儲(chǔ)雯雯，劉　周，楊　凱，管世鶴

碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌耐藥機(jī)制及分子流行病學(xué)研究

儲(chǔ)雯雯，劉周，楊凱，管世鶴

目的 探討臨床分離的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的耐藥基因及分子流行病學(xué)研究。方法 收集并鑒定臨床分離非重復(fù)碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌株44株。采用Vitek 2 compact全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析儀鑒定進(jìn)行常規(guī)藥敏試驗(yàn)，改良Hodge試驗(yàn)檢測(cè)KPC型碳青霉烯酶，EDTA協(xié)同法檢測(cè)金屬β-內(nèi)酰胺酶，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法檢測(cè)細(xì)菌攜帶的耐藥基因。腸桿菌基因間重復(fù)性共有序列ERIC-PCR對(duì)菌株進(jìn)行同源性分析，了解其分子流行病學(xué)特征。結(jié)果44株肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類、青霉素類、頭孢菌素類和氨曲南等抗菌藥物顯示了較高的耐藥性。改良Hodge試驗(yàn)陽性41株，金屬酶檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。PCR結(jié)果顯示，臨床分離的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌以KPC-2型為主，共42株。ERIC-PCR將44株肺炎克雷伯菌分為14型，以Ⅰ型為主，共18株，集中于重癥監(jiān)護(hù)室（ICU）和神經(jīng)外科。結(jié)論分離的碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌對(duì)臨床常用抗菌藥物表現(xiàn)出高水平耐藥；其耐藥機(jī)制主要是該類細(xì)菌產(chǎn)KPC-2碳青霉烯酶，ICU與其它科室的患者頻繁轉(zhuǎn)診治療可能是導(dǎo)致碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌在全院范圍播散流行的主要原因。

肺炎克雷伯菌；碳青霉烯酶；ERIC-PCR；KPC-2

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-5-9 15：43：10 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.022.html

肺炎克雷伯菌作為在臨床常見的院內(nèi)感染致病菌之一，主要引起肺炎、敗血癥、尿路炎癥等疾病，現(xiàn)在臨床治療產(chǎn)ESBL及多重耐藥肺炎克雷伯菌感染的首選藥物是碳青霉烯類抗生素，但是近年來因?yàn)樘记嗝瓜╊惪股胤簽E性的應(yīng)用，碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumonia，CRKP）的比例逐漸增高，呈全球播散趨勢(shì)，成為臨床抗感染治療的嚴(yán)重威脅［1-2］。尤其在我國(guó)，CRKP分離率更是逐年攀升，正在以極其迅猛的速度流行，而導(dǎo)致其廣泛播散的主要原因則是碳青霉烯酶可廣泛水解包括碳青霉烯類抗生素在內(nèi)的所有β-內(nèi)酰胺類抗生素，并且因?yàn)榭梢员毁|(zhì)粒攜帶而導(dǎo)致大范圍的流行［3］，在對(duì)臨床治療帶來極大挑戰(zhàn)的同時(shí)也給臨床耐藥方面帶來了嚴(yán)重的問題。該研究在深入了解CRKP中碳青霉烯酶的分布情況、耐藥機(jī)制及其分子流行病學(xué)特征的基礎(chǔ)上，根據(jù)其同源性分析院內(nèi)感染流行現(xiàn)狀，為有效控制CRKP的流行提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌株來源 收集2013年2月～2015年6月安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院臨床標(biāo)本中分離的非重復(fù)CRKP 44株。菌株經(jīng)Vitek 2 compact全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析儀鑒定及藥敏試驗(yàn)，按美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）2013版標(biāo)準(zhǔn)判定，篩選出對(duì)碳青霉烯類藥物非敏感菌。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705和ATCCBAA-1706購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。金屬酶陽性菌株為產(chǎn)IMP-1型金屬酶的銅綠假單胞菌。

1.2儀器與試劑 全自動(dòng)微生物鑒定儀Vitek 2 compact購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司；Flexcycler型梯度PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自德國(guó)Analytikjena公司；Tanon1600型全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司；電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-red公司；PCR引物由上海生物工程有限公司合成；PCR實(shí)驗(yàn)過程試劑、電泳用DNA Marker、PCR Master Mix（2×）等相關(guān)試劑購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；美洛培南紙片（10 μg/片）和亞胺培南（30 μg/片）購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司。

1.3藥敏實(shí)驗(yàn) 采用法國(guó)梅里埃公司GN13鑒定藥敏復(fù)合板進(jìn)行常規(guī)藥敏試驗(yàn)，檢測(cè)抗菌藥物包括：頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢他啶、氨曲南、慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南、厄他培南，美洛培南用K-B法進(jìn)行檢測(cè)，大腸埃希菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株，操作方法及結(jié)果判斷參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)。

