

第二維色譜Nano LC的洗脫條件及梯度：A液成分：水，0.1%甲酸，B液成分：乙腈，0.1%甲酸，色譜柱：類型C18，規(guī)格500 mm×75 μm，孔徑100 ?，粒徑2 μm，流速：300 nL·min-1，每個餾分溶解于32 μL A相中，上樣8 μL，每個餾分運行2 h液質(zhì)聯(lián)用分析。

Q-Exactive質(zhì)譜鑒定：將標記好的酶解產(chǎn)物經(jīng)二維液相色譜分級分離并脫鹽后用 Q-Exactive 質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。檢測方式：離子化模式：正離子模式；離子源電壓：1 800 V，毛細管溫度：250℃；一級掃描范圍：350—1 200 Da；二級掃描范圍：依賴于一級母離子質(zhì)荷比自動選擇；碎裂模式：高能碰撞解離（higher energy collision dissociation，HCD）。獲得差異表達肽段及其序列，并通過二級質(zhì)譜中不同TMT的豐度及面積來計算不同樣品間差異蛋白質(zhì)的相對含量。

1.7 蛋白鑒定及數(shù)據(jù)庫查詢

運用 Proteome Discoverer軟件提取譜圖后在MASCOT搜索引擎（Version 2.3）中進行蛋白質(zhì)和肽段鑒定。查詢參數(shù)如下：數(shù)據(jù)庫和庫容：NCBI，104 349（茄科）。搜庫條件：固定修飾設(shè)定為半胱氨酸碘脲甲基化；可變修飾為甲硫氨酸氧化、賴氨酸 TMT標記、肽段N端TMT標記；一級搜庫誤差為10×10-6mol·L-1；二級搜庫誤差為 50 mmu；最大漏切位點設(shè)為2；采用胰酶；使用Percolator算法進行數(shù)據(jù)卡值保證假陽性率（false positive rate，F(xiàn)DR）小于等于1%。搜索結(jié)束后，Proteome Discoverer軟件根據(jù)Mascot搜索結(jié)果和第一步篩選后的譜圖進行定量分析。

1.8 生物信息學分析

通過相關(guān)性分析、分層聚類分析（hierarchy clustering analysis，HCA）和主成分分析（principal component analysis，PCA）從不同角度對所有鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)進行質(zhì)量檢測評估，并將定量數(shù)據(jù)按照2倍上下調(diào)的原則，利用火山圖篩選不同品種煙草的差異蛋白質(zhì)［20］。最后，利用KEGG通路分析煙草目標蛋白的分布及功能［21］。

2　結(jié)果

2.1 蛋白鑒定結(jié)果

經(jīng)質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫查詢，鑒定紅花大金元、K326和云煙87煙草樣品的蛋白質(zhì)Group數(shù)為3 079，蛋白質(zhì)ID數(shù)為10 343。

2.2 相關(guān)性分析

相關(guān)性散點圖可通過散點圖和數(shù)據(jù)來衡量樣品間的相關(guān)性。從圖1可以看出，H1和H2的相關(guān)性系數(shù)為0.966，系數(shù)較高表示紅花大金元組內(nèi)數(shù)據(jù)相關(guān)性較好。組間相關(guān)性系數(shù)低，線性差是可以接受的，說明不同煙葉品種間蛋白質(zhì)表達譜差異較大。

圖1　3種煙草蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的相關(guān)性散點圖Fig. 1 Correlation scatter diagram of the protein data of three tobacco varieties

2.3 分層聚類分析

分層聚類分析是用3個煙草品種葉片蛋白質(zhì)的表達值來重新排列蛋白，以識別其中最重要的差異蛋白質(zhì)，具體是分配數(shù)據(jù)使其形成層層有嚴格等級的嵌套型子集，最終構(gòu)成一個類似于家譜的樹狀結(jié)構(gòu)［22］，從而顯示不同煙草品種具有代表性的差異表達蛋白群。通過對全部有定量信息的蛋白質(zhì)進行分層聚類分析（圖 2），蛋白質(zhì)被分成表達上調(diào)（紅色）、表達下調(diào)（綠色）和表達無差異（黑色）3種集群。組內(nèi)樣本相似度較高，先被聚成同一個亞簇，由于K326和云煙87樣本蛋白質(zhì)表達相似互相聚類，最終形成與紅花大金元樣本明顯不同的一簇。由此可見，K326和云煙87葉片蛋白質(zhì)表達相似度高，蛋白質(zhì)表達量的上調(diào)與下調(diào)較為一致，但二者的蛋白質(zhì)表達與紅花大金元則存在較大差異。

圖2　3種煙草蛋白質(zhì)組的分層聚類分析Fig. 2 Hierarchy clustering analysis for the proteome of three tobacco varieties

2.4 主成分分析

主成分分析是基于原有變量建立兩兩不相關(guān)的反映差異蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)原有信息的新變量信息［23］，通過主成分分析構(gòu)建了反映3個不同煙草品種差異蛋白質(zhì)組信息的三維分析圖（圖 3），克服變量過多的復(fù)雜性，降低鑒定蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)至低維度空間。直觀地顯示了樣本的蛋白質(zhì)組差異，云煙87和紅花大金元的組內(nèi)數(shù)據(jù)重復(fù)性較好，云煙87和紅花大金元在第一主成分（component 1）和第三主成分（component 3）上均存在較大差異，在第二主成分（component 2）上差別很小。

2.5 差異蛋白質(zhì)篩選及KEGG通路分析

圖3　3種煙草蛋白質(zhì)組的主成分分析Fig. 3 Principal component analysis for the proteome of three tobacco varieties

