李鵬程，劉玉玲，黨群，劉慧麗，王冬亮，湯福想，郭沛沛，劉學(xué)友

（1.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450014；2.河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003）

論著

雌激素受體α、雌激素受體β、激活蛋白1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型中的表達(dá)及意義*

李鵬程1，劉玉玲1，黨群2，劉慧麗2，王冬亮1，湯福想1，郭沛沛1，劉學(xué)友1

（1.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450014；2.河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003）

目的探討雌激素受體α（ERα）、雌激素受體β（ERβ）、激活蛋白1（AP-1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）在大鼠子宮內(nèi)膜異位癥（EM s）模型中的表達(dá)及意義。方法采用皮下種植法建立大鼠EM s模型，選取建模成功的28只大鼠為模型組（n=28），觀察大鼠EMs模型在位內(nèi)膜及異位病灶的組織病理學(xué)改變，并通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)對(duì)照組子宮內(nèi)膜、模型組在位子宮內(nèi)膜和異位病灶ERα、ERβ、AP-1、VEGF的表達(dá)情況。結(jié)果①大鼠EM s模型在位內(nèi)膜及異位病灶腺體、間質(zhì)血管明顯增加；②大鼠EMs模型的異位病灶與對(duì)照組子宮內(nèi)膜間ERα陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.107），而其在位內(nèi)膜中的表達(dá)較對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。ERβ、AP-1（c-jun）蛋白、VEGF在模型組在位內(nèi)膜及異位病灶中陽(yáng)性率與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），但其在位內(nèi)膜及異位病灶中的表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論大鼠EM s模型在位內(nèi)膜中ERα和ERβ均高表達(dá)，異位病灶中則僅表現(xiàn)為ERβ高表達(dá)，同時(shí)上調(diào)c-jun，VEGF的表達(dá)，ERβ可能在EM s的發(fā)生發(fā)展中起到較ERα更為重要的作用。

子宮內(nèi)膜異位癥；動(dòng)物模型；雌激素受體亞型；激活蛋白1

子宮內(nèi)膜異位癥（Endometriosis，EMs）是一種雌激素依賴性疾病，嚴(yán)重影響育齡期婦女的生活質(zhì)量及生育能力。關(guān)于其發(fā)病機(jī)制，SAMPSON最先提出經(jīng)血逆流學(xué)說(shuō)，而后郎景和院士提出“在位內(nèi)膜決定論”[1]認(rèn)為EMs的在位子宮內(nèi)膜與非子宮內(nèi)膜異位癥存在本質(zhì)上的不同。其分子生物學(xué)行為可能源于雌激素暴露，作用于雌激素受體（estrogen receptor，ER），啟動(dòng)對(duì)應(yīng)的信號(hào)通路，多條信號(hào)通路相互作用的結(jié)果促進(jìn)了逆流的子宮內(nèi)膜在宮腔以外生長(zhǎng)。激活蛋白1（activator protein 1，AP-1）是一種重要的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生理過(guò)程，雌激素與ER結(jié)合后，依賴ER轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子（如AP-1、NF-кB）的活性，進(jìn)而調(diào)控相應(yīng)細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)EMs的形成和發(fā)展。大量研究證據(jù)顯示，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在EMs的發(fā)生發(fā)展中有重要作用，但與有關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的研究結(jié)果尚不明確。本研究通過(guò)建立大鼠EMs模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)正常大鼠子宮內(nèi)膜、大鼠EMs模型異位病灶及在位子宮內(nèi)膜中ERα，ERβ，AP-1（c-jun蛋白）、VEGF的表達(dá)，探討雌激素受體亞型、AP-1、VEGF在大鼠EMs模型中的表達(dá)特點(diǎn)及意義。

