郭清蓮　何歡　潘凌立　劉義

（1武漢大學(xué)中南醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢430071；2武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，武漢430072；3鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院（湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院）急診科，湖北黃石435002）

BCBP 與牛血清白蛋白相互作用熱力學(xué)

郭清蓮1，*何歡2潘凌立3劉義2

（1武漢大學(xué)中南醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢430071；2武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，武漢430072；3鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院（湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院）急診科，湖北黃石435002）

塞來(lái)昔布衍生物是一類(lèi)應(yīng)用非常廣泛的治療急慢性炎癥的新型非甾體抗炎藥。本文綜合利用熒光光譜、紫外吸收光譜、圓二色譜和分子模擬等方法，研究了塞來(lái)昔布衍生物1-苯磺酰胺-3-羧基-5-苯基吡唑（BCBP）與牛血清白蛋白（BSA）相互作用的熱力學(xué)行為。熒光光譜和紫外吸收光譜的分析表明：BCBP能有效猝滅BSA的內(nèi)源熒光，猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅。通過(guò)所獲取的相互作用熱力學(xué)參數(shù)，可知兩者之間的相互作用是一個(gè)吉布斯自由能降低的自發(fā)過(guò)程，且二者之間的主要作用力為氫鍵和范德華力。圓二色譜的分析發(fā)現(xiàn)BCBP引起B(yǎng)SA的構(gòu)象發(fā)生改變，其α-螺旋含量降低，無(wú)規(guī)卷曲含量升高。分子對(duì)接的結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

塞來(lái)昔布衍生物；牛血清白蛋白；相互作用；熱力學(xué)參數(shù)

1　引言

炎癥是機(jī)體對(duì)感染的一種防御機(jī)制，主要表現(xiàn)為紅腫、疼痛等1。疾病的產(chǎn)生往往伴隨著炎癥，抗炎藥則在治療疾病和恢復(fù)健康過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。選擇性環(huán)氧合酶2（COX-2）抑制劑是一類(lèi)應(yīng)用非常廣泛的治療急慢性炎癥的新型非甾體抗炎藥（NSAIDs），具有很好的抗炎活性和較小的胃腸道不良反應(yīng)2，3。塞來(lái)昔布是第一個(gè)上市的選擇性COX-2抑制劑，為1，5-二芳基-3-取代的吡唑衍生物，能夠有效地治療各種急性疼痛和各種關(guān)節(jié)炎伴發(fā)的慢性疼痛4，5。

盡管傳統(tǒng)的非甾體抗炎藥具有良好的抗炎活性，臨床研究表明塞來(lái)昔布等選擇性COX-2抑制劑具有中風(fēng)和心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)5，6。發(fā)現(xiàn)新型的、毒副作用較低的COX-2抑制劑是當(dāng)今的研究熱點(diǎn)，而基于塞來(lái)昔布結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造是其中一種重要的途徑7，8。大量的構(gòu)效關(guān)系研究9－11顯示，吡唑類(lèi)化合物母核的1，3，5位取代對(duì)非甾體抗炎藥（NIAIDs）的選擇性非常關(guān)鍵，而4位取代將會(huì)使其對(duì)COX-2的選擇性下降。Abdellatif等7，11通過(guò)大鼠足跖腫脹法評(píng)估了塞來(lái)昔布衍生物的抗炎癥活性，發(fā)現(xiàn)C-3位羧基取代的塞來(lái)昔布系列衍生物具有良好的體內(nèi)抗炎癥活性，其中BCBP（1-苯磺酰胺-3-羧基-5-苯基吡唑，圖1）的口服給藥半數(shù)抑制劑量為104.4 mg?kg－1。Abdellatif等11進(jìn)一步將BCBP與NO釋放基團(tuán)通過(guò)共價(jià)鍵連接，發(fā)現(xiàn)其抗炎癥活性提高，心血管副作用降低。

