王少濱，張　輝，李小波，劉　杰，杜怡斌，尹宗生

EPO/EPOR信號通路對成體脊髓神經(jīng)干細胞分化作用的實驗研究

王少濱1，張輝2，李小波2，劉杰2，杜怡斌2，尹宗生1

目的 研究促紅細胞生成素（EPO）及其受體（EPOR）信號通路對大鼠成體脊髓神經(jīng)干細胞（NSCs）分化的影響。方法 取成年SD大鼠脊髓細胞，在培養(yǎng)基DMEM/ F12中進行培養(yǎng)，取第3代NSCs作為研究對象：在實驗組的培養(yǎng)液中再加入重組人促紅細胞生成素（rhEPO），同時在培養(yǎng)液中使用等體積生理鹽水作為對照組。采用免疫熒光染色方法和Western blot法，檢測NSCs上EPOR蛋白表達情況；采用免疫熒光染色法檢測NSCs的分化現(xiàn)象。結(jié)果 免疫熒光染色結(jié)果顯示實驗組與對照組NSCs中均有EPOR蛋白表達，實驗組較對照組增強；Western blot結(jié)果顯示實驗組EPOR蛋白表達水平較對照組增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；免疫熒光染色法顯示實驗組NSCs 分化為神經(jīng)元的比例高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論rhEPO能激活EPO/EPOR信號通路，從而提高成體脊髓NSCs向神經(jīng)元分化的能力。

神經(jīng)干細胞；促紅細胞生成素；分化；促紅細胞生成素受體

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-5-9 15：43：10 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.020.html

促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）是一種人體腎小管周圍細胞分泌的糖蛋白激素，具有刺激骨髓造血的功能。EPO/EPO受體（EPOR）不僅存在于紅細胞，在非造血組織中也廣泛存在［1-3］。研究［4］表明，EPO與其特異性受體EPOR結(jié)合，形成二聚體，觸發(fā)鄰近的JAK2酪氨酸激酶分子磷酸化，使其激活，進一步引發(fā)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。既往研究［5-6］表明，適當(dāng)濃度EPO可促進胚胎神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）向神經(jīng)元分化。然而，目前國內(nèi)外尚未見EPO在成體脊髓神經(jīng)干細胞中的相關(guān)研究。該研究以成體脊髓NSCs為研究對象，借助重組人促紅細胞生成素（recombinant human erythropoietin，rhEPO）作用于成體脊髓NSCs，通過EPO激活EPO/EPOR信號通路，對成體脊髓NSCs的分化過程進行研究，為進一步研究EPO用于神經(jīng)損傷修復(fù)提供實驗基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1成體脊髓神經(jīng)干細胞供體動物 成年SD大鼠，SPF級，200 g左右，雌雄不限，由安徽省實驗動物中心提供。

1.2主要試劑 rhEPO購自上海麒麟生物公司；DMEM/F12（1∶1）培養(yǎng)基、B27、左旋谷氨酸（L-glutamine）購自美國Gibco公司；堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）購自美國Peprotech公司；EPOR抗體購自北京博奧森生物公司；大鼠抗巢蛋白（Nestin）抗體、大鼠抗微管相關(guān)蛋白2（microtubule associated protein 2，MAP-2）抗體購自美國Santa Cruz公司；兔抗神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（glia fibrillary acid protein，GFAP）抗體購自英國Abcam公司；多聚賴氨酸購自美國Sigma公司；胎牛血清購自杭州四季青生物公司；二抗購自北京中杉金橋生物公司。

1.3方法

1.3.1成體脊髓NSCs分離、培養(yǎng)與鑒定

1.3.1.1成體脊髓NSCs分離與培養(yǎng) 200 g左右SD大鼠，頸椎脫臼處死后，無菌條件下取出胸腰段脊髓，剝離除去軟脊膜和血管，剪碎并吹打成單細胞懸液，加入NSCs培養(yǎng)基（DMEM/F12+2%B27+20 μg/ml EGF+20 μg/ml bFGF）中，根據(jù)細胞狀態(tài)每2～3 d半量換液1次，培養(yǎng)7 d形成原代神經(jīng)球；原代神經(jīng)球經(jīng)機械吹打后，形成神經(jīng)干細胞的單細胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，并通過培養(yǎng)液調(diào)整使其細胞密度為1×105/ml，再次傳代培養(yǎng)7 d后得到第3代神經(jīng)球。