1.4改良Hodge試驗(yàn) 先調(diào)0.5麥?zhǔn)蠁挝坏拇竽c埃希菌（ATCC25922）菌液，然后將稀釋10倍的菌液均勻涂布在MH瓊脂平板上，將美洛培南紙片（10 μg/片）貼在中間位置后用接種環(huán)挑取新鮮待測(cè)菌株從紙片邊緣向外劃直線，要求直線呈放射樣分布。35℃培養(yǎng)18～24 h，美洛培南抑菌圈處出現(xiàn)被檢菌增強(qiáng)（矢狀）生長(zhǎng)者為改良Hodge試驗(yàn)陽性，提示該菌株產(chǎn)碳青霉烯酶。

1.5EDTA協(xié)同試驗(yàn)檢測(cè)金屬酶 采用亞胺培南和乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）紙片的雙紙片協(xié)同法。按K-B法涂布新鮮待測(cè)菌于MH瓊脂平板，在MH瓊脂平板一側(cè)貼一張亞胺培南紙片（30 μg/片），并將一張空白紙片貼在亞胺培南紙片另一側(cè)，使兩紙片邊緣之間的距離為10～15 mm，然后在空白紙片上滴加0.5 mol/L的EDTA溶液10 μl，置35℃孵育24 h后觀察結(jié)果，在含EDTA的空白紙片方向處亞胺培南抑菌圈擴(kuò)大者，為協(xié)同試驗(yàn)陽性，可判定該菌株產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶［4］。

1.6耐藥基因檢測(cè) 煮沸法提取細(xì)菌DNA，PCR方法擴(kuò)增KPC-2及其他常見的碳青霉烯耐藥基因如NDM-1、SME、OXA-48、GES、VIM、IMP等，PCR擴(kuò)增引物條件參考文獻(xiàn)［5］，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系共50 μl，25 μl PCR mix試劑，10 μmol/L上、下游引物各1 μl，DNA模板1 μl，雙蒸水22 μl。反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min，95℃、30 s，55℃、30 s，72℃、50 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)顯像觀察結(jié)果。

表1　目的基因引物序列及長(zhǎng)度

1.7染色體DNA同源性分析 腸桿菌基因間重復(fù)共有序列ERIC-PCR分析耐藥菌株同源性，ERICPCR引物序列［6-7］為ERIC-1：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′；ERIC-2：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃、45 s，40℃、1 min，65℃、8 min，30個(gè)循環(huán)，最后延伸65℃、16 min，產(chǎn)物經(jīng)12 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分析。

2　結(jié)果

2.1菌株來源及分布 44株菌株主要來自于重癥監(jiān)護(hù)室（ICU）（10例）、呼吸內(nèi)科（6例）、神經(jīng)內(nèi)科（2例）、神經(jīng)外科（13例）、急診內(nèi)科（2例）、急診ICU（EICU）（4例）、泌尿外科（1例）、普外科（1例）、血液內(nèi)科（4例）、肝病科（1例）等，標(biāo)本類型為痰（31例）、尿液（7例）、全血（3例）、腹水（1例）、腦脊液（1例）及切口分泌物（1例）。

2.2抗菌藥物敏感度試驗(yàn)結(jié)果 44株CRKP經(jīng)藥敏鑒定后均表現(xiàn)為對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥，有95%以上的CRKP對(duì)頭孢類藥物耐藥，見表2。

表2　CRKP對(duì)15種抗菌藥物的耐藥性分析［n=44，n（%）］

2.3改良Hodge試驗(yàn)與EDTA協(xié)同試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果44株肺炎克雷伯菌中改良Hodge試驗(yàn)陽性41株，陽性率93.2%，EDTA協(xié)同試驗(yàn)檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。見圖1。

2.4耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 PCR結(jié)果顯示KPC-2陽性檢出率最高為42株，見圖2。未檢出NDM-1、SME、IMP、OXA-48、VIM、GES陽性菌株。

2.5同源性分析結(jié)果 用ERIC-PCR的方法對(duì)44株CRKP DNA擴(kuò)增，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的條帶的結(jié)果進(jìn)行基因分型，根據(jù)細(xì)菌同源性標(biāo)準(zhǔn)［8］，44耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌產(chǎn)生的擴(kuò)增條帶數(shù)在3～7，形成指紋圖譜，見圖3。44株肺炎克雷伯菌根據(jù)ERIC-PCR產(chǎn)物電泳分為14個(gè)亞型：Ⅰ型18株、Ⅱ型5株、Ⅲ型4株、Ⅳ型3株、Ⅴ～Ⅷ型各2株、Ⅺ～XIV型各1株，各型的臨床分布見圖4。