通過控制2倍上下調(diào)來篩選品種間的差異蛋白質(zhì)并進行KEGG通路分析（表1），K326和云煙87存在29個差異蛋白質(zhì)（表1，圖4-A），其中13個蛋白質(zhì)覆蓋8條代謝通路（表1），包括類黃酮生物合成（圖 5）、氨基酸代謝等，并比較得出參與類黃酮合成路徑的查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS，EC 2.3.1.74）在K326中的相對含量顯著高于云煙87（圖6）。紅花大金元和云煙87存在160個差異蛋白質(zhì)（表1，圖4-B），其中103個蛋白質(zhì)覆蓋42條代謝通路（表1），包括谷胱甘肽代謝（圖7）、TCA循環(huán)等，相對定量結(jié)果顯示谷胱甘肽代謝途徑中的谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GP，EC 1.11.1.9），磷脂過氧化氫物谷胱甘肽過氧化物酶（phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase，PHGPx，EC 1.11.1.12）和谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST，EC 2.5.1.18）3種酶在紅花大金元中的含量均顯著低于云煙87（圖8）；K326和紅花大金元存在119個差異蛋白質(zhì)（表1，圖4-C），其中89個蛋白質(zhì)覆蓋41條代謝通路（表1），包括外源物質(zhì)細胞色素P450代謝等。圖表中得出不同煙草品種間差異蛋白質(zhì)的表達情況，也驗證了分層聚類分析得出的關(guān)于K326和云煙87葉片蛋白質(zhì)表達相似度高而二者與紅花大金元存在較大差異的結(jié)果。

圖4　3種煙草差異蛋白質(zhì)的火山圖Fig. 4 Volcano plot of the differentially expressed proteins of three tobacco varieties

圖5　類黃酮生物合成通路部分Fig. 5 Part of flavonoid biosynthesis pathway

表1　3種煙草差異表達蛋白的數(shù)目及其覆蓋的代謝通路Table 1 Number of differentially expressed proteins and metabolic pathways covered by proteins of three tobacco varieties

其中，對于差異尤為明顯的蛋白質(zhì)進行相對定量分析（圖9），云煙87中蛋白酶抑制劑的表達量遠低于K326和紅花大金元（圖9-A），而在超氧化物歧化酶的含量方面則是紅花大金元處于劣勢（圖9-B）。

圖6　云煙87和K326中查爾酮合成酶相對含量的比較Fig. 6 Comparison of relative content of chalcone synthase between Yunyan87 and K326

3　討論

本研究運用串聯(lián)質(zhì)量標簽技術(shù)，輔助液質(zhì)聯(lián)用鑒定紅花大金元、K326和云煙87葉片的差異表達蛋白質(zhì)，與XIE等［23］報道正常和受到鹽脅迫的煙草中共鑒定到5 570個蛋白質(zhì)、GHARECHAHI等［5］利用高分辨率二維凝膠電泳檢測到煙草中930個蛋白點相比，本研究鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)量在目前已有報道的煙草蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)中屬于規(guī)模最大的。

3.1 類黃酮的合成路徑

云煙87和K326中存在的差異蛋白質(zhì)參與圖5中的類黃酮合成途徑，途徑中的查爾酮合成酶被報道是類黃酮合成的第一個關(guān)鍵酶［24］。煙草中的類黃酮化合物被李勇等［25］報道是煙草香味的重要前體物質(zhì)，其分解產(chǎn)物可提高煙草的香氣質(zhì)量，改善煙草香味品質(zhì)。表現(xiàn)為在煙葉生長、成熟、調(diào)制、醇化以及燃燒過程中轉(zhuǎn)化產(chǎn)生次級產(chǎn)物從而直接影響烤煙的香氣質(zhì)和香氣量［24］。類黃酮合成路徑中的關(guān)鍵酶查爾酮合成酶在K326中的含量顯著高于云煙87（圖6），將有利于類黃酮的合成，與鄧小華等［26］描述的在相同生態(tài)條件下，K326 在香氣質(zhì)和香氣量上要優(yōu)于云煙87的表現(xiàn)相一致。

除此之外，類黃酮在煙株的防御和抗逆機制中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用［24］。類黃酮化合物是大多數(shù)氧自由基的清除劑，在植物生理學中扮演著重要角色，保護植物免受干旱和寒冷脅迫、紫外線輻射或病原體感染等［27］，同時，類黃酮還具有潛在的藥理價值，如自由基清除、抗氧化、抗炎、抗癌、軟化血管以及抗脂質(zhì)過氧化等［28］?？傊慄S酮化合物除了在植物生長和環(huán)境適應(yīng)中發(fā)揮重要功能，還被證明有利于人類健康。

圖7　谷胱甘肽代謝通路部分Fig. 7 Part of glutathione metabolism pathway

3.2 谷胱甘肽的代謝通路

紅花大金元和云煙87的差異蛋白質(zhì)覆蓋了谷胱甘肽的代謝通路（圖 6），該通路通過清除自由基和活性氧，以維持細胞正常代謝過程中活性氧自由基的動態(tài)平衡［29］。作為通路的主角，谷胱甘肽是由谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）和甘氨酸（Gly）組成的一種含巰基的小分子肽［30］，在細胞中以還原型（GSH）和氧化型（GSSG）2種形式存在［31-32］。谷胱甘肽參與細胞生長、分化、死亡和衰老的調(diào)節(jié)［33］，比如VERNOUX等［34］和CAIRNS等［35］報道擬南芥GSH缺失突變體表型的分析顯示GSH參與胚胎和分生組織的生長。GSH在防御和抵抗各種脅迫，如低溫、干旱、鹽堿、重金屬等條件下發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［32，36］，是植物逆境脅迫應(yīng)答中的關(guān)鍵性蛋白［37］。

圖8　云煙87和紅花大金元中與谷胱甘肽代謝相關(guān)酶相對含量的比較Fig. 8 Comparison of relative content of enzymes related to glutathione metabolism between Yunyan87 and Honghuadajinyuan