血清白蛋白（SA）是血液中最豐富的載體蛋白，對(duì)于藥物在生物體內(nèi)的運(yùn)輸有著重要的生理作用，許多生物活性物質(zhì)，如代謝物、醫(yī)藥及其他有機(jī)物，與血清白蛋白的親和性，影響它們?cè)隗w內(nèi)的分布和新陳代謝12－14。研究血清蛋白與藥物的作用有助于了解藥物的體內(nèi)運(yùn)輸性質(zhì)，對(duì)藥物化學(xué)和藥物分子設(shè)計(jì)具有重要的意義15，16?？紤]到抗炎藥物的活性與重要的醫(yī)療價(jià)值，研究其與蛋白質(zhì)的相互作用，有助于在分子水平上認(rèn)識(shí)抗炎藥物與蛋白質(zhì)的作用機(jī)理和規(guī)律，為藥物分子的設(shè)計(jì)、修飾與篩選提供有益的啟發(fā)與指導(dǎo)。

目前，塞來(lái)昔布與生物大分子相互作用引起了較多研究人員的關(guān)注，但對(duì)于塞來(lái)昔布衍生物的相關(guān)報(bào)道較少。Masomeh等17通過(guò)多種光譜手段以及差示掃描量熱法，研究發(fā)現(xiàn)塞來(lái)昔布能夠有效的與人碳酸酐酶II結(jié)合并抑制其活性，這種結(jié)合對(duì)碳酸酐酶II結(jié)構(gòu)的影響不大，氫鍵和疏水作用對(duì)塞來(lái)昔布-碳酸酐酶II復(fù)合物的形成起關(guān)鍵作用。Neelam和Sonu18通過(guò)熒光光譜的手段，研究了塞來(lái)昔布與人血清白蛋白（HSA）的相互作用，結(jié)果表明塞來(lái)昔布結(jié)合在Site II位點(diǎn)，結(jié)合自由能為－27.92 kJ?mol－1。Pereira-Leite等19在模擬生理?xiàng)l件下（4-羥乙基哌嗪乙磺酸、醋酸鈉緩沖溶液，離子強(qiáng)度為0.1 mol?L－1）研究了塞來(lái)昔布與磷脂膜的相互作用，發(fā)現(xiàn)在pH=5.0條件下（炎癥細(xì)胞pH），塞來(lái)昔布結(jié)合在磷脂膜內(nèi)部；而在pH=7.4條件下（血漿pH），塞來(lái)昔布主要結(jié)合在磷脂膜表面。研究塞來(lái)昔布衍生物與蛋白質(zhì)的相互作用，對(duì)于了解其在體內(nèi)的運(yùn)輸過(guò)程以及作用機(jī)制，對(duì)發(fā)現(xiàn)和設(shè)計(jì)新型低毒副作用COX-2抑制劑具有重要意義。

本文選擇牛血清白蛋白（BSA）作為模型蛋白，利用多種光譜手段和分子模擬的方法，研究了牛血清白蛋白與BCBP的相互作用機(jī)制，獲取了兩者相互作用的系列熱力學(xué)參數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)和作用力類(lèi)型等，并研究了BCBP對(duì)牛血清白蛋白的構(gòu)象的影響。

圖1　塞來(lái)昔布衍生物1-苯磺酰胺-3-羧基-5-苯基吡唑（BCBP）結(jié)構(gòu)Fig.1　Structure of celecoxib derivatives 1-benzenesulfonamides-3-carboxyl-5-phenyl pyrazole（BCBP）

2　實(shí)驗(yàn)部分

2.1試劑與儀器

帶恒溫系統(tǒng)的F-2500熒光光度計(jì)（日本日立公司）；TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；Jasco J-810圓二色光譜儀（日本Jasco公司）。

牛血清白蛋白等均為Sigma公司產(chǎn)品；NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4等均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為三次亞沸水；BSA等溶液均用pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）配成。

2.2熒光光譜

熒光猝滅光譜：選定激發(fā)波長(zhǎng)為λex=280 nm，發(fā)射狹縫分別為2.5和5.0 nm，測(cè)得研究體系的熒光光譜。在模擬人體生理?xiàng)l件下，測(cè)定加入不同量的BCBP時(shí)BSA的熒光發(fā)射光譜，記錄溫度在298、304、310 K下，波長(zhǎng)290－510 nm范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜。

