錢瑞+張壯志+孫娟+趙楠+潘金華+羅世菊+王偉偉

摘要：通過設(shè)置不同的培養(yǎng)條件，檢驗溫度、光照強度和光照周期對裙帶菜雌配子體生長的影響。第一步設(shè)置3個溫度條件（12℃、16℃、20℃）和5個光照強度條件（1000、1500、2000、2500、3000 lx）進行全析因方差設(shè)計，得出最適溫度條件和光照強度；第二步，在最適溫度條件下，設(shè)置2個光照周期（24 h持續(xù)光照和光暗周期D：L=12：12）和不同光照強度，檢驗不同光照強度條件和光照周期對配子體生長的影響。在以上實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)最適溫度條件和光照周期，設(shè)置不同光照強度檢驗其對配子體鮮重量生長的影響。實驗結(jié)果顯示：裙帶菜雌配子體最適宜的在溫度為16℃，光照強度為2500 lx，周期為24 h持續(xù)光照。

關(guān)鍵詞：溫度；光照；光照周期，裙帶菜雌配子體；生長

裙帶菜（Undaria pinnatifida）是一種一年生褐藻，隸屬于海帶目，生活在潮下帶。裙帶菜是我國黃渤海海域的山東半島、遼東半島重要栽培海藻之一，在黃渤海海域范圍內(nèi)，其產(chǎn)業(yè)規(guī)模僅次于海帶，與海帶、紫菜并稱中國三大經(jīng)濟海藻。我國產(chǎn)裙帶菜早年主要向日本出口，近年來國內(nèi)消費迅速增長，成為人們喜愛的“海洋堿性蔬菜”。裙帶菜生活史分為孢子體世代和配子體世代，國內(nèi)對裙帶菜的基礎(chǔ)生物學研究已經(jīng)比較清楚，大大加快了國內(nèi)裙帶菜苗種生產(chǎn)的步伐。裙帶菜生活史中具有明顯的世代交替，分為孢子體世代和配子體世代，裙帶菜苗種培育既可以利用孢子體采苗，也可以利用保存的配子體進行育苗，采用配子體克隆進行幼苗培育，可以避免只能由孢子體采苗獲得配子體的季節(jié)性限制，可以隨時為裙帶菜遺傳育種和其他基礎(chǔ)研究提供實驗材料。因此裙帶菜配子體的快速擴增培養(yǎng)成為其有效利用的重要前提，本研究對影響裙帶菜♀配子體的溫度、光照強度和光照周期條件進行了實驗研究，以期為裙帶菜配子體克隆快速擴增培養(yǎng)提供基礎(chǔ)指導。

1材料和方法

1.1材料來源

裙帶菜配子體克隆細胞（♀）來自國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心，在光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)條件為20±2℃，光強1 500～2 000 lx，24 h持續(xù)光照。培養(yǎng)液為自然海水加煮沸消毒，然后添加N和P營養(yǎng)鹽（NaNOs 60 mg/L，KH2 P04 10mg/L），煮沸消毒后備用。

1.2實驗設(shè)置

1.2.1溫度和光照強度對裙帶菜配子體生長影響 設(shè)置光照培養(yǎng)箱溫度12℃、16℃和20℃，光照強度1000，1500，2000，2500和3000 lx，光照周期24 h持續(xù)光照，共15個組合，每組3個重復，共45個樣本。將裙帶菜配子體（雌配子體，下文提到配子體均指裙帶菜雌配子體），轉(zhuǎn)入100mL三角燒瓶，用超聲波破碎儀（型號：JY92-IIN）打碎，經(jīng)300目篩絹過濾至500 mL燒杯中。加入培養(yǎng)液至300 mL稀釋，用移液管均勻吸入8mL分別放人45套120 mm培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)皿裝入90 mL培養(yǎng)液，分別進入光照培養(yǎng)箱內(nèi)各實驗組合。每5 d更換培養(yǎng)液一次，每次更換總體積的60%左右。持續(xù)觀測4周時間。實驗結(jié)束后，采用倒置顯微鏡對各實驗組樣品進行拍照（O-lympus IX51），然后利用軟件Image pro測量各實驗組裙帶菜配子體細胞系長度。

1.2.2光照周期對配子體生長的影響 在溫度和光照強度對裙帶菜配子體實驗研究的基礎(chǔ)上，篩選出適合的溫度條件和光照強度條件之后，根據(jù)最適溫度件，設(shè)置不同光照周期和光照強度，檢驗不同光照周期和光照強度條件下裙帶菜配子體生長和發(fā)育狀態(tài)。經(jīng)過上面實驗發(fā)現(xiàn)16℃條件最適合裙帶菜配子體生長。設(shè)置光照培養(yǎng)箱溫度16℃，光照強度為1 000、1 500、2 000、2 500和3 000 lx，光照周期為D：L=12：12 h和24 h持續(xù)光照，溫度為16℃，共10個組合，每個組合設(shè)置3個平行，共30個樣本。樣本準備方法同1.2.1。培養(yǎng)2周之后，觀測各實驗條件下裙帶菜配子體生長長度。