谷胱甘肽過氧化物酶，磷脂過氧化氫物谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等保護性酶參與谷胱甘肽代謝通路（圖 7）。谷胱甘肽過氧化物酶通過還原過氧化氫、有機羥過氧化物或相應(yīng)醇類以減輕對機體造成的損傷［38］。對于谷胱甘肽代謝通路的理解有利于研究谷胱甘肽及其相關(guān)酶類的變化對細胞功能產(chǎn)生的影響［31］。磷脂過氧化氫物谷胱甘肽過氧化物酶又稱為谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPx4），是谷胱甘肽過氧化物酶家族中第二個被鑒定的細胞內(nèi)含硒酶［39］，也是GP家族中唯一能還原膜內(nèi)氫過氧化物的酶［38］。

圖9　3種煙草中抗性相關(guān)差異蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑（A）和超氧化物歧化酶（B）相對含量的比較Fig. 9 Comparison of relative content of differentially expressed proteins related to resistance such as proteinase inhibitor （A） and superoxide dismutase （B） in three tobacco varieties

植物中的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶通過催化谷胱甘肽與有毒異源物或氧化產(chǎn)物的親核加成以促進該類物質(zhì)的代謝，實現(xiàn)清除或者區(qū)域化隔離［40-41］。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶具有多元生物功能，在植物抗逆境脅迫以及維持植物的新陳代謝等方面發(fā)揮重要作用［42］。EDWARDS等［43］表明谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶表達的上調(diào)可作為植物應(yīng)對逆境壓力的標志之一。3種保護性酶在紅花大金元中的含量均顯著低于云煙87（圖8）。該結(jié)果與張樹堂［12］和解芬等［44］所報道紅花大金元的抗逆性高截然相反，因為逆境條件分為多種多樣，一方面谷胱甘肽代謝相關(guān)的酶只覆蓋了抗性的一部分，另一方面他人的研究是關(guān)于抗性的綜合性評價，而且煙草的抗逆性與所處的區(qū)域環(huán)境等也是息息相關(guān)，如云煙87在湖北環(huán)神農(nóng)架地區(qū)和云南昭通抗赤星病能力均低于 K326和紅花大金元［45-46］，而在酉陽煙區(qū)云煙87的赤星病發(fā)病率是檢測的10個品種中最低的，低于K326和紅花大金元［47］。由此可見，相關(guān)酶類對煙草抗逆性的調(diào)節(jié)過程是復(fù)雜的。

3.3 細胞色素P450相關(guān)代謝通路

紅花大金元和K326的差異蛋白質(zhì)覆蓋的代謝通路涉及細胞色素P450，細胞色素P450是一個龐大而重要的血紅素單氧酶超家族，有著廣泛的酶底物和相應(yīng)的功能［48］，作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、質(zhì)體、高爾基體和其他膜性細胞器。該家族不僅參與植物的基本新陳代謝，也參與次生代謝，主要在2個生命過程中發(fā)揮功能：（a）次生代謝產(chǎn)物如類黃酮、生物堿、萜類化合物等的生物合成和（b）有毒的外源性化學物質(zhì)的降解［49-50］。而其中煙草生物堿的合成是其體內(nèi)有害物質(zhì)的重要路徑，萜類化合物的代謝是煙草香氣物質(zhì)的重要來源。由此可見，細胞色素 P450對于提升煙草香味的間接作用非同小可［50］。從圖 10中比較細胞色素P450在紅花大金元中含量高于K326，不能否認細胞色素 P450所產(chǎn)生的次生代謝物在紅花大金元的獨特香味方面所做出的貢獻，但究竟是何種代謝產(chǎn)物占主導地位以及細胞色素 P450的具體調(diào)控機制均有待下一步的研究與探討。

圖10　紅花大金元和K326中細胞色素P450相對含量的比較Fig. 10 Comparison of relative content of cytochrome P450 between Honghuadajinyuan and K326

3　.4 抗性相關(guān)蛋白質(zhì)的分析

蛋白酶抑制劑（proteinase inhibitor，PI）是一種廣泛存在于多種植物中抑制蛋白水解酶的小分子蛋白或多肽［51］。一般分為4類：絲氨酸類、半胱氨酸類、天冬氨酸類和金屬類蛋白酶抑制劑［52］。之前有多項證據(jù)表明蛋白酶抑制劑具有抗蟲性，其通過抑制植食性昆蟲蛋白水解酶的活性而在植物防御昆蟲的過程中發(fā)揮作用，作用的有效性取決于蛋白酶抑制劑與靶向昆蟲消化道內(nèi)主要蛋白酶之間的親合性和特異性［53］。由于昆蟲腸道內(nèi)多為絲氨酸蛋白酶，因此，絲氨酸類蛋白酶抑制劑與植物的抗蟲性關(guān)系更為緊密。孫興華等［54］認為培育蛋白酶抑制劑含量高或易誘導的黃瓜品種有可能是控制有害昆蟲南美斑潛蠅的有效途徑。HILDER等［55］首次報道 PI在轉(zhuǎn)基因植物的運用是將豇豆中的胰蛋白酶抑制劑轉(zhuǎn)入煙草，產(chǎn)生了相對于非轉(zhuǎn)基因煙草的抗綠棉鈴蟲的煙草品種。JULIA等［52］也驗證了蛋白酶抑制劑可用于提高轉(zhuǎn)基因植物對昆蟲的抗性。圖9-A中可以看出，紅花大金元與K326中蛋白酶抑制劑的含量相差無幾，而云煙87中蛋白酶抑制劑的含量幾乎不足紅花大金元和K326含量的二分之一。鑒于上文實例，云煙87的抗蟲性有望通過誘導蛋白酶抑制劑的表達而得到進一步的改善。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一種抗氧化金屬酶［56］，是煙草抗逆機制中的關(guān)鍵酶。根據(jù)活性位點金屬輔助因子的不同分為4個分布廣泛且功能重要的亞型：Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD和Ni-SOD［57］。一般通過催化超氧化物自由基生成過氧化氫和氧氣來發(fā)揮防御氧化損傷的作用。Fe-SOD在煙草中可能與光合作用有關(guān)，Mn-SOD可能與線粒體呼吸，胞質(zhì)中的生化途徑有關(guān)；同樣地，葉綠素中的 Cu/Zn-SOD也與胞質(zhì)中的生化途徑關(guān)系緊密［58］。CAMP等［57］表明SOD的表達在胞質(zhì)和葉綠素亞型抗逆中的重要性，并表明SOD的活性是植物受到氧化脅迫時抗損傷的一個潛在限速因子，其研究結(jié)果顯示，由AhCuZnSOD超表達導致SOD活性水平的上升可能促進由各種環(huán)境引起煙草的氧化損傷的恢復(fù)。多項研究［14，59-60］均表明SOD的活性與煙草的抗黑脛病能力呈正相關(guān)，并且可將SOD的活性作為鑒別黑脛病抗性的生理生化指標之一，由此可見，SOD對煙草黑脛病防御能力的意義重大。圖9-B中顯示SOD在紅花大金元的表達量均要低于K326和云煙87，而紅花大金元是易感黑脛病的［14-15］，也就是SOD在抗黑脛病品種K326和云煙87中高表達而在感黑脛病品種紅花大金元中低表達，這在某種程度上證實了前人的結(jié)論，也有助于進一步展開煙草黑脛病與煙草中關(guān)鍵性酶相關(guān)作用機制的研究。

