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        測(cè)定微藻油脂方法的比較研究

        2016-09-08 10:33:29張連水張慧霞齊樹亭張君王海風(fēng)
        河北漁業(yè) 2016年5期

        張連水 張慧霞 齊樹亭 張君 王海風(fēng) 張洪志

        摘要:以鹽藻為材料,通過(guò)便捷性和準(zhǔn)確性的比較對(duì)酸水解重量法、蘇丹黑B染色法、尼羅紅染色法進(jìn)行系統(tǒng)研究。為結(jié)合酸水解重量法和尼羅紅染色法作出染色藻種油脂含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線,實(shí)現(xiàn)尼羅紅染色法定量檢測(cè),同時(shí)對(duì)尼羅紅染色法進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)。

        關(guān)鍵詞:酸水解重量法;蘇丹黑B染色法;尼羅紅染色法;微藻油脂

        不同種類微藻的油脂含量差別很大,油脂含量從1%到70%不等,甚至同一種類的不同品系之間也存在很大的差別?,F(xiàn)在已知微藻有10 000余種,從中篩選出油脂含量高的微藻是一項(xiàng)繁重的工作,采用一種簡(jiǎn)便、快速、有效的微藻油脂提取方法無(wú)疑會(huì)事半功倍。目前,研究者常采用油脂提取方法有:酸熱法、索氏提取法、超臨界CO2萃取法(SCF.CO2法)和有機(jī)溶劑法,有報(bào)道利用這四種方法對(duì)真菌油脂進(jìn)行提取,并對(duì)提取結(jié)果進(jìn)行了比較,并得出對(duì)于微藻而言,尼羅紅是最為簡(jiǎn)單、快捷測(cè)定油脂的方法。

        本實(shí)驗(yàn)通過(guò)便捷性和準(zhǔn)確性的比較,對(duì)酸水解重量法、蘇丹黑B染色法、尼羅紅染色法進(jìn)行系統(tǒng)研究。為結(jié)合酸水解重量法和尼羅紅染色法作出染色藻種油脂含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線,實(shí)現(xiàn)尼羅紅染色法定量檢測(cè),同時(shí)對(duì)尼羅紅染色法進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)。

        1實(shí)驗(yàn)材料和方法

        1.1實(shí)驗(yàn)材料

        用于本實(shí)驗(yàn)的鹽藻由海洋中心藻種實(shí)驗(yàn)室提供。藻種使用前進(jìn)行超聲波破壁處理。由于在之后蘇丹黑B測(cè)定油脂含量、尼羅紅測(cè)定油脂含量中均需要繪制油脂含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線,所以此處藻種均進(jìn)行冷凍處理,使其生長(zhǎng)狀態(tài)及油脂含量基本保持在恒定狀態(tài)。

        1.2實(shí)驗(yàn)方法

        將實(shí)驗(yàn)用藻進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),每天測(cè)定藻樣620 nm處的吸光度,并且進(jìn)行血球計(jì)數(shù)板法平行計(jì)數(shù),繪制藻樣吸光度值與細(xì)胞密度的關(guān)系圖。分別用酸水解重量法、蘇丹黑B染色法、尼羅紅染色法對(duì)藻類進(jìn)行油脂含量測(cè)定。

        探究染色時(shí)間對(duì)染色后藻液細(xì)胞發(fā)射光譜的影響。取1.0 mg/mL的鹽藻藻液(之前經(jīng)過(guò)超聲波破壁處理),加人尼羅紅,使其最終質(zhì)量濃度為1μg/mL,37℃水浴避光染色一段時(shí)間(1、3、6、9、12、15、18、20 min),480 nm激發(fā)光下,測(cè)量580nm處熒光強(qiáng)度。同時(shí)探究尼羅紅質(zhì)量濃度對(duì)藻液細(xì)胞發(fā)射光譜的影響,取8份1.0 mg/mL的鹽藻藻液(之前經(jīng)過(guò)超聲波破壁處理),加入尼羅紅,使其最終質(zhì)量濃度為分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4μg/mL,37℃水浴避光染色9min,480 nm激發(fā)光下,測(cè)量580 nm處熒光強(qiáng)度。