1　材料與方法

1.1材料來(lái)源

河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買的清潔健康雌性未孕的SD大鼠60只。鼠齡60～90 d，體重220～250 g，實(shí)驗(yàn)的各研究組大鼠的鼠齡、質(zhì)量之間均無(wú)明顯差異。兔抗大鼠ER α、ER β、c-jun、VEGF多克隆抗體，免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1構(gòu)建大鼠EM s模型觀察大鼠的正常發(fā)情周期，選取連續(xù)觀察2個(gè)正常發(fā)情周期的大鼠進(jìn)行建模。建模前1天均肌注苯甲酸雌二醇0.2mg/（kg· d），使大鼠處于發(fā)情期，皮下移植法建立子宮內(nèi)膜異位癥的動(dòng)物模型[2]。具體方法：供體大鼠稱重，10%水合氯醛（0.3ml/100 g）腹腔麻醉，固定，常規(guī)腹部備皮，消毒鋪巾，取尿道口上方大概10mm處行約3 cm的垂直正中縱切口開腹進(jìn)入腹腔，在膀胱下可見子宮呈“Y”形，近端在離宮角約10mm處結(jié)扎，遠(yuǎn)端在離卵巢約20mm處結(jié)扎，切除子宮，放入磷酸鹽緩沖液中洗滌，切開管形子宮，剝除漿膜層、肌層，將剝除的子宮內(nèi)膜剪為5mm×5mm大小的片段；采用皮下種植法將子宮內(nèi)膜片段植入受體大鼠的腹肌和皮下筋膜之間，使內(nèi)膜面緊貼腹肌進(jìn)行皮下建模術(shù)，同時(shí)取部分內(nèi)膜組織送病理檢查以確認(rèn)為大鼠子宮內(nèi)膜組織，最后關(guān)腹。術(shù)后3 d常規(guī)進(jìn)行硫酸慶大霉素0.1ml肌肉注射預(yù)防感染。術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)3周，進(jìn)行2次開腹，觀察移植子宮內(nèi)膜（異位病灶）的生長(zhǎng)情況。構(gòu)建模型成功的標(biāo)準(zhǔn)：病理組織學(xué)證明為大鼠子宮內(nèi)膜組織，移植物呈囊性生長(zhǎng)增大，囊壁有新鮮血管形成、少許結(jié)締組織，囊泡內(nèi)有清亮或黃色液體。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組及標(biāo)本處理隨機(jī)選取同一批次10只正常雌性大鼠作為對(duì)照組（喂養(yǎng)條件與術(shù)后實(shí)驗(yàn)組相同），選取建模成功的大鼠28只（2只為無(wú)效造模）作為實(shí)驗(yàn)組，在消毒、無(wú)菌條件下取模型組大鼠異位病灶組織、在位子宮內(nèi)膜及對(duì)照組子宮內(nèi)膜，分別固定于4%多聚甲醛，石蠟包埋，將蠟塊連續(xù)切片，厚4μm，部分常規(guī)蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，部分用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ER α，ER β，AP-1（c-jun蛋白）、VEGF的表達(dá)情況。

1.2.3免疫組織化學(xué)檢測(cè)及結(jié)果判定采用免疫組織化學(xué)鏈霉親和素 -生物素復(fù)合物（strept avidin-biotin complex，SABC）法，本實(shí)驗(yàn)中用磷酸緩沖鹽溶液代替一抗，呈陰性，嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，脫蠟、滅活內(nèi)源性酶、封閉，一抗、二抗反應(yīng)后二氨基聯(lián)苯胺顯色并脫水后鑲埋，充分干燥后采用半定量標(biāo)準(zhǔn)判定免疫組織化學(xué)的陽(yáng)性結(jié)果：每個(gè)石蠟標(biāo)本取4張切片，每張切片鏡下隨機(jī)取5個(gè)（×400）視野，綜合染色強(qiáng)度及細(xì)胞核中陽(yáng)性細(xì)胞的百分比進(jìn)行判定，抗體效應(yīng)物為棕褐色或棕黃色。陽(yáng)性細(xì)胞染色深度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；兩者乘積≥3分為陽(yáng)性，各組所有視野的平均分作為最終的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算各組的陽(yáng)性率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用百分比或率表示，用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠EMs組織病理學(xué)特征

大鼠EMs模型異位病灶呈囊性生長(zhǎng)增大，囊壁有新鮮血管形成、少許結(jié)締組織，囊泡內(nèi)有清亮或黃色液體。組織病理學(xué)可見異位子宮內(nèi)膜腺體生長(zhǎng)良好，分散排列，囊腔可見炎癥細(xì)胞，間質(zhì)富含血管，固有腺體較多，呈擴(kuò)張狀改變。腺體數(shù)目較在位內(nèi)膜少。見圖1。（異位病灶鏡下見較多脂肪組織因皮下建模的緣故）。

2.2對(duì)照組、模型組在位子宮內(nèi)膜及異位病灶中ER α、ER β、c-jun、VEGF蛋白的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示ER α、ER β、c-jun、VEGF在大鼠子宮腺上皮細(xì)胞、腔上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，其中以腺上皮細(xì)胞表達(dá)顯著，陽(yáng)性表達(dá)呈棕色顆粒。整體來(lái)說(shuō)ER α比ER β表現(xiàn)出更明顯的陽(yáng)性率，均表現(xiàn)為棕褐色或棕黃色顆粒。ER α在模型組在位子宮內(nèi)膜中的表達(dá)及ER β、c-jun、VEGF在在位子宮內(nèi)膜和異位病灶中的表達(dá)均較對(duì)照組明顯增強(qiáng)（P<0.01），但ER α在異位病灶中的表達(dá)與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），各因子在模型組異位病灶及在位子宮內(nèi)膜間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖2～5和表1～4。

