于　沖，王金英，潘　鈺，原　韜，夏海華

ResearchandDevelopment研究與開發(fā)

銅綠假單胞菌抗藥表型研究進(jìn)展

于沖，王金英，潘鈺，原韜，夏海華

（黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010）

銅綠假單胞菌因其對多種抗生素呈現(xiàn)耐藥性而使其成為臨床治療最棘手的問題。目前經(jīng)研究確定的銅綠假單胞菌最重要的耐藥機(jī)制有：水解酶的產(chǎn)生、膜通透性降低、外膜蛋白表達(dá)下降、外排泵系統(tǒng)、拓?fù)洚悩?gòu)酶突變。這些機(jī)制經(jīng)常共同作用并導(dǎo)致多重耐藥株的產(chǎn)生。最常見的耐藥機(jī)制是β-內(nèi)酰胺酶的生成(超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、Am pC、carbapenem ases)，它能夠決定各種β-內(nèi)酰胺酶抵抗的變種表型，這些表型與氨基糖苷類和喹諾酮類抗生素的耐藥相關(guān)。膜通透性降低和青霉素結(jié)合蛋白的修飾等其他抗藥機(jī)制相關(guān)。目前檢測這些耐藥機(jī)制表型的常用方法包括K-B紙片法、"cutoff"值評(píng)價(jià)（美國臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)藥敏實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)）。

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶；頭孢菌素酶；碳青霉烯；基因型耐藥；表型耐藥

銅綠假單胞菌屬于革蘭氏陰性肝菌，其內(nèi)在性耐藥水平較高，由于該菌的膜通透性較差，并且外膜蛋白表達(dá)減少等原因而難于治療［1］。臨床上，健康人體內(nèi)感染發(fā)生的幾率很小，而在一些特定條件下，住院病人銅綠假單胞菌感染率較高，尤其在氣管、支氣管炎、囊性肺纖維化等疾病中,銅綠假單胞菌已經(jīng)成為一種重要的致病菌，在病人體內(nèi)的繁殖速度也很快。

多重藥物耐藥性在院內(nèi)細(xì)菌、健康輔助細(xì)菌和社區(qū)細(xì)菌中迅速增長蔓延。天然具有耐藥性的菌株稱為野生型，可以作為考察抗生素抗菌廣譜性的參考菌株，其耐藥基因天然存在于基因組中。敏感群中經(jīng)常產(chǎn)生獲得性耐藥菌株，其變化頻率很高，受外來基因影響較大，如質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子。了解耐藥表型對于合理選擇的抗生素進(jìn)行治療極為重要［2-3］。

1　抗β-內(nèi)酰胺酶銅綠假單胞菌表型

主要的機(jī)制有：外膜通透性、外排泵系統(tǒng)、水解酶的產(chǎn)生或靶向修飾。這些因素通常共同作用，難于區(qū)分表型。

1.1天然耐藥

天然耐藥與頭孢菌素酶的產(chǎn)生有關(guān)，這種酶由氨基青霉素和第一代頭孢菌素誘導(dǎo)產(chǎn)生，通透性的變化和外排系統(tǒng)可以使這種酶的產(chǎn)量成倍增加。其表型表現(xiàn)為氨基青霉素耐藥，對β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、對一代及二代頭孢菌素的使用影響較大。替卡西林、羧芐青霉素）、酰脲類青霉素(哌拉西林、美洛西林)、第三及第四代頭孢菌素類、碳青霉烯類和單酰胺類抗生素仍然敏感。

1.2獲得性耐藥

與酶聯(lián)機(jī)制(青霉素酶、頭孢菌素酶、廣譜β-內(nèi)酰胺酶、金屬β-內(nèi)酰胺酶)或非酶促機(jī)制(通透性，外排和靶向修飾)相關(guān)。

酶獲得性耐藥與β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生相關(guān)，它是β-內(nèi)酰胺的主要耐藥機(jī)制，根據(jù)氨基酸序列可以將其分為四個(gè)亞類(Ambler分類系統(tǒng))。A、C和D類通過基于絲氨酸的機(jī)制發(fā)揮作用，而B類需要鋅才能發(fā)揮作用。其中最重要的β-內(nèi)酰胺酶包括：青霉素酶、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、頭孢菌素酶和碳青霉烯酶。

