朱中書　孫欽然　張麗瑾　王玉潔　劉方銘　劉維菊　尹　聰　吳文慶

(山東省臨沂市中醫(yī)醫(yī)院針灸推拿科，山東　臨沂　276002)

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針刀治療動靜力失衡性大鼠頸椎間盤退變模型的研究※

朱中書孫欽然1張麗瑾2王玉潔2劉方銘△劉維菊1尹聰1吳文慶1

(山東省臨沂市中醫(yī)醫(yī)院針灸推拿科，山東臨沂276002)

目的通過完全切斷頸后伸肌群的方法，建立針刀治療的動靜力失衡性大鼠頸椎間盤退變模型，為針刀治療頸椎病提供一種較可靠的實驗模型。方法將36只SD大鼠隨機分為模型組(18只)、對照組(18只)，每組又分1個月、3個月、5個月組，每組6只，模型組采用手術(shù)方法完全切斷頸后伸肌群，對照組行偽手術(shù)。造模術(shù)后于相應(yīng)時間點進行組織形態(tài)學觀察，并進行免疫組化和定量多聚鏈反應(yīng)(PCR)檢測Ⅰ、Ⅱ型膠原表達強度及基因表達變化。結(jié)果組織形態(tài)學觀察：頸椎間盤退變程度逐漸加快、加重，模型組頸椎間盤退變較對照組明顯；3個月時模型組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白檢測：(1)免疫組化染色法，Ⅰ型膠原與椎間盤退變呈正相關(guān)性，Ⅱ型膠原與椎間盤退變呈負相關(guān)性，二者在椎間盤退變過程中發(fā)生轉(zhuǎn)換。模型組Ⅰ、Ⅱ型膠原表達均在3個月時較對照組明顯(P<0.05)，而對照組Ⅰ、Ⅱ型膠原表達5個月較1個月時才開始明顯(P<0.05)。(2)PCR檢測：隨著椎間盤退變進程，Ⅰ型膠原基因表達逐漸增加；Ⅱ型膠原基因表達逐漸減少。模型組Ⅰ、Ⅱ型膠原基因表達均在3個月時較對照組有明顯變化(P<0.05)。結(jié)論完全切斷頸后伸肌群可造成大鼠頸椎動靜力失衡，從而加快頸椎間盤退變進程，3個月時即退變明顯，為針刀治療頸椎病的機制研究提供一種理想的動物模型。

疾病模型,動物；脊柱骨贅?。活i椎；大鼠；動物

頸椎病(cervical spondylosis，CS)是由于頸椎間盤退變本身及其繼發(fā)性改變刺激或壓迫鄰近組織，并引起各種癥狀和(或)體征的病癥[1]。頸椎病是臨床常見病、多發(fā)病，給患者帶來巨大痛苦和不便的同時，嚴重影響著其身心健康和生活質(zhì)量。隨著人口老齡化的加劇和社會工種、生活方式的轉(zhuǎn)變，頸椎病的發(fā)病率逐年上升，呈普遍化、年輕化趨勢，患病率在某些職業(yè)中甚至高達90%以上[2]。頸椎病以頸椎間盤退變?yōu)閮?nèi)在病理基礎(chǔ)，頸椎間盤退變是頸椎病發(fā)生的始動環(huán)節(jié)和根本原因[3-4]。目前認為防止或延緩頸椎間盤退變的發(fā)生有助于從根本上防止頸椎病，但由于缺乏合適的動物模型，椎間盤退變和頸椎病發(fā)生的確切原因及機制尚不十分清楚。運用針刀松解調(diào)節(jié)頸部動靜力失衡治療頸椎病療效可靠[5-6]，但針刀治療頸椎病的機制研究相對薄弱。本研究基于針刀醫(yī)學原理建立一種大鼠頸椎間盤退變模型，進而為針刀治療延緩頸椎間盤退變機制的研究提供實驗載體，并為頸椎病的預防及早期干預提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動物及分組3個月齡SPF級SD健康雌性大鼠36只，體質(zhì)量(240±10)g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司質(zhì)檢中心實驗動物室提供(許可證號：SCXK魯20130001)，室內(nèi)空氣流通，相對濕度60%±10%，溫度(23±2)℃，以國家標準固體混合飼料喂養(yǎng)，自由飲食。實驗過程對動物處置符合2006年科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》[7]。按隨機數(shù)字表法分為模型組、對照組各18只，每組再按照造模后1個月、3個月、5個月分組，每組6只。