1.3.1.2NSCs的免疫熒光鑒定 取培養(yǎng)的第3代神經(jīng)球液體，放入24孔培養(yǎng)板中的預(yù)選包被多聚賴氨酸玻片上，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)3 h，使其充分貼壁且不分化。然后吸盡液體，用多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗，加入羊血清封閉40 min后，吸棄血清，加入一抗Nestin（1∶100），4℃孵育過夜，次日PBS洗3次，加入相應(yīng)二抗進行熒光染色，避光條件下作用1 h，Hoechst 33258標(biāo)記細胞核，取出玻片并封片，在熒光顯微鏡下觀察NSCs標(biāo)記物的熒光。

1.3.2實驗分組、EPOR檢測與神經(jīng)元數(shù)目比值計算方法

1.3.2.1神經(jīng)球?qū)嶒灧纸M 分為兩組：實驗組，為了激活EPO/EPOR信號通路，在第3代NSCs增殖期間，根據(jù)前期工作及參考文獻［5］，培養(yǎng)液中加入濃度為10 IU/ml的rhEPO，作用24 h后，將培養(yǎng)液重新更換為NSCs培養(yǎng)基，以消除培養(yǎng)液中rhEPO的影響，繼續(xù)培養(yǎng)形成實驗組神經(jīng)球；對照組，用等量生理鹽水替代rhEPO，相同條件下形成對照組神經(jīng)球。

1.3.2.2NSCs及其EPOR的免疫熒光觀測 分別將實驗組、對照組神經(jīng)球吸出，移入到24孔培養(yǎng)板中的玻片上，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)3 h，使其充分貼壁且不分化，再加入一抗Nestin（1∶100）及EPOR抗體（1∶100），4℃孵育過夜，次日PBS洗3次，加入相應(yīng)二抗進行熒光染色，在顯微鏡下觀測兩組實驗中的NSCs以及EPOR標(biāo)志物的熒光。

1.3.2.3NSCs中EPOR的蛋白表達 分別將實驗組和對照組神經(jīng)球吸出，提取各自NSCs總蛋白，采取Western blot法檢測EPOR蛋白表達量，先進行SDS-PAGE電泳、PVDF膜轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉，加一抗EPOR（兔抗1∶500）以及內(nèi)參一抗β-actin（鼠抗1∶1 000），4℃孵育過夜，次日TPBS洗膜3次，PBS洗膜1次，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的EPOR對應(yīng)二抗（羊抗兔1∶10 000）以及β-actin對應(yīng)二抗（羊抗鼠1∶10 000），室溫孵育2 h，TPBS洗膜3次，PBS洗膜1次，加ECL顯影液，獲得實驗Western blot條帶圖，并用Image J軟件測量蛋白條帶的灰度值，以EPOR蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度值比值作為EPOR蛋白的相對表達量，重復(fù)4次。

1.3.2.4NSCs分化實驗與神經(jīng)元比值計算 將實驗組和對照組神經(jīng)球吸出，分別轉(zhuǎn)移到24孔培養(yǎng)板中的玻片上，加入含血清的NSCs分化培養(yǎng)基（DMEM/F12+2%B27+10%胎牛血清），培養(yǎng)7 d后，加入一抗MAP-2和GFAP，4℃孵育過夜，次日PBS洗3次，加入相應(yīng)二抗進行熒光染色，對NSCs分化形成的神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細胞進行熒光染色，再加入Hoechst 33258（10 μg/ml）處理40 min，對所有的細胞核進行熒光染色，在顯微鏡下觀察并拍照。神經(jīng)元數(shù)目比值計算方法：在顯微鏡下，隨機取20個視野，計算MAP-2與Hoechst 33258雙標(biāo)陽性的細胞數(shù)，以及僅Hoechst 33258陽性細胞數(shù)目，計算其比值，定義為神經(jīng)元數(shù)目比值。兩組實驗分別獲得實驗組、對照組的神經(jīng)元數(shù)目比值。

圖1　第2代NSCs生長情況A：1 d×200；B：3 d×200；C：6 d×200；D：6 d×400

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進行分析，計量資料以±s表示，組間資料比較采取t檢驗。

2　結(jié)果

2.1成體脊髓NSCs分離、培養(yǎng)與鑒定 第3代NSCs培養(yǎng)過程中光鏡下可見，培養(yǎng)1 d時存在大量圓形懸浮細胞，培養(yǎng)第3天出現(xiàn)了大量細胞聚集，呈不規(guī)則團狀，培養(yǎng)至第6天時，增殖聚集成為體積更大的球狀細胞團（圖1）。倒置熒光顯微鏡下觀察球狀細胞團熒光染色的結(jié)果，可見細胞球內(nèi)存在大量通過Nestin標(biāo)記的NSCs，以及被Hoechst 33258標(biāo)記的有核細胞，表明所見的球狀細胞團包含NSCs（圖2）。