2.3紫外吸收光譜

紫外-可見(jiàn)吸收光譜：測(cè)定各BCBP、BSA以及BCBP與BSA物質(zhì)的量之比為1:1的溶液吸收光譜，波長(zhǎng)范圍350－200 nm。

2.4圓二色（CD）譜

持續(xù)氮?dú)饬鳁l件下，室溫時(shí)波長(zhǎng)范圍為200－260 nm內(nèi)樣品的CD光譜。比色皿的光路長(zhǎng)為0.1 cm，掃描速度200 nm?min－1。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，緩沖溶液作為空白，從樣品光譜圖中扣除，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果由SELCON 3.0軟件進(jìn)行處理。

2.5分子對(duì)接模擬

BSA的晶體結(jié)構(gòu)來(lái)自于數(shù)據(jù)庫(kù)Protein Data Bank（PDB），本實(shí)驗(yàn)選擇了蛋白編號(hào)為3v03的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)20，原始晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)經(jīng)去水、加氫、加電荷處理。BCBP三維結(jié)構(gòu)由軟件Sybyl 8.1構(gòu)建，并用最小能量法進(jìn)行優(yōu)化。

3　結(jié)果與討論

3.1熒光猝滅機(jī)制及猝滅常數(shù)

任何能夠通過(guò)相互作用（如：激發(fā)態(tài)反應(yīng)，分子重排，能量轉(zhuǎn)移，形成基態(tài)復(fù)合物及碰撞猝滅等）使熒光物質(zhì)熒光強(qiáng)度下降的現(xiàn)象，都可稱為熒光猝滅作用21。圖2給出了pH=7.4時(shí)在不同濃度BCBP作用下的BSA的熒光猝滅光譜?？梢钥闯?，隨著B(niǎo)CBP的不斷加入，其濃度增大，BSA的熒光強(qiáng)度逐漸降低，但最大發(fā)射波長(zhǎng)并沒(méi)有明顯的移動(dòng)，表明BCBP可以有效猝滅BSA的內(nèi)源熒光。

圖2　加入不同濃度BCBP之后BSA的熒光光譜Fig.2 Emission spectra of BSAin presence of various concentrations of BCBPc（BSA）=2.0×10－6mol?L－1；106c（BCBP）/（mol?L－1），a－k:0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，14.0，16.0，18.0，20.0，respectively. F0:fluorescenceintensityof 2.0×10－6mol?L－1BSAsolution；F:fluorescenceintensityof BSAsolutioninthepresenceof variousconcentrationsof BCBP

通常，熒光猝滅過(guò)程被認(rèn)為是猝滅劑和熒光團(tuán)之間的碰撞過(guò)程或者是二者之間形成了復(fù)合物，即動(dòng)態(tài)猝滅或者是靜態(tài)猝滅22，23。不同的猝滅機(jī)制，可以根據(jù)溫度對(duì)結(jié)合常數(shù)和粘度的影響及測(cè)定熒光壽命的方法，來(lái)加以區(qū)分。

為了判斷上述體系的猝滅機(jī)制，對(duì)猝滅過(guò)程的熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按照Stern-Volmer方程24進(jìn)行處理：

圖3　不同溫度下藥物BCBP與BSA作用的Stern-Volmer關(guān)系圖Fig.3Stern-Volmer plots for the quenching of BSAby BCBPat different temperatures

式（1）中F0和F分別表示不存在和存在猝滅劑時(shí)熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度；KSV表示Stern-Volmer猝滅常數(shù)；［Q］表示猝滅劑的濃度；kq表示生物大分子的猝滅速率常數(shù)；τ0表示不存在猝滅劑時(shí)生物大分子的平均熒光壽命。