圖1　建模成功的大鼠子宮內(nèi)膜異位病灶及在位內(nèi)膜的組織病理學(xué)特征（HE×100）

圖2　ER α在各研究組中的表達(dá)（SABC×400）

圖3　ER β在各研究組中的表達(dá)（SABC×400）

圖4　c-jun在各研究組中的表達(dá)（SABC×400）

圖5　VEGF在各研究組中的表達(dá)（SABC×400）

表1　ER α蛋白在兩組大鼠子宮內(nèi)膜中的表達(dá)情況

表2　ER β蛋白在兩組大鼠子宮內(nèi)膜中的表達(dá)情況

表3　c-jun蛋白在兩組大鼠子宮內(nèi)膜中的表達(dá)情況

表4　VEGF蛋白在兩組大鼠子宮內(nèi)膜中的表達(dá)情況

3　討論

3.1ER α、ER β與EMs的相關(guān)性

EMs是一種雌激素依賴性疾病，雌激素與ER結(jié)合促進(jìn)了異位內(nèi)膜的侵襲、生長(zhǎng)，且造成子宮內(nèi)膜細(xì)胞特殊的生物學(xué)性質(zhì)，郎景和院士提出“在位內(nèi)膜決定論”[1]，認(rèn)為EMs的在位子宮內(nèi)膜具有更強(qiáng)的侵襲、黏附、血管形成特性，與正常子宮內(nèi)膜有明顯差異，可隨經(jīng)血逆流入腹腔并極易種植生長(zhǎng)，引起EMs的發(fā)生發(fā)展。

隨著ERβ的發(fā)現(xiàn)，證明雌激素是通過(guò)ER α、ER β發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[3]，本研究中模型組在位內(nèi)膜中ERα、ERβ的表達(dá)均較對(duì)照組顯著，異位病灶中ERα的表達(dá)未表現(xiàn)出差異，ERβ的表達(dá)模型組較對(duì)照組顯著，驗(yàn)證了“在位內(nèi)膜決定論”。模型組異位病灶ERβ的表達(dá)顯著，ER α/ER β比值降低，這與HUDELIST等[4]研究結(jié)果一致，異位病灶中ERβ的表達(dá)明顯增強(qiáng)，ERα的表達(dá)相對(duì)較弱。有報(bào)道ERα在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥的在位內(nèi)膜中表達(dá)顯著，認(rèn)為其是卵巢子宮內(nèi)膜異位癥形成和發(fā)展的關(guān)鍵[5]，而另有報(bào)道異位病灶中ERα的周期性改變不明顯，甚至消失，ERβ的改變?cè)诋愇徊≡钪衅鹬饕饔肹6-7]，本研究證實(shí)，在正常子宮內(nèi)膜、EMs在位子宮內(nèi)膜及異位病灶中ERα的表達(dá)較ERβ強(qiáng)，但只有EMs在位內(nèi)膜與對(duì)照組的比較中ERα的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余未顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而ERβ在EMs的異位病灶和在位內(nèi)膜中表達(dá)明顯增強(qiáng)，據(jù)此推測(cè)，ERα是EMs發(fā)生的重要前提條件，ERβ決定EMs發(fā)生的結(jié)局，在位內(nèi)膜ERα、ERβ的顯著表達(dá)、異位病灶ERα/ERβ比值的下降，這種表達(dá)模式的改變，是促進(jìn)EMs發(fā)生、發(fā)展的重要條件，ERβ在EMs的發(fā)生、發(fā)展中可能起到較ERα更為重要的作用，但是ERα、ERβ間是否存在相互作用以及其復(fù)雜的作用機(jī)制需要更深入的研究。