第一，青霉素酶。對羧基青霉素、酰脲類青霉素和頭孢哌酮具有耐藥性，并且對頭孢他啶、頭孢吡肟、亞胺培南和β-內(nèi)酰胺酶抑制劑敏感。

第二，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)。能夠水解廣譜頭孢菌素類(頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢曲松)和單酰胺類(氨曲南)，但不受β-內(nèi)酰胺酶和碳青霉烯酶抑制劑的影響。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶本身不具有水解第二代頭孢菌素的能力，但在與羥氨芐青霉素耦聯(lián)后能夠?qū)⑵渌?。最重要的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶包括TEM、SHV、PER，、VEB(A類)，它們對亞胺培南、羧基青霉素類+β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、脲基類青霉素+β-內(nèi)酰胺酶抑制劑敏感。2000年以前，與臨床交叉感染相關(guān)的主要超廣譜β-內(nèi)酰胺酶為TEM和SHV，2000年以后，CTX-M(頭孢噻肟酶)成為主要的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶并且廣泛傳播［4-5］。

第三，AmpCβ-內(nèi)酰胺酶(C類)?？煞譃榻M成型和可誘導(dǎo)型，通過染色體和質(zhì)粒介導(dǎo)傳播。AmpCβ-內(nèi)酰胺酶受氨曲南抑制，對克拉維酸、他唑巴坦和舒巴坦敏感。第二代頭孢菌素可以被其水解，但第四代頭孢菌素不能被其水解［6］。

第四，碳青霉烯酶。過度使用碳青霉烯類藥物（超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的傳播）導(dǎo)致碳青霉烯酶的產(chǎn)生。

A類：NMC(非金屬酶碳青霉烯酶)，能夠水解亞胺培南，但是不被EDTA抑制。它們的代表物為質(zhì)粒碳青霉烯酶：KPC(Klebsiella pneumonia carbapenemase)，GES (Guyana extended spectrum 1-12)。它們的底物以青霉素、頭孢菌素類、碳青霉烯類為代表。此類酶不受EDTA的抑制，并且不能水解氨曲南、哌拉西林或哌拉西林/三唑巴坦［7-8］。

B類：金屬β-內(nèi)酰胺酶，IMC（亞胺培南碳青霉烯酶），VIM（整合子編碼金屬β-內(nèi)酰胺酶），NDM（新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶），能夠水解任何一代碳青霉烯類和頭孢菌素類抗生素，但不能水解氨曲南。VIM往往存在于銅綠假單胞菌株，并在全球范圍內(nèi)迅速蔓延［9-10］。

C類：CMY，2006年曾報(bào)道一株極具攻擊性的產(chǎn)氣腸桿菌，它通過質(zhì)粒途徑傳播至另一種革蘭氏陰性細(xì)菌中。

D類：OXA-苯唑西林酶(OXA-2，OXA-10)，僅對亞胺培南敏感，這類酶的存在導(dǎo)致巨大的治療難度。

2010年，Nimish Patel等發(fā)表在 48屆 Annual Reunion of IDSA(2010)的一項(xiàng)研究顯示，用環(huán)丙沙星治療銅綠假單胞菌感染，能夠降低銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥性。由于環(huán)丙沙星使用的減少和環(huán)丙沙星活性的逐步降低，誘導(dǎo)了細(xì)菌外排泵的高表達(dá)，而被誘導(dǎo)的外排泵又與亞胺培南的耐藥性相關(guān)。因此建議減少環(huán)丙沙星的使用，從而能夠控制醫(yī)院內(nèi)因銅綠假單胞菌對碳雜青霉烯類的耐藥性而產(chǎn)生的交叉感染。

1.3非酶促獲得性耐藥機(jī)制

外排泵，包括以下三種機(jī)制：第一，MexA-MexBOprM(膜蛋白誘導(dǎo)的天然外排泵系統(tǒng)的表達(dá))，耐羧基青霉素類和氨曲南。第二，MexC-MexD-OprJ，耐頭孢吡肟和頭孢匹羅。第三，MexE-MexF-OprN(機(jī)制上常與D2孔減少相關(guān))，耐亞胺培南。