一般情況下，對(duì)于靜態(tài)猝滅，猝滅常數(shù)Ksv隨著溫度的升高而減小；相反地，對(duì)于動(dòng)態(tài)猝滅，猝滅常數(shù)Ksv隨著溫度的升高而增大25，26。

圖3為在研究濃度范圍內(nèi)，不同溫度下藥物BCBP猝滅BSA熒光的Stern-Volmer關(guān)系圖。從圖中可以看出，在pH=7.4時(shí)，直線斜率在一定溫度范圍內(nèi)隨著溫度升高呈明顯下降趨勢(shì)。計(jì)算各個(gè)溫度下的猝滅常數(shù)列于表1，表中數(shù)據(jù)顯示，溫度升高猝滅常數(shù)呈規(guī)律性減小，表明藥物BCBP對(duì)BSA的熒光猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅。

在式（1）中，KSV=kqτ0，生物大分子的熒光平均壽命τ0為10－8s，kq可以通過(guò)式（1）計(jì)算得到，列在表1中。由上述的分析結(jié)果可知：KSV的值隨著溫度的升高而減小，且kq值遠(yuǎn)大于生物大分子的最大碰撞猝滅速率常數(shù)（2.0×1010L?mol－1?s－1），可以判斷上述實(shí)驗(yàn)中的熒光猝滅是由于形成了復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過(guò)程。

表1　pH=7.4時(shí)不同溫度下藥物BCBP對(duì)BSA作用的Stern-Volmer猝滅常數(shù)Table 1Stern-Volmer quenching constants for the interaction of BCBPwith BSAat different temperatures and pH=7.4

為了進(jìn)一步驗(yàn)證BCBP對(duì)BSA的靜態(tài)猝滅機(jī)理，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了BSA與BCBP作用的紫外吸收光譜。由于靜態(tài)猝滅是由于藥物與BSA形成了基態(tài)復(fù)合物，因而對(duì)于BSA的紫外吸收光譜會(huì)發(fā)生一定的改變。圖4為T(mén)=298 K，pH=7.4時(shí)，2.0× 10－6mol?L－1的BSA溶液的紫外吸收（曲線a）、藥物BCBP與BSA的物質(zhì)的量之比為1:1的混合物溶液的紫外吸收（曲線b）、藥物BCBP與BSA的物質(zhì)的量之比為1:1的混合物溶液與同等濃度藥物的紫外吸收差譜（曲線c）以及藥物自身的紫外吸收（曲線d）。從圖4中可以看出，在200－300 nm之間，曲線a和c出現(xiàn)了較明顯的差異，說(shuō)明此時(shí)有新物質(zhì)生成，可以推測(cè)這是由于藥物BCBP與BSA形成了基態(tài)復(fù)合物所致。此結(jié)果進(jìn)一步證明了該體系的猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅。

3.2相互作用的熱力學(xué)參數(shù)和主要作用力

對(duì)于靜態(tài)猝滅，其熒光猝滅數(shù)據(jù)可用修正的Stern-Volmer方程（即Lehrer方程）進(jìn)行處理27：

式（2）中fa為蛋白質(zhì)（熒光基團(tuán)）可接近猝滅劑的部分（分?jǐn)?shù)）；Ka為有效猝滅常數(shù)，可用作結(jié)合常數(shù)；ΔF為加入猝滅劑前后熒光強(qiáng)度的變化。以F0/ΔF 對(duì)1/［Q］作圖（圖5），即可求得蛋白質(zhì)與藥物BCBP的結(jié)合常數(shù)Ka。分別在298、304及310 K三個(gè)溫度下，固定BSA的濃度進(jìn)行熒光滴定，根據(jù)方程（2）擬合計(jì)算結(jié)合常數(shù)，列于表2。

圖4　298K時(shí)BCBP對(duì)BSA紫外吸收光譜的影響Fig.4UV-Vis spectra of interaction of BSAand BCBPat 298 K drug:BCBP

圖5　不同溫度下藥物BCBP與BSA作用的修正Stern-Volmer曲線Fig.5Modified Stern-Volmer plots for the quenching of BSAby BCBPat different temperatures ΔF:F0substractthefluorescenceintensityofBSAsolutioninthe presenceofvariousconcentrationsof BCBP