4　結(jié)論

K326和云煙 87的蛋白質(zhì)表達譜存在一定的相似性，而與紅花大金元相差較大，差異蛋白質(zhì)的篩選結(jié)果也與之吻合。其中部分差異蛋白質(zhì)參與了光合作用、能量代謝、抗逆境脅迫等重要路徑，在維持煙草正常生理功能，提高生存能力方面發(fā)揮關(guān)鍵性作用。

References

［1］ 張柳， 王錚， 張亞婕， 林春， 陳嚴平， 李軍營， 毛自朝. 煙草葉片衰老期過程中的蛋白質(zhì)組學分析. 植物生理學報， 2014， 50（4）：488-500.ZHANG L， WANG Z， ZHANG Y J， LIN C， CHEN Y P， LI J Y， MAO Z C. Proteomic analysis of senescing leaf of tobacco. Plant Physiology Journal， 2014， 50（4）： 488-500. （in Chinese）

［2］ UHRIG R G， MOORHEAD G B. Plant proteomics： Current status and future prospects. Journal of Proteomics， 2013， 88： 34-36.

［3］ 柴薇薇， 普曉俊， 喬巖， 楊芳. 蛋白質(zhì)組學在植物逆境脅迫研究中的進展. 生物學雜志， 2013， 30（6）： 70-75. CHAI W W， PU X J， QIAO Y， YANG F. Advances in plant proteomics research under abiotic stress. Journal of Biology， 2013， 30（6）： 70-75. （in Chinese）

［4］ 劉秋員， 劉峰峰， 甄煥菊， 張軍方， 符云鵬. 蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)及其在煙草科學研究中的應(yīng)用前景. 中國農(nóng)學通報， 2009， 25（2）：93-99. LIU Q Y， LIU F F， ZHEN H J， ZHANG J F， FU Y P. Advances in research techniques of proteomics and its application in tobacco scientific research. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2009， 25（2）：93-99. （in Chinese）

［5］ GHARECHAHI J， HAJIREZAEI M， SALEKDEH G H. Comparative proteomic analysis of tobacco expressing cyanobacterial flavodoxin and its wild type under drought stress. Journal of Plant Physiology，2015， 175： 48-58.

［6］ 趙鳳霞， 高相彬， 王正平， 李海峰， 宋學立， 冀敏. 蛋白質(zhì)組學技術(shù)在煙草研究中的應(yīng)用進展. 中國煙草學報， 2014， 20（1）： 103-110. ZHAO F X， GAO X B， WANG Z P， LI H F， SONG X L， JI M. Research and application of proteomics in tobacco. Acta Tabacaria Sinica， 2014， 20（1）： 103-110. （in Chinese）

［7］ 崔紅， 冀浩， 張華， 邵惠芳， 李東宵， 陳亮. 不同生態(tài)區(qū)煙草葉片蛋白質(zhì)組學的比較. 生態(tài)學報， 2008， 28（10）： 4873-4880. CUI H， JI H， ZHANG H， SHAO H F， LI D X， CHEN L. Comparative analysis of leaf proteomes between tobacco plants growing in different ecological regions of China. Acta Ecologica Sinica， 2008，28（10）： 4873-4880. （in Chinese）

［8］ 陳宗瑜， 畢婷， 吳瀟瀟. 濾減UV-B輻射對烤煙蛋白質(zhì)組變化的影響. 生態(tài)學雜志， 2012， 31（5）： 1129-1135. CHEN Z Y， BI T， WU X X. Effects of reduced UV- B radiation on the variation of flue-cured tobacco proteome. Chinese Journal of Ecology，2012， 31（5）： 1129-1135. （in Chinese）

［9］ 蔡永占， 周普雄， 張柳， 王錚， 徐瓊?cè)A， 楊煥文， 毛自朝. 不同氣候條件對“云煙 87”旺長期葉片光合速率及蛋白表達的影響. 中國煙草學報， 2015， 21（1）： 39-48. CAI Y Z， ZHOU P X， ZHANG L， WANG Z， XU Q H， YANG H W，MAO Z C. Effects of climate conditions on photosynthetic rate and protein expression in Yunyan 87 leaves at vigorous growth stage. Acta Tabacaria Sinica， 2015， 21（1）： 39-48. （in Chinese）