1.2.3不同光照條件下配子體生長鮮重影響溫度條件定為16℃，光照周期為24D h，光照強度500、1500、2 500、3 500和4 500 lx，共5個實驗組合，每個實驗組合設(shè)置3個平行，共15個樣本。配子體的準備方法同1.2.1，用移液管均勻吸入10 mL分別放人15個三角燒瓶中。每5 d左右更換1次培養(yǎng)液，每次更換量為三角燒瓶中的培養(yǎng)液量的60%。三角燒瓶中克隆質(zhì)量相同（鮮重50 mg），培養(yǎng)12周后測量（分析天平XSE205DU）培養(yǎng)皿中克隆質(zhì)量。

1.3統(tǒng)計分析

采用雙因素方差分析檢驗溫度和光照強度對裙帶菜配子體生長的影響，以及光照周期和光照強度對配子體生長的影響。采用單因素方差分析檢驗光照強度對配子體鮮重生長的影響。顯著水平設(shè)為P<0.05。統(tǒng)計分析均在SPSS13.0進行。

2實驗結(jié)果

2.1溫度和光照強度對裙帶菜配子體生長影響

初期超聲波打碎克隆受損，在所實驗的3個溫度條件下，光照強度低的實驗組合生長較快，其中20℃更為明顯；培養(yǎng)10 d后，16℃和2 500 lx條件下配子體細胞生長最快，溫度為20℃和12℃的條件下1 500 lx的光照強度生長較好；培養(yǎng)21 d后，16℃和2 500 lx條件下配子體生長最快。12℃和2 500 lx條件下的配子體細胞生長較好，溫度為20℃時，光照強度1500 lx的條件下的克隆細胞生長較好。經(jīng)過3周的培養(yǎng)，最終測得在16℃和光照強度2 500 lx條件下，裙帶菜配子體細胞生長長度最大平均長度達2364μm（圖1）。在實驗條件下，裙帶菜雌配子體最適生長溫度和光照強度條件分別為16℃和2 500 lx。（不同小寫字母表不差異顯著，ANOVA，P<0.05.平均值±標準差）

2.2光照周期對配子體生長的影響

16℃條件下，光照周期為12 L：12 D時培養(yǎng)前期生長較好，但是隨著培養(yǎng)時間增長，從低光到光逐步發(fā)現(xiàn)裙♀配子體樣本發(fā)育長出幼孢子體（圖2），因此在光暗交替的光照周期為12L：12D的條件下，會誘發(fā)裙♀孤雌生長，不適宜裙帶菜雌性配子體的培養(yǎng)。而在光照周期為24持續(xù)光照條件下，光照強度為2 000 lx時，配子體細胞系生長最快，配子體細胞最大平均長度達到680.8tim，但是2000 lx和2 500 1x實驗組之間差異不顯著（圖3）。

2.3不同光照條件下配子體生長鮮重影響

在溫度為16℃，光照周期24 h持續(xù)光照，經(jīng)過7周的培養(yǎng)，在2 500 lx光照強度條件下，裙帶菜雌配子體鮮重量生長速度最快，達到0.31 g（圖4）。實驗表明克隆細胞打碎平均分配12周后在光照強度為2 500 lx的條件下生長最快，質(zhì)量最重。

3結(jié)論

本研究通過實驗設(shè)計了不同溫度、光照強度和光照周期條件，檢驗其對裙帶菜雌配子生長的影響。實驗結(jié)果顯示在溫度為16℃，光照周期為24 h持續(xù)光照時，光照強度為2 500 lx時，最適宜裙帶菜雌配子生長。實驗過程中應該注意將裙帶菜配子體擴培粉碎后，應該先放人1000 lx的條件下培養(yǎng)5 d左右進行恢復，恢復后再分流進入各個實驗組合。實驗過程中還發(fā)現(xiàn)，裙帶菜雌配子體在具有光暗周期的條件下，會產(chǎn)生配子體直接轉(zhuǎn)化為孢子體的“孤雌生殖”現(xiàn)象。本實驗采用的光照黑暗周期為L：D=12 h：12 h，其它光暗交替周期對裙帶菜雌配子體孤雌生殖的影響有待于進一步研究。同時，裙帶菜雌配子體孤雌生殖產(chǎn)生的幼孢子體后代長大后的形狀表現(xiàn)也值得進一步深入研究，這或許為裙帶菜新品種開發(fā)和培育提供了一種新的思路和方法。