藥物小分子與蛋白質(zhì)等生物大分子之間的相互作用，通常包括靜電作用力、疏水作用力、氫鍵、范德華力和空間位阻排斥力等28。根據(jù)相互作用的熱力學(xué)參數(shù)，可以近似判斷活性小分子與生物大分子之間的主要作用力類(lèi)型。

若在研究的溫度范圍內(nèi)，反應(yīng)的焓變沒(méi)有明顯變化，視為常數(shù)，利用van?t Hoff方程，可以計(jì)算相互作用的焓變?chǔ)和熵變?chǔ)，進(jìn)而得到不同溫度下反應(yīng)的自由能變化ΔG。

表2　不同溫度下藥物BCBP對(duì)BSA作用的結(jié)合常數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)Table 2Binding constants and thermodynamic parameters of BCBP-BSAsystem at different temperatures

式（3）中K為對(duì)應(yīng)溫度下的結(jié)合常數(shù)，R為摩爾氣體常數(shù)。以lnK對(duì)1/T作圖，由斜率與截距分別可以計(jì)算出焓變?chǔ)和熵變?chǔ)，再由下式計(jì)算出反應(yīng)的自由能變：

根據(jù)關(guān)系式（3）作圖（圖6），并計(jì)算出BCBP與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)，結(jié)果列于表2。結(jié)果表明此過(guò)程為焓驅(qū)動(dòng)的自發(fā)過(guò)程，但負(fù)熵變對(duì)此過(guò)程較為不利。另外，根據(jù)ΔH和ΔS均小于0，我們可以推測(cè)，BCBP與BSA之間的作用力主要是氫鍵和范德華力29。

3.3BCBP對(duì)血清白蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圓二色譜在研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，不僅可以在接近生理?xiàng)l件下對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行低濃度、無(wú)損傷的分析，為蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化提供相關(guān)信息，而且還可以定量推算出其分子中α-螺旋、β-折疊以及無(wú)規(guī)則卷曲的含量等30。因此該方法在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析中發(fā)揮著重要作用，成為解析蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的最理想、最常用的方法之一。為了考察BCBP對(duì)血清白蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并測(cè)試了不同濃度BCBP與BSA相互作用的CD譜。

圖6　藥物BCBP與BSA相互作用的Van?t Hoff關(guān)系圖Fig.6Van?t Hoff plot for the interaction of BSAand BCBP

圖7　BCBP與BSA作用的圓二色譜Fig.7CD spectra of BCBP-BSAsystemFrom a to f，［BCBP］:［BSA］=0:1，0.5:1，1:1，2:1，5:1，10:1，respectively.color online

表3　BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)在不同濃度BCBP作用下的變化Table 3Change of secondary structures of BSAunder the action of different concentrations of BCBP

如圖7所示，隨著B(niǎo)CBP濃度的增加（圖7中a－f），BSA分子典型二級(jí)結(jié)構(gòu)的208和222 nm處負(fù)的橢圓峰變化不明顯。當(dāng)加入BCBP時(shí)，BSA的負(fù)橢圓率峰較未加藥物前總體趨勢(shì)是降低的，說(shuō)明BCBP的加入使BSA的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，其α-螺旋含量有所減少，肽鏈結(jié)構(gòu)有所伸展。利用程序SELCON 3.0，可以方便地計(jì)算出蛋白質(zhì)各二級(jí)結(jié)構(gòu)的百分比，如表3所示，在BCBP與BSA的摩爾比為1:1時(shí)，體系（在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)）負(fù)橢圓率峰最小，α-螺旋度最低。