3.2ERα、ERβ與AP-1、VEGF的相互作用關(guān)系

雌激素作用于ER，通過(guò)ER信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)AP-1進(jìn)行激活、調(diào)控。ER信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有兩種：①基因轉(zhuǎn)錄效應(yīng)；②非基因轉(zhuǎn)錄效應(yīng)：雌激素與ER結(jié)合后，主要依賴絲裂原激活蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（NF-кB、AP-1等）的表達(dá)。高雌激素環(huán)境、ER的亞型、組織細(xì)胞的類型對(duì)AP-1的表達(dá)起著重要的作用，與EMs的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[8]。VEGF在EMs中過(guò)表達(dá)，促進(jìn)血管生成、異位內(nèi)膜細(xì)胞增殖，促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞黏附、侵襲、血管形成。雌激素作用于ER，VEGF的表達(dá)明顯增強(qiáng)[9]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子內(nèi)包含AP-1的結(jié)合位點(diǎn)[10]，AP-1被激活后，作用于VEGF的轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)，增強(qiáng)VEGF的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中在位內(nèi)膜ERα、ERβ的顯著表達(dá)、異位病灶ERα/ERβ比值的下降，AP-1的異常激活，VEGF的顯著上調(diào)，提示雌激素可能主要作用于ERβ，激活、調(diào)控AP-1，上調(diào)VEGF，促進(jìn)EMs的發(fā)生、發(fā)展。但具體哪一種雌激素作用通路對(duì)AP-1進(jìn)行調(diào)控，上調(diào)VEGF，需要進(jìn)一步研究證實(shí)。另外ERβ、c-jun、VEGF在大鼠EMs模型的在位內(nèi)膜和異位病灶子宮內(nèi)膜的無(wú)差異表達(dá)，也更證實(shí)“在位內(nèi)膜決定論”的觀點(diǎn)。

綜上所述：EMs的發(fā)病機(jī)制尚在研究中，存在頗多爭(zhēng)議，雌激素受體表達(dá)模式的改變是EMs形成的一個(gè)重要方面。目前第3代雌激素受體調(diào)節(jié)劑巴多昔芬作為治療EMs的新藥逐漸進(jìn)入人們的視野[2]，對(duì)ERα、ERβ及其作用通路及ERα、ERβ間復(fù)雜的作用機(jī)制進(jìn)行研究，將為EMs的發(fā)病機(jī)制及臨床靶向治療提供理論依據(jù)。

[1]郎景和.子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病的“在位內(nèi)膜決定論”.中華醫(yī)學(xué)會(huì).第八次全國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C].中華醫(yī)學(xué)會(huì),2004:2.

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[4]HUDELIST G,KECKSTEIN J,CZERWENKA K,et al.Estrogen receptor beta and matrix metalloproteinase 1 are coexpressed in uterine endometrium and endometriotic lesions of patients with endometriosis[J].Fertil Steril,2005,84(2):1249-1256.

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（張蕾編輯）

Expression and significance of estrogen receptors α and β，activator protein and VEGF in rat model of endometriosis*

Peng-cheng Li1，Yu-ling Liu1，Qun Dang2，Hui-li Liu2，Dong-liang Wang1，F(xiàn)u-xiang Tang1，Pei-pei Guo1，Xue-you Liu1
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou，Henan 450014，China；2.Department of Obstetrics and Gynecology，Henan Provincial People's Hospital，Zhengzhou，Henan 450003，China）

Objective To explore the expression and significance of estrogen receptor α（ERα），ER β，activator protein 1（AP-1）and VEGF in rat model of endometriosis（EM）.M ethods Subcutaneous implantation was used to establish EM model in female rats.The rats with successful ectopic implants were served as model group（n=28），and the normal rats served as control group（n=10）.The histopathological changes of ectopic implants were observed after fourweeks.The expression levels of ERα，ERβ，AP-1 and VEGF in the endometrium and endometriosis lesions were observed by immunohistochemistry in the two groups.Results There were more glands and blood vessels in the stroma of endometriosis lesions and the endometrium of the model group.There was no statistically significant difference in ER α expression level between the endometriosis lesions of the EM model and the endometrium of the control group（P=0.107），but its expression level in the endometrium of the model group was obviously increased compared with the control group（P＜0.01）.The expression levels of ERβ，AP-1 and VEGF inthe endometriosis lesions and endometrium of the EM model were obviously increased compared with those of the control group（P＜0.01），but there was no statistically significant difference between the endometriosis lesions and endometrium of the EM model.Conclusions ER α and ER β are obviously increased in the endometrium of the EM rat model；but in the endometriosis lesions，only ER β is significantly increased.Moreover，the expressions of AP-1 and VEGF are up-regulated in the EM model.ER β may play a more important role than ER α in the occurrence of endometriosis.

endometriosis；animal model；estrogen receptor subtype；activator protein 1

R-332；R711.71

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.14.002

1005-8982（2016）14-0007-05

2016-04-06

河南省衛(wèi)生科技中青年創(chuàng)新人才工程資助項(xiàng)目（No：201004122）

劉玉玲，E-mail：zzlyl63@163.com