1.2主要試劑及實驗器材生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測試劑盒以及濃縮型二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，Anti-Collagen Type Ⅰ、Rat Type Ⅱ CollagenⅠ、Ⅱ型膠原蛋白大鼠抗體(美國 MerckMillipore 公司)，蘇木素-伊紅(HE)(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司)，總核糖核酸(RNA)提取試劑盒以及兩步法MMLV RT-PCR擴增試劑盒(北京達科為生物技術(shù)有限公司)，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus，RR820A，TaKaRa)，脫氧核糖核酸(DNA)引物及內(nèi)參(上海生工生物工程股份有限公司)，石蠟切片機(德國SLEE)，生物組織攤烤片機(武漢中天鴻博醫(yī)療設(shè)備有限公司)，GenePro基因擴增儀(BIOER，C-E)，臺式低溫離心機(Thermo Scientific Heraeus Multiftige X1R)，-80 ℃超低溫冰箱(Thermo，F(xiàn)ORMA700 SERIES)，組織勻漿機(ULTRA TURRAX IKA T18 basic)，光學顯微鏡(日本OLYMPUS)，照相顯微鏡(日本OLYMPUS FSX 100)，研究級正置式熒光顯微鏡(德國卡爾·蔡司 Axio Imager.A2)，Image-Pro Plus 6.0軟件(美國 Media Cbernetics 公司)。

1.3動物模型建立模型組參照上海中醫(yī)藥大學脊柱病研究所的造模方法[8]，改進建立動靜力失衡性頸椎病模型。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，采用10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉，按300 mg/kg用藥，麻醉成功后，大鼠兩耳至兩肩胛間范圍內(nèi)備皮，將大鼠俯臥位固定于固定板上，碘伏消毒，敷洞巾，取頸后部正中切口，從寰枕關(guān)節(jié)至第2胸椎棘突之間縱向切開皮膚及皮下組織2～2.5 cm，充分鈍性游離頸部各肌肉層至暴露頸椎，由里向外逐層依次完全切斷第2～7頸椎棘間韌帶和棘上韌帶，深層的頸夾肌、頭頸寰最長肌、頸髂肋肌和頭半棘肌，淺層的頸闊肌、頸斜方肌、頭頸菱形肌，止血后間斷縫合兩側(cè)骶棘肌和皮膚，術(shù)后連續(xù)3 d注射青霉素以防感染，術(shù)后不拆線，讓線自然脫落。對照組行偽手術(shù)，僅切開頸后部皮膚后縫合。造模術(shù)后大鼠予以自由攝食、飲水。

1.4標本采集與指標檢測分別于造模后相應(yīng)時間點采集標本。以急性失血法處死大鼠，即取第2～7頸椎段椎體，磷酸緩沖液(PBS)沖洗血污等，定位剖取第4～5頸椎、第5～6頸椎帶椎體間盤，用10%甲醛固定，乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣處理2周后石蠟包埋切片，常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色及免疫組化對Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白進行檢測(以PBS代替一抗作陰性對照)，光學顯微鏡下對椎間盤進行組織形態(tài)學觀察，按Miyamoto等[9]分級標準將椎間盤評分(見表1)。另剖取第2～3頸椎、第3～4頸椎、第6～7頸椎無椎體間盤，-80 ℃保存，待標本采集完全后行定量多聚酶鏈反應(yīng)檢測(PCR)(引物序列及內(nèi)參見表2)，對各組Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白基因表達變化進行檢測。免疫組化及PCR步驟均嚴格按照試劑盒說明進行操作。

表1　Miyamoto椎間盤形態(tài)學分級評分標準

表2　引物序列表

2　結(jié)　果

2.12組大鼠椎間盤光鏡下組織形態(tài)學觀察。

2.1.12組大鼠頸椎間盤退變程度Miyamoto分級評分比較見表3。

表3　2組大鼠頸椎間盤退變程度Miyamoto分級評分比較　分，

與同期對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組1個月比較，△P<0.05，△△P<0.01；與對照組1個月比較，#P<0.05

由表3可見，頸椎間盤退變程度逐漸加快、加重，模型組頸椎間盤退變較對照組明顯(P<0.05，P<0.01)；3個月時模型組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.1.22組大鼠頸椎間盤組織形態(tài)學觀察

2.1.2.1對照組大鼠頸椎間盤組織形態(tài)學變化見圖1。

圖1　對照組頸椎間盤組織形態(tài)學變化(HE染色，×40　標尺示：150 μm)