圖1　表型實(shí)驗(yàn)A：Hodge試驗(yàn)；B：EDTA協(xié)同試驗(yàn)

圖2　部分分離肺炎克雷伯菌株KPC-2基因瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果M：DL 2000 DNA Marker；P：陽性對(duì)照，肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705；N：陰性對(duì)照，肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1706；1～11：KPC-2基因陽性菌株；12：KPC-2基因陰性菌株

圖3　部分耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的ERIC-PCR指紋圖譜M：DL 2000 DNA Marker；1～21：1～21號(hào)肺炎克雷伯菌株指紋圖譜

圖4　14型CRKP各科室分布情況

3　討論

肺炎克雷伯菌感染在臨床非常常見，通過翻閱臨床病例資料，顯示在感染肺炎克雷伯菌的患者里，大部分進(jìn)行過有創(chuàng)性操作包括深靜脈置管、氣管插管、胃腸減壓或者患有腸梗阻、腸穿孔等致腸道菌群明顯異位的疾病，從而反映出肺炎克雷伯菌條件性致病菌的特點(diǎn)—易發(fā)生于免疫力低的老年人或嬰幼兒、有基礎(chǔ)疾?。ㄌ悄虿』蚰I病）、住院時(shí)間較長(zhǎng)、接受有創(chuàng)性醫(yī)療操作的患者，特別是ICU的患者更是易感人群。通過每年細(xì)菌耐藥網(wǎng)監(jiān)測(cè)，碳青霉烯類藥物在治療肺炎克雷伯菌的同時(shí)也造成細(xì)菌耐藥率逐年增高，CRKP引起的感染在細(xì)菌感染性疾病中所占的比重也日漸增加，其嚴(yán)峻形勢(shì)已不容樂觀［9］。

本研究中，44株CRKP對(duì)頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南的耐藥率都為90%～100%，對(duì)阿米卡星的耐藥率為68.2%，對(duì)左氧氟沙星、環(huán)丙沙星的耐藥率為65.9%和72.7%，對(duì)培南類藥物的耐藥率為97%～100%，符合KPC酶能夠水解各種臨床常規(guī)使用抗菌藥物的報(bào)道［10］，以上數(shù)據(jù)表明我院分離的CRKP多為高水平耐藥的多重耐藥菌。

44株臨床分離的CRKP，改良Hodge試驗(yàn)陽性有41株，陽性檢出率為93.1%。而根據(jù)碳青霉烯酶基因檢測(cè)共檢出42株基因陽性菌株，檢出率為95.5%，以上數(shù)據(jù)表明KPC-2基因檢測(cè)的陽性率比改良Hodge試驗(yàn)高，因此在碳青霉烯酶的初步篩查中可以做改良Hodge試驗(yàn)，若要進(jìn)一步區(qū)分確認(rèn)還需做碳青霉烯酶基因檢測(cè)。

碳青霉烯酶的基因位于可轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒上，依靠多種基因元件進(jìn)行傳播，獲得性耐藥基因和可移動(dòng)遺傳元件是引起肺炎克雷伯耐藥的重要機(jī)制［11-12］，這也是多重耐藥菌株易于傳播的重要原因［13］。CRKP有多種耐藥機(jī)制，包括產(chǎn)碳青霉烯類水解酶，外膜蛋白缺失，產(chǎn)大量ESBL或AmpC酶，細(xì)菌細(xì)胞壁上PBP改變，產(chǎn)生主動(dòng)外排泵等，其中產(chǎn)碳青霉烯水解酶占主要因素，特別是KPC-2、NDM型碳青霉烯酶是醫(yī)院感染重點(diǎn)關(guān)注對(duì)象。本研究中表明我院KPC-2型碳青霉烯酶的檢出率為95.5%，說明在產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌已在我院成流行趨勢(shì)。