膜孔減少，對碳青霉烯類的多變耐藥。

青霉素結(jié)合蛋白(PBP)修飾：PBP2或PBP4對亞胺培南耐藥。PBP3對所有的β-內(nèi)酰胺耐藥，而對亞胺培南敏感［11-13］。

2　銅綠假單胞菌氨基糖苷類耐藥表型

野生型對所有的氨基糖苷類均敏感，獲得性耐藥是通過多種機(jī)制產(chǎn)生的：通透性、外排、酶失活、呼吸突變或這些機(jī)制不同組合的共同作用。對銅綠假單胞菌來說，通透性通常是引起氨基糖苷耐藥性的主要機(jī)制，酶也是引發(fā)耐藥性的常見機(jī)制之一，主導(dǎo)這類耐藥性的三種酶分別是：氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH），氨基糖苷核苷酸基轉(zhuǎn)移酶（ANT）和氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶（AAC）［11，14］。

銅綠假單胞菌耐藥表型如下:

表1　銅綠假單胞菌對β-內(nèi)酰胺藥物耐藥表型Fig.1 Betalactam ase drug-resistant phenotype o f pseudomonas aeruginosa

G:對慶大霉素耐藥;對妥布霉素、奈替米星、阿米卡星、異帕米星敏感。

GNt:對慶大霉素、奈替米星耐藥，對妥布霉素、阿米卡星、異帕米星敏感。

GT:對慶大霉素、妥布霉素耐藥，對奈替米星、阿米卡星、異帕米星敏感。

GNtT:對慶大霉素、妥布霉素、奈替米星耐藥，對阿米卡星、異帕米星敏感。

TNtA:對妥布霉素、奈替米星、阿米卡星耐藥，對慶大霉素、異帕米星敏感。

GTNtA:對慶大霉素、妥布霉素、奈替米星、阿米卡星耐藥，對異帕米星敏感。

評(píng)估與監(jiān)督個(gè)人在外語學(xué)習(xí)效率的能力是學(xué)習(xí)的一個(gè)重要的技能，對外語學(xué)習(xí)成為自主學(xué)習(xí)來說尤為重要，可以幫助讓學(xué)習(xí)者發(fā)現(xiàn)自己的問題并且找到適合自己學(xué)習(xí)的方式[5]。在自主學(xué)習(xí)過程中，評(píng)估具有回顧和預(yù)期的功能，它可以讓學(xué)習(xí)者對過去的學(xué)習(xí)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行反思，并轉(zhuǎn)化成對未來學(xué)習(xí)行為的計(jì)劃。此外，除了自我評(píng)估之外，學(xué)生評(píng)價(jià)也必不可少。它可以減輕教師評(píng)價(jià)學(xué)生的繁重的負(fù)擔(dān)，尤其是當(dāng)班級(jí)學(xué)生比較多的時(shí)候，教師不能始終對每一個(gè)學(xué)生的表現(xiàn)進(jìn)行評(píng)估，可以起到很好的補(bǔ)充和輔助作用。

通透性表型：對慶大霉素、妥布霉素、奈替米星、阿米卡星、異帕米星耐藥。

3　銅綠假單胞菌喹諾酮類耐藥表型

在體外其野生型表型對諾氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星敏感，而實(shí)際應(yīng)用中只對環(huán)丙沙星敏感。獲得性耐藥通過多種不同機(jī)制產(chǎn)生，通透性：膜孔和LPS（對于喹諾酮類，膜孔是其通過外膜的主要途徑）。靶向親和修飾：DNA旋轉(zhuǎn)酶亞基A和B以及DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶亞基C和D。

主動(dòng)外排：OprM、OrpJ、OprN(低耐藥)。

銅綠假單胞菌耐藥性表型如下：

I(野生型表型)：對諾氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星/左氧氟沙星敏感。

II：對環(huán)丙沙星敏感，對諾氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星/左氧氟沙星中度敏感。

III：對環(huán)丙沙星敏感，對諾氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星/左氧氟沙星耐藥。