3.4BCBP與牛血清白蛋白結(jié)合距離

熒光共振能量轉(zhuǎn)移理論（FRET）被稱作“光譜尺”，廣泛應(yīng)用于研究生物體系或大分子體系與其它分子間相互作用的結(jié)合距離31。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與藥物分子的光譜特性符合能量轉(zhuǎn)移條件時(shí)，它們之間就可能發(fā)生有效的能量轉(zhuǎn)移，反映在熒光光譜上是蛋白質(zhì)的熒光被部分猝滅，猝滅程度取決于蛋白質(zhì)（供體）與猝滅劑（受體）間的距離及能量轉(zhuǎn)移效率32，并有：

式（5）中E是供體-受體間能量轉(zhuǎn)移效率；F和F0分別為存在和不存在能量受體時(shí)，供體的熒光發(fā)射強(qiáng)度；R為供體與受體之間的真實(shí)距離，R0是轉(zhuǎn)移效率為50%時(shí)的臨界距離，其值可由下式求得：

式（6）中K2為偶極空間取向因子，n為介質(zhì)的折射指數(shù)，?為給體的熒光量子產(chǎn)率，J為給體的熒光發(fā)射光譜與受體吸收光譜間的光譜重疊積分，即：

圖8　BCBP與BSA的熒光光譜和吸收光譜重疊圖Fig.8Overlapping of the fluorescence spectra of BSA with the absorption spectra of BCBP c（BSA）=c（BCBP）=1.0×10－5mol?L－1

圖9　（a）BCBP與BSA對(duì)接模型；（b）BCBP周?chē)?.5 nm范圍內(nèi)的氨基酸殘基Fig.9（a）Docking model of BCBPand BSA；（b）amino acid residues around BCBPin 0.5 nm

式（7）中，F(xiàn)（λ）為熒光授體在波長(zhǎng)λ處的熒光強(qiáng)度，ε（λ）為受體在波長(zhǎng)λ處的摩爾吸光系數(shù)。圖8為BCBP與BSA的物質(zhì)的量之比為1:1時(shí)，BCBP的吸收光譜與BSA的重疊圖。將圖中的光譜重疊部分按式（7）積分，即可求算出J為8.180×10－17cm3?L?mol－1。在上述實(shí)驗(yàn)體系中，取向因子K2取供體和受體各向隨機(jī)分布的平均值2/3，折射指數(shù)n取水和有機(jī)物的平均值1.36，色氨酸的量子產(chǎn)率為?=0.1533，將這些數(shù)值帶入式（6）和（7）中，即可求出臨界距離R0為1.69 nm，根據(jù)據(jù)R0的值，由式（5）計(jì)算得BSA內(nèi)色氨酸殘基與已結(jié)合的BCBP分子間距離R為2.60 nm。

3.5分子模擬

大量的研究工作表明：大多數(shù)藥物分子與血清白蛋白的作用位置，位于由亞結(jié)構(gòu)域II A和亞結(jié)構(gòu)域III A的疏水腔內(nèi)，即site I和site II34。BCBP 和BSA分子對(duì)接結(jié)果的最佳構(gòu)象見(jiàn)圖9（a），可以看出：BCBP和BSA的作用區(qū)域更趨于位于site II，即布洛芬位點(diǎn)。在0.5 nm范圍內(nèi)，BCBP周?chē)陌被釟埢饕?3個(gè)，如圖9（b）所示：LEU386、ILE387、GLN389、PHE402、LEU406、TYR410、LYS413、ARG444、THR448、LEU452、ARG484、PHE487、SER488。此外，BCBP分子磺胺基上的―NH2與ILE387主鏈上的O原子形成了氫鍵（圖9 （b）黑色虛線），這有助于BCBP在BSA疏水腔中穩(wěn)定存在，這也與前面熱力學(xué)數(shù)據(jù)分析的結(jié)果相符合。進(jìn)一步計(jì)算發(fā)現(xiàn)，BCBP與BSA發(fā)光殘基TRP213的距離（質(zhì)心間距）為2.43 nm，與前面利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移理論計(jì)算出的結(jié)果R=2.60 nm非常接近，說(shuō)明了計(jì)算結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4　結(jié)論