由圖1可見，對照組A(1個月)，椎間盤形態(tài)規(guī)則，髓核居中，纖維環(huán)排列整齊，軟骨終板清晰；對照組B(3個月)，較1個月髓核略后移，余變化不大；對照組C(5個月)，椎間盤形態(tài)較規(guī)則，髓核皺縮，纖維環(huán)排列較整齊，軟骨終板邊緣不整。

2.1.2.2模型組大鼠頸椎間盤組織形態(tài)學變化見圖2。

由圖2可見，模型組A(1個月)，椎間盤形態(tài)規(guī)則，髓核居中，纖維環(huán)排列整齊，軟骨終板清晰，形態(tài)及結(jié)構(gòu)基本正常；模型組B(3個月)，椎間盤形態(tài)較規(guī)則，髓核皺縮，纖維環(huán)排列略紊亂，軟骨終板較清晰；模型組C(5個月)，椎間盤形態(tài)改變，髓核皺縮明顯，纖維環(huán)排列紊亂，軟骨終板邊緣缺損、毛糙。

圖2　模型組頸椎間盤組織形態(tài)學變化(HE染色，×40　標尺示：150 μm)

2.2Ⅰ、Ⅱ型膠原檢測

2.2.1免疫組織化學染色法檢測Ⅰ、Ⅱ型膠原的表達顯微鏡下觀察，以細胞外基質(zhì)見棕黃色陽染顆粒和(或)區(qū)判定為陽性表達，采集圖片(如圖3)。利用Image-Pro Plus軟件，以其各自的平均光密度值反映Ⅰ、Ⅱ型膠原染色強度變化，客觀評價Ⅰ、Ⅱ型膠原表達強度。結(jié)果顯示，Ⅰ型膠原與椎間盤退變呈正相關(guān)性，Ⅱ型膠原與椎間盤退變呈負相關(guān)性，二者在椎間盤退變過程中發(fā)生轉(zhuǎn)換。

圖3?、?、Ⅱ型膠原的表達

2.2.2定量多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測Ⅰ、Ⅱ型膠原基因水平表達見表4。

表4　各組大鼠Ⅰ、Ⅱ型膠原檢測　±s

與同期對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組1個月比較，△P<0.05，△△P<0.01；與對照組1個月比較，#P<0.01

由表4可見，隨著椎間盤退變進程，Ⅰ型膠原基因表達逐漸增加；Ⅱ型膠原基因表達逐漸減少。模型組Ⅰ、Ⅱ型膠原基因表達均在3個月時較對照組明顯變化(P<0.05)。①Ⅰ型膠原基因表達：模型組與對照組比較，3個月、5個月均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；模型組組內(nèi)與1個月比較，3個月、5個月均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。②Ⅱ型膠原基因表達：模型組與對照組比較，3個月、5個月均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；模型組組內(nèi)與1個月比較，3個月、5個月均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

3　討　論

椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IDD)的起因及發(fā)生機制尚未完全明確，目前認為退變過程中椎間盤變化主要包括生物力學失衡和生物化學失衡兩方面。

椎間盤在機械應(yīng)力分布的改變下的相應(yīng)變形是脊柱運動和功能實現(xiàn)的前提。頸椎間盤退變?nèi)菀装l(fā)生與頸椎承托頭部重力并完成其各方向活動，兼具靜態(tài)支撐和可運動功能，靈活性大、活動頻率高。椎間盤退變是一種應(yīng)力適應(yīng)，頸椎長時間處于異常應(yīng)力環(huán)境是導致退變的一個重要因素。在頸椎間盤漸進性退變過程中，軟骨內(nèi)形成骨贅，髓核由膠凍樣組織變成纖維軟骨組織，體積縮小，纖維環(huán)的層狀結(jié)構(gòu)紊亂，髓核和纖維環(huán)界限不清，椎間盤出現(xiàn)裂隙。因此，骨贅形成、纖維環(huán)裂傷、軟骨終板鈣化、schmorl結(jié)節(jié)形成及椎間隙狹窄是椎間盤退變的組織形態(tài)學標志[10]。而椎間盤的營養(yǎng)主要依靠軟骨終板和纖維環(huán)的滲透作用，異常應(yīng)力下的纖維環(huán)撕裂及軟骨終板鈣化必然影響髓核的營養(yǎng)供給，從而導致和(或)加速退變。本實驗研究結(jié)果顯示，隨著退變的進程，椎間盤結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，逐漸出現(xiàn)纖維環(huán)紊亂、髓核皺縮、軟骨終板鈣化等改變，模型組頸椎間盤退變較對照組為快、為重，3個月時椎間盤退變即表現(xiàn)明顯。