IV：對環(huán)丙沙星、諾氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星/左氧氟沙星耐藥。

外排表型：對諾氟沙星、環(huán)丙沙星耐藥，對培氟沙星、氧氟沙星/左氧氟沙星敏感。

4　其他耐藥表型

銅綠假單胞菌原本對復(fù)方新諾明和呋喃妥因耐藥，其主要原因是對靶點(diǎn)酶結(jié)合效率降低。銅綠假單胞菌對黏菌素耐藥性很差，所以一些學(xué)者認(rèn)為使用碳青霉烯類藥物作為一線抗菌治療已經(jīng)不再有效。這些學(xué)者提出抗銅綠假單胞菌感染的最有效療法是將黏菌素與其他活性抗生素聯(lián)合使用，可以有效防止黏菌素耐藥株的產(chǎn)生［15］。

5　ESBLs檢測方法

對于ESBLs的檢測，目前常采用K-B紙片法或E-test法，其檢測標(biāo)準(zhǔn)參照CLSI藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

篩選實(shí)驗(yàn)：頭孢菌素和單酰胺菌素的平板檢測。頭孢曲松＜25mm，頭孢噻肟＜27mm，頭孢他啶＜22mm，頭孢泊肟＜17mm，氨曲南＜27mm。

確認(rèn)實(shí)驗(yàn)：頭孢菌素/克拉維酸協(xié)同作用結(jié)果。

5.1雙紙片法

將含有阿莫西林+克拉維酸（20μg+10μg）的紙片貼于M-H平板中心，距中心20～35mm處貼頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢泊肟及氨曲南，任意一種紙片與頭孢菌素/克拉維酸出現(xiàn)協(xié)同作用即為ESBL陽性。

圖1　雙紙片法Fig.1　Double discmethod

5.2組合紙片法

比較頭孢菌素紙片和頭孢菌素+克拉維酸紙片抑菌圈直徑大?。^孢噻肟或頭孢他啶30μg）。如果細(xì)菌產(chǎn)生ESBL，含克拉維酸紙片的抑菌圈至少大于其他紙片抑菌圈5mm。

圖2　組合紙片法Fig.2 Com bined discmethod

5.3E-test法

使用兩端分別含有頭孢他啶/頭孢噻肟、頭孢他啶/頭孢噻肟+克拉維酸的藥敏試條檢測。

圖3　E-testFig.3 E-test.

6　結(jié)論

銅綠假單胞菌是一種常見的耐藥性最強(qiáng)的細(xì)菌之一，因此了解其抗性表型對于臨床醫(yī)生應(yīng)用于靶向治療和成功分辨感染類型具有重要意義。微生物實(shí)驗(yàn)室在發(fā)現(xiàn)細(xì)菌多重耐藥性機(jī)制方面發(fā)揮著重要的作用，因此實(shí)驗(yàn)室與臨床醫(yī)生緊密聯(lián)系，對于病人、臨床醫(yī)生以及微生物研究人員都是非常重要的。

［1］ Barlow G，NathwaniD-Is Antibiotic Resistance a Problem.A Practical Guide for Hospital Clinicians［J］.Postgraduate Medical Journal，April2005，（81）:680-692.

［2］ CDC.definitions for nosocomial infections.National Nosocomial Inflections Surveillance System(NNISS［)S］.2004.

［3］ Carmeli Y，Triollet N，Elopoulos GM，Samore MH-Emergence of antibiotic resistant Pseudomonas aeruginosa:comparison of risks associted with different antipseudomonadalagent［sJ］.Amtimicrob.AgentsChemother，1999，43(6):1379-1382.

［4］ FalagasME，KarageorgopoulosDE.Extended-spectrumbeta-lactamase-prodbetalactamase-producingorganisms［J］.Journal of Hospital infection 2009，（73）: 345-354.

［5］ Drieux L，Brossier F，SougakoffW，Jarlier V.Phenotypic detection of extended spectrum beta-lactamaseproduction in Enterobacteriaceae:review and bench guide［J］.Clinmicrobioland Infect2008，（14）：90-103.

［6］ Poirel L，Ronco E，Naas T，Nordmann P.Extended-spectrumβ-lactamase TEM-4 in Pseudomonasaeruginosa［J］.Clin Microbiol Infect1999，（5）：651-652.