在模擬人生理?xiàng)l件下，采用光譜和分子對(duì)接法，研究了BCBP與BSA相互作用的熱力學(xué)行為。由變溫滴定實(shí)驗(yàn)可知，Stern-Volmer猝滅常數(shù)KSV隨著溫度的升高而減小，BSA的吸收光譜也在BCBP加入之后發(fā)生變化，說(shuō)明BCBP對(duì)BSA的猝滅是生成了復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過(guò)程。在獲取的熱力學(xué)參數(shù)中，焓變和熵變均為負(fù)值，說(shuō)明BCBP與BSA之間相互作用力類(lèi)型主要是氫鍵和范德華力。CD光譜的結(jié)果表明BCBP與BSA的結(jié)合會(huì)引起B(yǎng)SA構(gòu)象發(fā)生一定的改變，但不顯著。通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移理論，計(jì)算出了BCBP與BSA色氨酸的距離約為2.60 nm。分子對(duì)接結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。與塞來(lái)昔布相比，BCBP與血清白蛋白的結(jié)合自由能更低，結(jié)合常數(shù)相對(duì)較小，表明羧基的引入降低了其與血清白蛋白的結(jié)合能力，這可能有利于其在體內(nèi)的快速結(jié)合和釋放。同時(shí)，BCBP與塞來(lái)昔布均結(jié)合在血清白蛋白的site II位點(diǎn)，結(jié)合的作用力類(lèi)型也一致，表明C-3位羧基取代對(duì)其結(jié)合模式影響不大。這些研究結(jié)果為了解塞來(lái)昔布衍生物在體內(nèi)的運(yùn)輸過(guò)程以及作用機(jī)制，提供了一些重要的理論信息，對(duì)發(fā)現(xiàn)和設(shè)計(jì)新型低毒副作用COX-2抑制劑，也具有重要的意義。

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Thermodynamics of the lnteraction of BCBP with Bovine Serum Albumin

GUO Qing-Lian1，*HE Huan2PAN Ling-Li3LIU Yi2
（1Department of Clinical Laboratory，Zhongnan Hospital，Wuhan University，Wuhan 430071，P.R.China；2College of Chemistry and Molecular Sciences，Wuhan University，Wuhan 430072，P.R.China；3Department of Emergency，Huangshi Central Hospital （Affiliated Hospital of Hubei Polytechnic University），Edong Healthcare Group，Huangshi 435002，Hubei Province，P.R.China）

Celecoxib derivatives are widely used，non-steroidal，anti-inflammatory drugs for the treatment of acute or chronic inflammation.Under simulated physiological conditions，we used fluorescence and ultraviolet absorption spectroscopy，circular dichroism，and methods of molecular simulation to study the thermodynamics of the interaction between the celecoxib derivative 1-benzenesulfonamides-3-carboxyl-5-phenyl pyrazole （BCBP）and bovine serum albumin（BSA）.The fluorescence quenching of BSAby BCBP was a static process，which was confirmed by the UV-Vis absorption spectra.The calculated enthalpy（ΔH）and entropy（ΔS）changes implied that hydrogen bonds and van der Waals forces played a predominant role in the binding process.The circular dichroism demonstrated that the secondary structure of BSA changed after its interaction with BCBP，causing the α-helix content to decrease，accompanied by an increase in an unordered structure.Molecular docking results confirmed the experimental results.

Celecoxib derivative；Bovine serum albumin；Interaction；Thermodynamics parameter

January 14，2016；Revised:March 8，2016；Published on Web:March 9，2016.

O642

［Article］10.3866/PKU.WHXB201603093www.whxb.pku.edu.cn

*Corresponding author.Email:yunjiang716@hotmail.com.

The project was supported by the Key Project of Health and Family Planning Commission of Hubei Province，China（WJ2015MB097）and Wuhan Yellow Crane Talents Program for Science and Technology，China（2014［10］）.

湖北省衛(wèi)生計(jì)生委重點(diǎn)項(xiàng)目（WJ2015MB097）和武漢黃鶴英才（科技）計(jì)劃（2014［10］）資助

?Editorial office ofActa Physico-Chimica Sinica