［10］ 蔡永占， 周普雄， 李佛琳， 趙昶靈， 林春， 楊煥文， 毛自朝. 不同氣候環(huán)境中團棵期煙草葉片蛋白質(zhì)組學分析. 中國農(nóng)業(yè)科學， 2013，46（4）： 859-870. CAI Y Z， ZHOU P X， LI F L， ZHAO C L， LIN C， YANG H W， MAO Z C. Proteomic analysis of tobacco rosette stage leaves under different climatic conditions. Scientia Agricultura Sinica， 2013， 46（4）： 859-870. （in Chinese）

［11］ 張柳. 煙草葉片衰老過程變化的蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組研究［D］. 昆明：云南農(nóng)業(yè)大學， 2014. ZHANG L. Changes of proteome and transcriptome of tobacco leaf during senescencing process ［D］. Kunming： Yunnan Agricultural University， 2014. （in Chinese）

［12］ 張樹堂. 紅花大金元品種品質(zhì)特征. 湖南農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版）， 2007， 33（2）： 170-173. ZHANG S T. Explore the feature of quality of Honghuadajinyuan variety. Journal of Hunan Agricultural University（Natural Sciences），2007， 33（2）： 170-173. （in Chinese）

［13］ 汪健， 楊云高， 王松峰， 俞世康， 孫福山， 王愛華， 程浩， 王林. 烤煙紅花大金元上部葉采收方式研究. 中國煙草科學， 2010， 31（2）：15-19. WANG J， YANG Y G， WANG S F， YU S K， SUN F S， WANG A H，CHENG H， WANG L. Harvest method of upper leaves of flue-cured tobacco variety Honghuadajinyuan. Chinese Tobacco Science， 2010，31（2）： 15-19. （in Chinese）

［14］ 王戈， 楊煥文， 趙正雄， 李佛琳， 易建華. 煙草品種防御酶活性對黑脛病菌響應(yīng)差異. 云南農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學）， 2012， 27（3）：321-326. WANG G， YANG H W， ZHAO Z X， LI F L， YI J H. Response difference of the defence enzymes of flue-cured cultivars to Phytophora parasitica var. nicotiana. Journal of Yunnan Agricultural University （Natural Sciences）， 2012， 27（3）： 321-326. （in Chinese）

［15］ 梁元存， 劉延榮， 王玉軍， 王智發(fā)， 張廣民. 煙草黑脛病菌致病性分化和煙草品種的抗病性差異. 植物保護學報， 2003， 30（2）：143-147. LIANG Y C， LIU Y R， WANG Y J， WANG Z F， ZHANG G M. Pathogenicity differentiation of Phytophthora parasitica and the disease resisitance differnence of tobacco against black shank. Acta Phytophylacica Sinica， 2003， 30（2）： 143-147. （in Chinese）

［16］ 李永平， 王穎寬， 馬文廣， 譚彩蘭. 烤煙新品種云煙87的選育及特征特性. 中國煙草科學， 2001（4）： 38-42. LI Y P， WANG Y K， MA W G， TAN C L. Breeding and selecting of a new flue-cured tobacco variety Yunyan87 and its characteristics，Chinese Tobacco Science， 2001（4）： 38-42. （in Chinese）

［17］ 林世峰， 張拓， 史躍偉， 王東茂， 王志紅， 楊志曉， 謝升東， 魏開華，任學良. 煙草根系蛋白質(zhì)雙向電泳樣品制備方法的比較. 貴州農(nóng)業(yè)科學， 2012， 40（8）： 71-74. LIN S F， ZHANG T， SHI Y W， WANG D M， WANG Z H， YANG Z X，XIE S D， WEI K H， REN X L. Comparison of protein extraction methods for two-dimensional electrophoresis in tobacco root. Guizhou Agricultural Sciences， 2012， 40（8）： 71-74. （in Chinese）

［18］ ISAACSON T， DAMASCENO C M， SARAVANAN R S， HE Y H，CATALá C， SALADIé M， ROSE J K. Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues. Nature Protocols，2006， 1（2）： 769-774.

［19］ BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry， 1976， 72（1/2）： 248-254.

［20］ 李洪榮， 陳美元， 廖劍華， 蔡志欣， 郭仲杰， 王澤生. 雙孢蘑菇子實體采后后熟的差異蛋白質(zhì)組學分析. 福建輕紡， 2014（1）： 38-42. LI H R， CHEN M Y， LIAO J H， CAI Z X， GUO Z J， WANG Z S. Differencial proteomic analysis of postharvest ripening of the fruiting body of agaricus bisporus. Fujian Qing Fang， 2014（1）： 38-42. （in Chinese）

［21］ 黃瑞， 鄭珩. 偏頭痛相關(guān)酶和KEGG通路分析. 生物信息學， 2014，12（3）： 218-226. HUANG R， ZHENG H. Migraine associated enzymes and KEGG pathway analysis. China Journal of Bioinformatics， 2014， 12（3）：218-226. （in Chinese）

［22］ 劉靖宇， 江玉姬， 謝寶貴， 陳炳智， 廖偉， 鄧優(yōu)錦. iTRAQ結(jié)合2D LC-MS/MS技術(shù)在草菇不同生長發(fā)育時期蛋白質(zhì)組分析中的應(yīng)用.微生物學通報， 2012， 39（6）： 853-864. LIU J Y， JIANG Y J， XIE B G， CHEN B Z， LIAO W， DENG Y J. Comparative analysis of proteomic profile at different development stages of Volvariella volvacea by iTRAQ-coupled 2D LC-MSMS. Microbiology， 2012， 39（6）： 853-864. （in Chinese）

［23］ XIE H， YANG D H， YAO H， BAI G， ZHANG Y H， XIAO B G. iTRAQ-based quantitative proteomic analysis reveals proteomic changes in leaves of cultivated tobacco （Nicotiana tabacum） in response to drought stress. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2016， 469（3）： 768-775.