        2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

        2.1藻體吸光度值與細(xì)胞密度的關(guān)系

        由圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出:鹽藻的個(gè)體數(shù)與吸光度值基本呈正比,不同濃度的鹽藻液與細(xì)胞密度之間的關(guān)系系數(shù)均較好。經(jīng)回歸分析,鹽藻的細(xì)胞密度與光密度之間成直線關(guān)系,由于鹽藻形狀規(guī)則,光密度與細(xì)胞密度之間的相關(guān)性很好。將鹽藻密度與吸光度值進(jìn)行回歸,回歸方程為:y=0.013 9x-0.0055,R2=0.9792。

        2.2酸水解法

        對(duì)鹽藻進(jìn)行酸水解法提取油脂測(cè)得不同梯度油脂含量,由此數(shù)據(jù)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線、回歸方程和判別系數(shù)如圖2。分析得到的判別系數(shù):

        R2=0.998 4,表明由兩變量相關(guān)性得到的回歸方程適配數(shù)據(jù),具有高度的擬合優(yōu)度。且ml=0.304,m2=0.301 5,相對(duì)誤差為0.82%。

        2.3藻體濃度與蘇丹黑B染色后A645的標(biāo)準(zhǔn)曲線

        由圖3分析得到的判別系數(shù)R2=0.9925,表明由兩變量相關(guān)性得到的回歸方程適配數(shù)據(jù),具有高度的擬合優(yōu)度。

        2.4蘇丹黑B染色后A645與油脂含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

        由圖4可分析得到判別系數(shù)R3=0.949 4,表明由兩變量相關(guān)性得到的回歸方程適配數(shù)據(jù),擬合優(yōu)度一般。且由可行性驗(yàn)證可知ml=3.097、m2=3.015。相對(duì)誤差為2.65%。

        由此可以判定經(jīng)蘇丹黑B染色處理的微藻細(xì)胞對(duì)645 nm波長(zhǎng)光具有最大吸收峰值。微藻油脂含量與經(jīng)蘇丹黑B染色處理后微藻細(xì)胞的吸光值A(chǔ)645呈一定程度的線性相關(guān)性,但存在一定誤差。

        2.5染色時(shí)間對(duì)藻液細(xì)胞發(fā)射光譜的影響曲線

        由圖5可知染色時(shí)間在8 min之前隨著時(shí)間的延長(zhǎng)相對(duì)熒光強(qiáng)度不斷增大,之后在8~15min之內(nèi)相對(duì)熒光強(qiáng)度基本無(wú)明顯變化,15 min之后相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯下降且下降幅度較大。由此可知最佳染色時(shí)間在8~9 min。

        2.6尼羅紅質(zhì)量濃度對(duì)藻液細(xì)胞發(fā)射光譜的影響曲線

        由圖6可知尼羅紅終濃度在0.7μg/mL之前隨著濃度的增加相對(duì)熒光強(qiáng)度不斷增大,之后尼羅紅濃度在O.7~1.2μg/mL之間相對(duì)熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化。尼羅紅濃度在1.2μg/mL之上時(shí)相對(duì)熒光強(qiáng)度緩慢下降,由此可知尼羅紅的最佳終濃度為0.7~1.0μg/mL。

        2.7三種方法的對(duì)比分析

        綜合實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)論對(duì)比分析三種方法的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn),如表1。

        3實(shí)驗(yàn)結(jié)論

        酸水解稱重法實(shí)驗(yàn)過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng),且需用到多種有機(jī)試劑具有毒性。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果最為準(zhǔn)確,且無(wú)論使用任何方法如需定量測(cè)定微藻內(nèi)油脂含量的大小,在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)均要用到此方法進(jìn)行協(xié)助。蘇丹黑B染色法較為簡(jiǎn)便,對(duì)實(shí)驗(yàn)藥品實(shí)驗(yàn)器材要求較低,但測(cè)量結(jié)果并不十分準(zhǔn)確,可以作為定性判斷微藻油脂含量的方法。尼羅紅染色法對(duì)藥品儀器要求較高,但實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)便,且實(shí)驗(yàn)精度高??梢宰鳛榭焖俣ㄐ耘袛辔⒃逵椭康姆椒?,也可結(jié)合稱重法作為同種藻種快速定量判斷的方法。染色時(shí)間對(duì)相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響:尼羅紅染色法的最佳染色時(shí)間在8~9 min。尼羅紅終濃度對(duì)相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響:尼羅紅染色法的尼羅紅的最佳終濃度為0.7~1.0μg/mL。

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