結(jié)合ERIC-PCR結(jié)果，根據(jù)臨床流行病學(xué)資料分析，本研究中產(chǎn)KPC-2酶的肺炎克雷伯菌主要有兩個(gè)克隆群出現(xiàn)院內(nèi)播散，分別是Ⅰ型和Ⅱ型克隆群。其中Ⅰ型克隆群是最主要的型別，涉及神經(jīng)外科、ICU、血液內(nèi)科、神經(jīng)內(nèi)科和普外科，從2013年5月～12月均有流行，估計(jì)與ICU頻繁出現(xiàn)與其它科室的患者相互轉(zhuǎn)診治療的情況有關(guān)，其可能是導(dǎo)致該菌株在全院范圍播散流行的主要原因［14］。因此，其可能是導(dǎo)致Ⅰ型克隆菌株播散至全院的中間關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在Ⅰ型克隆群中可以明顯發(fā)現(xiàn)在ICU和神經(jīng)外科病房的菌株播散現(xiàn)象。神經(jīng)外科一般以腦外傷患者居多，手術(shù)難度大，術(shù)后病情需要多方位監(jiān)護(hù)，需在術(shù)后進(jìn)ICU觀察。而其他入住ICU的患者主要為病情嚴(yán)重和免疫水平低下者，易反復(fù)感染而需要長(zhǎng)期使用多種抗菌藥物治療，使ICU病區(qū)成為多重耐藥菌容易爆發(fā)流行的地方，也是造成克隆株流行的原因［15］。Ⅱ型克隆群涉及ICU、神經(jīng)外科和神經(jīng)內(nèi)科。也可見Ⅱ型克隆群在ICU內(nèi)有短期傳播流行現(xiàn)象發(fā)生。其它各克隆群主要是散發(fā)于臨床科室，并未造成播散流行。因此，使用抗菌藥物治療前，要做好藥敏檢測(cè)工作，同時(shí)將環(huán)境的清潔與消毒做到位，已感染患者和未感染患者隔離開等，阻斷該類耐藥菌的傳播。

為了預(yù)防院內(nèi)感染和多重耐藥菌在院內(nèi)傳播和暴發(fā)流行，臨床醫(yī)師和檢驗(yàn)科醫(yī)師應(yīng)協(xié)同合作、加強(qiáng)彼此間溝通；微生物室增加藥敏檢測(cè)的種類，為臨床醫(yī)師提供更多的選擇；協(xié)助院感辦對(duì)臨床進(jìn)行監(jiān)督。為了減少耐藥菌株的出現(xiàn)，檢驗(yàn)科要提供準(zhǔn)確藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果，臨床醫(yī)師在此基礎(chǔ)上結(jié)合病情合理用藥，尤其是要高效廣譜類的抗菌藥物一定要慎重，以防發(fā)生可選用抗菌藥物非常有限甚至無藥可用的情況。

綜上所述，早期預(yù)防和治療是阻止院內(nèi)感染和多重耐藥菌院內(nèi)傳播的重中之重，只有科學(xué)使用抗菌藥物，加強(qiáng)對(duì)多重耐藥菌的監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)研究，并及時(shí)采取有效措施才能預(yù)防該類細(xì)菌導(dǎo)致醫(yī)院感染的流行。

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Analysis of Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae molecular epidemiology and antibiotic resistance gene

Chu Wenwen，Liu Zhou，Yang Kai，et al
（Dept of Clinical Laboratory，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

Objective To investigate the molecular epidemiology characteristics and drug resistance genes of imi-penem-resistant Klebsiella pneumoniae isolated.Methods A total of 44 strains of Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae were collected and identified.Conventional drug susceptibility test was made by Vitek 2 compact automatic microbe susceptibility analyzer appraisal.Susceptibility testing for antibiotics was performed by the disc diffusion method carbapenemase production was confirmed by modified Hodge test and MBL production by IPM/IPMEDTA combined disc test.The resistant genes were detected by PCR.Molecular epidemiology characteristics were analyzed by enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence（ERIC）-polymerase chain reaction（PCR）.Results A total of 44 strains of bacteria showed a high level resistance to routine antibiotics including carbapenems，penicillins，cephalosporin and aztreonam.A total of 41 strains were positive in modified Hodge test and all the 44 strains were negative to enzyme detection test.PCR result showed that 42 strains were of KPC-2 type，none of other gene types.ERIC-PCR result showed that 44 strains of Klebsiella pneumoniae were divided into 14 types，and the main type was type I.18 strains belonged to type I from ICU and neurosurgery.Conclusion Klebsiella pneumoniae that resists to carbapenem shows high levels of resistance to routine antibiotic in our hospital.Strains of carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae appear，KPC-2 is the main reason to cause the bacterial resistance to carbapenems. Frequent transfer treatment of the patients among ICU and other clinical departments is the primary factor of carbapenem-resistant Klebsiella pneumonia epidemic in the entire hospital.

Klebsiella pneumoniae；carbapenemases；ERIC-PCR；KPC-2

R 378.1

A

1000-1492（2016）06-0809-05

2016-04-14接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81171662）

安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，合肥 230601

儲(chǔ)雯雯，女，檢驗(yàn)主管技師，碩士研究生；管世鶴，男，教授，主任技師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：shiheguan@126.com