［24］ 李亞培， 楊鐵釗， 申培林， 尚曉潁. 煙草黃酮類物質(zhì)及其與品質(zhì)的關(guān)系. 浙江農(nóng)業(yè)科學， 2010（6）： 1391-1396. LI Y P， YANG T Z， SHEN P L， SHANG X Y. Flavonoids in tobacco and its relationship with the quality of tobacco. Journal of Zhejiang Agricultural Sciences， 2010（6）： 1391-1396. （in Chinese）

［25］ 李勇， 林茜， 逄濤， 師君麗. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定量分析煙葉中的12種類黃酮物質(zhì). 色譜， 2015， 33（7）： 746-752. LI Y， LIN Q， PANG T， SHI J L. Determination of 12 flavonoids in tobacco leaves using ultra-high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry. Chinese Journal of Chromatography， 2015，33（7）： 746-752. （in Chinese）

［26］ 鄧小華， 覃勇， 周米良， 田峰， 田茂成， 張黎明， 楊麗麗. 湘西煙葉香氣特性及其區(qū)域分布特征. 北京農(nóng)學院學報， 2013， 28（4）： 16-21. DENG X H， QIN Y， ZHOU M L， TIAN F， TIAN M C， ZHANG L M，YANG L L. Aroma characteristics of tobacco leaves from Xiangxi areas and their regional distribution characteristics. Journal of Beijing University of Agriculture， 2013， 28（4）： 16-21. （in Chinese）

［27］ 鄒鳳蓮， 壽森炎， 葉紈芝， 盧鋼. 類黃酮化合物在植物脅迫反應(yīng)中作用的研究進展. 細胞生物學雜志， 2004， 26（1）： 39-44. ZOU F L， SHOU S Y， YE W Z， LU G. Advances in the research on flavonoid biosynthesis and plant stress response. Chinese Journal of Cell Biology， 2004， 26（1）： 39-44. （in Chinese）

［28］ 喬小燕， 馬春雷， 陳亮. 植物類黃酮生物合成途徑及重要基因的調(diào)控. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 2009， 21（2）： 354-360. QIAO X Y， MA C L， CHEN L. Plant flavonoid biosynthesis pathway and regulation of its important genes. Natural Product Research and Development， 2009， 21（2）： 354-360. （in Chinese）

［29］ 閆慧芳， 毛培勝， 夏方山. 植物抗氧化劑谷胱甘肽研究進展. 草地學報， 2013， 21（3）： 428-434. YAN H F， MAO P S， XIA F S. Research progress in plant antioxidant glutathione. Acta Agrestia Sinica， 2013， 21（3）： 428-434. （in Chinese）

［30］ GILL S S， ANJUM N A， HASANUZZAMAN M， GILL R， TRIVEDI D K， AHMAD I， PEREIRA E， TUTEJA N. Glutathione and glutathione reductase： A boon in disguise for plant abiotic stress defense operations. Plant Physiology and Biochemistry， 2013， 70：204-212.

［31］ 胡文琴， 王恬， 孟慶利. 抗氧化活性肽的研究進展. 中國油脂，2004， 29（5）： 42-45. HU W Q， WANG T， MENG Q L. Research advance of antioxidative bioactive peptides. China Oils and Fats， 2004， 29（5）： 42-45. （in Chinese）

［32］ MAHER P. The effects of stress and aging on glutathione metabolism. Ageing Research Reviews， 2005， 4（2）： 288-314.

［33］ ZENG F R， QIU B Y， WU X J， NIU S Z， WU F B， ZHANG G P. Glutathione-mediated alleviation of chromium toxicity in rice plants. Biological Trace Element Research， 2012， 148（2）： 255-263.

［34］ VERNOUX T， WILSON R C， SEELEY K A， REICHHELD J P，MUROY S， BROWN S， MAUGHAN S C， COBBETT C S，MONTAGU M V， INZE D， MAY M J， SUNG Z R. The ROOT MERISTEMLESS1/CADMIUM SENSITIVE2 gene defines a glutathione dependent pathway involved in initiation and maintenance of cell division during postembryonic root development. The Plant Cell， 2000， 12： 97-110.

［35］ CAIRNS N G， PASTERNAK M， WACHTER A， COBBETT C S，MEYER A J. Maturation of Arabidopsis seeds is dependent on glutathione biosynthesis within the embryo. Plant Physiology， 2006，141： 446-455.

［36］ FRENDO P， BALDACCI-CRESP F， BENYAMINA S M， PUPPO A. Glutathione and plant response to the biotic environment. Free Radical Biology and Medicine， 2013， 65： 724-730.

［37］ 李志剛， 許自成， 蘇永士， 陳彥春， 胡皓月， 張蕊， 杜娟. 植物谷胱甘肽研究進展. 江西農(nóng)業(yè)學報， 2010， 22（4）： 118-121. LI Z G， XU Z C， SU Y S， CHEN Y C， HU H Y， ZHANG R， DU J. Research progress in plant glutathione. Acta Agriculturae Jiangxi，2010， 22（4）： 118-121. （in Chinese）

［38］ BRIGELIUS-FLOHé R， MAIORINO M. Glutathione peroxidases. Biochimica et Biophysica Acta （BBA）-General Subjects， 2013，1830（5）： 3289-3303.