細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的合成與降解失衡使基質(zhì)成分紊亂，導致相關(guān)椎間盤疾病的產(chǎn)生[11]。近年來研究主要集中在細胞外基質(zhì)，并認為細胞外基質(zhì)的變化是最終導致椎間盤退變的關(guān)鍵[12]。正常椎間盤中細胞外基質(zhì)處于合成和分解的動態(tài)平衡之中，而這種平衡在退變椎間盤中被打破[13]。膠原是重要的細胞外基質(zhì)，不同類型的膠原在椎間盤組織中的結(jié)構(gòu)、含量和分布，決定著椎間盤的生理特征及功能狀態(tài)，膠原的變化與椎間盤的退變存在著密切關(guān)系。正常椎間盤中主要以Ⅰ、Ⅱ型膠原為主，約占椎間盤膠原的80%左右，其中髓核主要以Ⅱ型膠原為主，纖維環(huán)主要以Ⅰ、Ⅱ型膠原為主，軟骨終板主要以Ⅱ型膠原為主，髓核吸收震蕩、承受和傳導壓力、維持應(yīng)力平衡的作用與椎間盤內(nèi)存在大量的Ⅱ型膠原密切相關(guān)。隨著椎間盤的退變，膠原類型發(fā)生轉(zhuǎn)換，組織中Ⅱ型膠原的含量逐漸減少，Ⅰ型膠原含量逐漸增加，同時出現(xiàn)髓核含水能力降低，蛋白多糖含量下降等改變[14-15]。本實驗研究結(jié)果顯示，椎間盤退變過程中，Ⅰ型膠原含量及基因表達逐漸增加，呈正相關(guān)性，Ⅱ型膠原含量及基因表達逐漸減少，呈負相關(guān)性，二者在椎間盤退變過程中發(fā)生轉(zhuǎn)換。模型組在退變過程中Ⅰ、Ⅱ型膠原變化較對照組明顯，3個月時椎間盤內(nèi)Ⅰ、Ⅱ型膠原變化已較為顯著。

現(xiàn)代生物力學理論認為，正常頸椎的穩(wěn)定性由包括椎體、附件、椎間盤和相連的韌帶結(jié)構(gòu)的靜力平衡和頸部肌肉的動力平衡共同維系。頸椎椎體及椎間盤沒有主動力學行為，后關(guān)節(jié)決定運動的形式，頸肌是運動的動力，維持著頸椎的動靜態(tài)平衡，且在頸椎病的發(fā)展和臨床治療的每一個階段、每一個環(huán)節(jié)均發(fā)揮著重要的作用[16]。大量研究證實，頸椎病的發(fā)生發(fā)展與頸椎相關(guān)肌肉系統(tǒng)病變密切相關(guān)[17]。頸椎病初發(fā)癥狀多為肌性癥狀。王擁軍[18]認為頸椎生物力學失衡是頸椎間盤退變的主要機制，提出“動力失衡為先，靜力失衡為主”的頸椎病病機學說。

一個適合、可靠的退變模型能為頸椎病發(fā)病機制的研究提供良好的實驗載體，同時也是驗證一種治療方法有效性的有力保證，是問題研究的關(guān)鍵。目前，椎間盤退變模型較多，除沙鼠等極少數(shù)自然退變模型外，其他模型的建立均需實驗操作誘導而產(chǎn)生。椎間盤退變模型必須具備以下條件：①能夠最真實模擬人椎間盤退變過程；②具備較高重復性和可靠性。關(guān)于造模的物種選擇仍存在較大爭議，限于模型的易獲得性及實驗的可操作性、重復性高等因素，大鼠和兔仍是常用的模型實驗動物。動靜力失衡性頸椎退變模型通過損傷頸背部肌肉以及相關(guān)韌帶，造成頸椎的動靜力失穩(wěn)，能夠很好地模擬臨床上頸背肌肉軟組織由于長期反復持久的勞損與刺激而導致的頸椎退行性變，是一種“自發(fā)性”退變模型，越來越受到重視。近年來，以動靜力失衡大鼠模型研究頸椎間盤退變的越來越多，但其模型的制備為切除頸后伸肌群誘導椎間盤退變[8，19-22]。