［7］ Carmeli Y.-The Role of Carbapenems:The Predictive Factors for Multi-Drug Resistant Gram-Negatives[EB/OL]，http://www.invanz.co.il,2006-06-12/2016-03-03.

［8］ Studemeister AE，Quinn JP.Selective imipenem resistance in Pseudomonas aeruginosa associatedwithdiminishedouter membrane permeability［J］. Antimicrob AgentsChemother，1988，(32):1267-1268.

［9］ Pic ?o RC，Andrade SS，Nicoletti AG，et al.Metallo-β-lactamase detection: comparative evaluation of double-disk synergy versuscombined disk tests for IMP，GIM，SIM，SPM，or VIM producing organisms［J］.Clin Microbiol 2008，（46）：2028-2037.

［10］Walsh TR，Weekers J，Livermore DM，Toleman MH."Dissemination of NDM-1-positive bacteria in the New Delhi environment and its implications for human health:an enveronmental point prevalence study"［J］.Lancet Infect.Dis. 2011，（11）：355-362.

［11］Francois Jehl，Monique Chomarat，Michele Weber，et al.Antibioticele: clasificare，spectru simecanisme de actiune［J］.De la antibiograma la prescriptie. 2003：12-30.

［12］Nobuhisa Masuda，Eiko Sakagawa，SatoshiOhya etal.Substrate Specificities of MexAB-OprM，MexCD-OprJ，and MexXY-OprM Efflux Pumps in Pseudomonas aeruginosa［J］.Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2000，44（2）:3322-3327.

［13］Poole K，N.Gotoh，H.Tsujimoto，etal.Overexpression of themexC-mexD-oprJ efflux operon in nfxB-typemultidrug-resistant strains of Pseudomonas aeruginosa［J］.MolMicrobiol1996，（21）:713-724.

［14］Poole K.Aminoglycoside resistance in Pseudomonas aeruginosa［J］.Antimicrob AgentsChemother2005，（49）:479-487.

［15］Levin AS，Barone AA，Penco J，etal.IntravenousColistin as Therpy forNosocomial Infections Caused by Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosaand Acinetob acter baumannii［J］.Clinical InfectionsDeseases.1999，28，（5）：1008-1011.

Research progress in drug-resistant phenotype of pseudo monas aeruginosa

YUChong,WANG Jin-ying,PAN Yu,YUAN Tao,XIA Hai-hua
(InstituteofMicrobiology,Heilongjiang Academy ofSciences,Harbin 150010,China)

Pseudomonas aeruginosa genus bacteria are well known for their increased drug resistance(phenotypic anggenotypic resistance).Themost important resistancemechanisms are:enzyme production,reduction of pore expression, reduction of the externalmembrane proteins expression,efflux systems,topoisomerasemutations.Thesemechanisms often accumulate and lead tomultidrug ressitance strains emergence.Themost frequent acquired resistancemechanisms are betalactamas e-typeenzyme production(ESBLs,AmpC,carbapenemases),which determine variable phenotypesofbetalactamines resistance,phenotypes which are associated with aminoglycosides and quinolones resistance.The nonenzymatic drug resistance mechanisms are caused by efflux systems,pore reduction and penicillin-binding proteins(PBP) modification,which are often associate d to other resistance mechanisms.Phenotypic methods used for testing these mechanisms are based on highlighting these phenotypes using Kirby Bauer antibiogram,clinical breakpoints,and"cutoff" values recommended by CLSI(MS100-25)standard.

ESBLs;AmpC,Garbapenemase；Genotypic resistance;Phenotypic resistance

Q939.11

A

1674-8646（2016）04-0004-04

2016-01-08

黑龍江省科學(xué)院預(yù)研項(xiàng)目（YY13BYCV07）；黑龍江省科學(xué)院學(xué)部委員項(xiàng)目（XB15BYCV08）

于沖（1979-），男，河北樂亭人，副研究員，碩士，主要從事醫(yī)學(xué)微生物方面工作。

夏海華（1971-），女，遼寧清源人，研究員，碩士，主要從事醫(yī)學(xué)微生物方面工作。e-mail:328116773@qq.com