［39］ 李偉濤， 朱偉杰， 潘善培. 磷脂過氧化氫物谷胱甘肽過氧化物酶與精子成熟. 中華男科學， 2001， 7（2）： 109-112. LI W T， ZHU W J， PAN S P. Advances in phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase and sperm maturation. National Journal of Andrology， 2001， 7（2）： 109-112. （in Chinese）

［40］ 宋長芹， 繆海飛， 朱斌， 佟少明， 李澤昀， 侯和勝. 植物谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶在植物修復(fù)中的作用. 安徽農(nóng)學通報， 2010， 16（7）： 56. SONG C Q， MIAO H F， ZHU B， TONG S M， LI Z Y， HOU H S. The role of Glutathione-S-transferase in phytoremediation of plants. Anhui Agricultural Science Bulletin， 2010， 16（7）： 56. （in Chinese）

［41］ 陳秀華， 王臻昱， 李先平， 朱延明， 劉麗， 陳威， 陳勤. 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的研究進展. 東北農(nóng)業(yè)大學學報， 2013， 44（1）： 149-153. CHEN X H， WANG Z Y， LI X P， ZHU Y M， LIU L， CHEN W， CHEN Q. Research progress on glutathione S-transferases. Journal of Northeast Agricultural University， 2013， 44（1）： 149-153. （in Chinese）

［42］ 張巖， 胡軍， 郭長虹， 徐香玲， 李集臨， 胡贊民. 植物谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的分子生物學研究進展. 哈爾濱師范大學自然科學學報，2007， 23（4）： 76-79. ZHANG Y， HU J， GUO C H， XU X L， LI J L， HU Z M. The molecular biology research of glutathione-S-tranferases （GSTs） in plants. Natural Sciences Journal of Harbin Normal University， 2007，23（4）： 76-79. （in Chinese）

［43］ EDWARDS R， DIXON D P， WALBOT V. Plant glutathione S-transferases： Enzymes with multiple functions in sickness and in health. Trends in Plant Science， 2000， 5（5）： 193-198.

［44］ 解芬， 馬原， 胡瓊， 王鐸， 楊麗菊. 烤煙品種紅花大金元在小哨地區(qū)的推廣試驗研究. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技， 2014（20）： 53-55. JIE F， MA Y， HU Q， WANG D， YANG L J. Promotion test of flue-cured tobacco varieties of Hongda in the Xiaoshao. Modern Agricultural Science and Technology， 2014（20）： 53-55. （in Chinese）

［45］ 曹仕明， 李進平， 劉圣高， 陳振國， 許汝冰， 畢慶文， 許樹銀， 范敬修， 王學龍， 郭力， 汪明. 7個引進烤煙品種在環(huán)神農(nóng)架地區(qū)的生態(tài)適應(yīng)性. 貴州農(nóng)業(yè)科學， 2012， 40（7）： 60-65. CAO S M， LI J P， LIU S G， CHEN Z G， XU R B， BI Q W， XU S Y，F(xiàn)AN J X， WANG X L， GUO L， WANG M. Ecological adaptability of seven introduced flue-cured tobacco cultivars around Shennongjia region. Guizhou Agricultural Sciences， 2012， 40（7）： 60-65. （in Chinese）

［46］ 陳曉燕， 劉燕， 付修廷， 李崇祿， 易克， 趙正雄， 楊虹琦. 云南昭通植煙區(qū)烤煙品種生態(tài)適應(yīng)性研究. 湖南農(nóng)業(yè)科學， 2012（17）： 22-25. CHEN X Y， LIU Y， FU X T， LI C L， YI K， ZHAO Z X， YANG H Q. Ecological adaptability of flue-cured tobacco varieties in Zhaotong tobacco-planting area in Yunnan province. Hunan Agricultural Sciences， 2012（17）： 22-25. （in Chinese）

［47］ 張文平， 汪代斌， 曾超寧， 張帥. 不同煙草品種對煙草赤星病的抗性比較. 安徽農(nóng)業(yè)科學， 2014， 42（35）： 12513-12515. ZHANG W P， WANG D B， ZENG C N， ZHANG S. Comparison on resistance of different tobacco varieties against tobacco brown spot. Journal of Anhui Agricultural Science， 2014， 42（35）： 12513-12515. （in Chinese）

［48］ DENISOV I G， FRANK D J， SLIGAR S G. Cooperative properties of cytochromes P450. Pharmacology & Therapeutics， 2009， 124（2）：151-167.

［49］ ZHAO Y J， CHENG Q Q， SU P， CHEN X， WANG X J， GAO W，HUANG L Q. Research progress relating to the role of cytochrome P450 in the biosynthesis of terpenoids in medicinal plants. Applied Microbiology and Biotechnology， 2014， 98（6）： 2371-2383.

［50］ 解敏敏， 龔達平， 李鳳霞， 劉貫山， 孫玉合. 煙草細胞色素P450的基因組學分析. 遺傳， 2013， 35（3）： 379-387. XIE M M， GONG D P， LI F X， LIU G S， SUN Y H. Genome-wide analysis of cytochrome P450 monooxygenase genes in the tobacco. Hereditas， 2013， 35（3）： 379-387. （in Chinese）

［51］ 王轉(zhuǎn)花， 楊斌， 張政. 植物蛋白酶抑制劑抗蟲基因工程研究進展.植物保護學報， 2001， 28（1）： 83-88. WANG Z H， YANG B， ZHANG Z. Recent progress in the genetic engineering of plant proteinase inhibitor anti-insect pests. Acta Phytophylacica Sinica， 2001， 28（1）： 83-88. （in Chinese）

［52］ JULIA A C， MARILYN A A， DENNIS J B， MALCOLM W，HIGGINS T J V. Transgenic tobacco and peas expressing a proteinase inhibitor from Nicotiana alata have increased insect resistance. Molecular Breeding， 1999， 5： 357-365.

［53］ TAMAYO M C， RUFAT M， BRAVO J M， SEGUNDO B S. Accumulation of a maize proteinase inhibitor in response to wounding and insect feeding， and characterization of its activity toward digestive proteinases of Spodoptera littoralis larvae. Planta， 2000， 211（1）：62-71.