針刀治療頸椎病有其獨到的理論體系，針刀醫(yī)學認為頸椎病的發(fā)生，主要是由于頸椎生物力學發(fā)生改變，導致動態(tài)平衡失調(diào)所致。急、慢性損傷后頸周軟組織之間形成粘連、瘢痕、攣縮等病理改變是導致頸椎動靜力失衡、引發(fā)頸椎病的主要原因。針刀通過切割和剝離達到調(diào)筋理筋的作用，恢復局部肌肉軟組織的動態(tài)平衡，從而治愈頸椎病，體現(xiàn)了中醫(yī)“骨病治筋”的理念。針刀松解是以調(diào)節(jié)局部相關(guān)易受損的肌肉起止點為治療基礎(chǔ)，多“以痛為腧”和“以筋結(jié)為腧”，“針至病所”是療效前提。通過切除頸后伸肌群誘導椎間盤退變模型，針刀就失去了調(diào)節(jié)頸椎動態(tài)平衡的治療點。

本實驗通過完全切斷頸后伸肌群、改變椎間盤應(yīng)力誘導建立的動靜力失衡大鼠模型，未破壞椎間盤完整結(jié)構(gòu)，創(chuàng)傷性小、成功率和可重復性高，造模3個月時頸椎間盤即有明顯退變表現(xiàn)，是針刀治療頸椎病的機制研究的一種理想動物模型。同時，該模型體現(xiàn)了頸部肌肉損傷修復過程中產(chǎn)生的粘連、瘢痕、攣縮等病理因素在頸椎間盤退變中的重要影響，為頸椎病的針刀早期介入治療和預防提供了理論依據(jù)。

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(本文編輯：董軍杰)

Study of Needle-knife on degenerated cervical intervertebral disc in imbalance of dynamic and static forces rats

ZHUZhongshu*,SUNQinran,ZHANGLijin,etal.

*DepartmentofAcupunctureandMoxibustion,LinyiHospitalofTraditionalChineseMedicineinShandongProvince,Shandong,Linyi276002

ObjectiveTo establish models of degenerated cervical intervertebral disc in imbalance of dynamic and static forces rats which by means of cut off posterior neck extensors, that provide a stable experimental animal model of Needle-knife on the treatment of cervical spondylopathy. Methods 36 SD rats were randomly divided into model group (n=18) and control group (n=18). Then, rats in each group were sub-divided into one-month group, 3 months group and 5 months group, 6 rats in each group. The posterior neck extensors of model group were shut off, and the control group received sham operation. After modeling, the histomorphology at each point in time were observed, and the expressions of immunology and histology chemistry (IHC) and PCR of collagen typeⅠand Ⅱ were detected. Results Intervertebral disc degeneration grade was speed up and more serious, the changes in model group were more obviously, and there were statistical differences on intervertebral disc degeneration grade after three months between two groups (P<0.05). The IHC of collagen typeⅠand Ⅱ: The collagen typeⅠwas positively correlated with degenerated cervical intervertebral disc, and the collagen type Ⅱ was negative correlation, the transformation of collagen typeⅠand Ⅱoccurs during the changes of intervertebral disc degeneration. The expressions of collagen typeⅠand Ⅱafter three months in model group were obviously than those in control group (P<0.05). The collagen typeⅠand Ⅱ were strongly expressed after five months in control group than those at one month (P<0.05). The PCR detections: The expressions of typeⅠcollagen gene was positively related with the process of intervertebral disc degeneration, and the type Ⅱcollagen gene was negative. The expressions of type Ⅰand Ⅱ collagen gene in treatment group had obviously changes after three months as compared with those in control group (P<0.05). Conclusion Shut off the posterior neck extensors can lead to imbalance of dynamic and static forces in rats, which can accelerate the process of intervertebral disc degeneration. The obvious degeneration will turn up three months after operation, which provide an ideal animal model for study the mechanism of Needle-knife on cervical spondylopathy.

Disease model; Animal; Vertebra osteophytosis; Cervical vertebra; Rats

10.3969/j.issn.1002-2619.2016.07.020

△山東省千佛山醫(yī)院康復醫(yī)學科，山東濟南250014

朱中書(1986—)，男，住院醫(yī)師，碩士。 研究方向：脊柱區(qū)帶病的臨床治療和脊柱生物力學研究。

R-332；R681.550.23；R682.120.23

A

1002-2619(2016)07-1034-06

2015-09-08)

※ 項目來源：山東省自然科學基金(編號：ZR2010HM121)

1山東省千佛山醫(yī)院康復醫(yī)學科，山東濟南250014

2山東中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，山東濟南250012