［54］ 孫興華， 周曉榕， 龐保平， 孟慶玖. 南美斑潛蠅為害對黃瓜葉片中蛋白酶抑制劑活性及葫蘆素 B含量的影響. 應(yīng)用昆蟲學報， 2014，51（1）： 169-177. SUN X H， ZHOU X R， PANG B P， MENG Q J. Effects of Liriomyza huidobrensis （Blanchard） larval infestation on trypsin and chymotrypsin activity and cucurbitacin B content in cucumber leaves. Chinese Journal of Applied Entomology， 2014， 51（1）： 169-177. （in Chinese）

［55］ HILDER V A， GATEHOUSE A M R， SHEERMAN S E， BARKER R F， BOULTER D. A novel mechanism of insect resistance engineered into tobacco. Nature， 1987， 300： 160-163.

［56］ NIYOMPLOY P， SRISOMSAP C， CHOKCHAICHAMNANKIT D，VINAYAVEKHIN N， KARNCHANATAT A， SANGVANICH P. Superoxide dismutase isozyme detection using two-dimensional gel electrophoresis zymograms. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 2014， 90： 72-77.

［57］ CAMP W V， INZé D， MONTAGU M V. The regulation and function of tobacco superoxide dismutases. Free Radical Biology & Medicine，1997， 23（3）： 515-520.

［58］ NEGI N P， SHRIVASTAVA D C， SHARMA V， SARIN N B. Overexpression of CuZnSOD from Arachis hypogaea alleviates salinity and drought stress in tobacco. Plant Cell Reports， 2015， 34（7）：1109-1126.

［59］ 江彤， 楊建卿， 高明， 孔俊. 不同抗病性煙草罹黑脛病后幾種酶的活性及丙二醛含量的變化. 安徽農(nóng)業(yè)大學學報， 2006， 33（2）：218-221. JIANG T， YANG J Q， GAO M， KONG J. Changes of MDA content and activities of some enzymes in tobacco varieties with different disease resistance infected with Phytophthora nicotianae. Journal of Anhui Agricultural University， 2006， 33（2）： 218-221. （in Chinese）

［60］ 楊建卿， 許大鳳， 孔俊， 江彤. 不同煙草品種罹黑脛病后幾種酶活性的變化. 合肥工業(yè)大學學報（自然科學版）， 2005， 28（7）： 816-819. YANG J Q， XU D F， KONG J， JIANG T. Change of activities of some enzymes in different tobacco varieties infected with Phytophthora nicotianae. Journal of Hefei University of Technology （Natural Sciences）， 2005， 28（7）： 816-819. （in Chinese）

（責任編輯 李莉）

Differential Proteomic Research of Three Varieties of Tobacco in China

XU Ying， YAN Guo-quan， ZHANG Yang， YU Hong-xiu
（Institutes of Biomedical Sciences， Fudan University， Shanghai 200032）

【Objective】 In order to strengthen the basic scientific research and cultivation of tobacco， differential proteomics is used to select specific proteins and elucidate metabolic pathways in tobacco. 【Method】 Leaf proteins of three varieties of tobacco in China including Honghuadajinyuan， K326 and Yunyan 87 were extracted by phenol. After digestion the protein profiles of three varieties of tobacco were investigated by using tandem mass tag（TMT） coupled with two-dimensional liquid chromatography tandem mass spectrometry （2D LC-MS/MS）. The proteins and peptides from tobacco were identified with MASCOT search engine after spectra extraction in Proteome Discoverer Software. Then， bioinformatics analysis including data correlation analysis， hierarchicalcluster analysis and principal component analysis （PCA） were conducted. Meanwhile， proteins with change ratio of more than 2 fold were defined as differentially expressed tobacco proteins， and they were screened out by volcano plot analysis. Finally， the distribution and function of important proteins in tobacco were analyzed using KEGG pathway analysis. 【Result】 A total of 3 079 proteins in Honghuadajinyuan， K326 and Yunyan 87 were identified and the number of protein ID was 10 343. Protein expression profiles of hierarchical cluster analysis and principal component analysis indicated that K326 and Yunyan 87 were relatively similar，and Honghuadajinyuan was significantly different from the other two. The subsequent protein screening also verified the results. Screening of differentially expressed proteins suggested that there were only 29 proteins differentially expressed between K326 and Yunyan 87. 13 proteins of them covered 8 metabolic pathways including flavonoids biosynthesis. Chalcone synthetase participating in the flavonoids synthesis was significantly higher in K326 than in Yunyan 87. Honghuadajinyuan and Yunyan 87 had 160 differentially expressed proteins. 103 proteins of them covered 42 metabolic pathways including glutathione metabolism. Three kinds of enzymes related to glutathione metabolic pathway including glutathione peroxidase， phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase and glutathione S-transferase were significantly lower in Honghuadajinyuan than in Yunyan 87. Honghuadajinyuan and K326 had 119 differentially expressed proteins. 89 proteins of them covered metabolic pathways such as metabolism of xenobiotics by cytochrome P450. It was indicated that several proteins related to stress resistance such as proteinase inhibitor was much less in Yunyan 87 than in K326 and Honghuadajinyuan， and superoxide dismutase in Honghuadajinyuan was the lowest among the three varieties of tobacco. 【Conclusion】Results of the study revealed that the TMT coupled with 2D LC-MS/MS is a powerful method for isolating and identifying differentially expressed proteins in various tobacco varieties. Most of them are involved in photosynthesis，metabolism or stress resistance.

tobacco； differential proteomics； tandem mass tag； 2D LC-MS/MS

2016-03-14；接受日期：2016-05-20

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（“973”計劃）（2012AA020201）、煙草化學安徽省重點實驗室開放課題（0920140109008）聯(lián)系方式：徐瑩，E-mail：14211510001@fudan.edu.cn。通信作者余紅秀，E-mail：hongxiuyu@fudan.edu.cn