圖2　NSCs的免疫熒光鑒定結(jié)果 ×400A：Hoechst 33258標(biāo)記細胞核；B：Nestin標(biāo)記NSCs；C：合成圖像

2.2NSCs及其EPOR的免疫熒光觀測 在倒置熒光顯微鏡下觀察到的實驗組和對照組NSCs及其EPOR熒光染色結(jié)果（圖3），被EPOR抗體標(biāo)記的EPOR顯示為紅色，被Nestin標(biāo)記的NSCs顯示為綠色，并且兩者形態(tài)相同，表明NSCs上有EPOR表達；對照組NSCs中存在EPOR；圖3A1單個神經(jīng)球表面的EPOR抗體標(biāo)記的熒光強度較圖3A2強。

2.3NSCs中EPOR蛋白表達Western blot結(jié)果實驗組和對照組NSCs均可表達EPOR蛋白（圖4）；定量分析結(jié)果顯示，實驗組EPOR蛋白相對表達量（0.96±0.12）較對照組（0.63±0.13）顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-3.81，P＜0.01），見圖4。

圖3　EPOR的免疫熒光觀察 ×200A：EPOR抗體標(biāo)記EPOR；B：Nestin標(biāo)記NSCs；C：合成圖像；1：實驗組；2：對照組

圖4　EPOR蛋白表達情況與對照組比較：**P＜0.01

圖5　NSCs分化顯微鏡觀測結(jié)果 ×200A：Hoechst 33258標(biāo)記細胞核；B：GFAP標(biāo)記星形膠質(zhì)細胞；C：MAP-2標(biāo)記神經(jīng)元；D：合成圖像；1：實驗組；2：對照組

2.4NSCs分化實驗與神經(jīng)元數(shù)目比值計算結(jié)果分化實驗免疫熒光結(jié)果顯示：被Hoechst 33258標(biāo)記的細胞核呈藍色，被GFAP標(biāo)記的星型膠質(zhì)細胞呈紅色，并具有星型特征，被MAP-2標(biāo)記的神經(jīng)元呈綠色，表明實驗組和對照組NSCs已分化為星型膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元，但實驗組NSCs分化能力較對照組強（圖5）。實驗組神經(jīng)元數(shù)目比值為（29.51± 5.27）%，對照組對應(yīng)的比值為（20.20±6.55）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.95，P＜0.01）。

3　討論

成體神經(jīng)干細胞是一種存在于成體動物神經(jīng)組織區(qū)的NSCs，具有分裂增殖、自我維護以及分化為多種神經(jīng)細胞的能力［7］。由于成年哺乳動物的神經(jīng)組織中廣泛存在成體NSCs，獲取簡便，且其具有潛在的神經(jīng)生發(fā)作用，成體NSCs在再生醫(yī)學(xué)中有廣闊的應(yīng)用潛力。EPO是一種人體腎小管周圍細胞分泌的糖蛋白激素，具有刺激骨髓造血的功能。EPO作用于紅細胞的機制現(xiàn)已闡明是和細胞膜上的EPOR受體相結(jié)合，形成二聚體，觸發(fā)鄰近的JAK2酪氨酸激酶分子磷酸化，使其激活，進一步引發(fā)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）、信號轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)導(dǎo)活化因子5（STAT5）、蛋白激酶C以及MAP激酶，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［4］。EPO及其受體被發(fā)現(xiàn)存在于成熟神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞［8-9］，EPO對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)保護逐漸成為近年來的熱點［10］。EPO在NSCs方面的研究［5-6］目前集中在EPO促進胚胎NSCs增殖及分化，但對成體NSCs的分化研究未見報道。作為EPO的重組形態(tài)，rhEPO的理化和生物學(xué)特性與EPO無差別。故本研究以成體脊髓NSCs為研究對象，采用rhEPO作用于成體脊髓NSCs，研究EPO/ EPOR通路在成體脊髓NSCs分化過程中的作用，為探討rhEPO在神經(jīng)損傷修復(fù)中的可能作用機制提供實驗依據(jù)。

本研究探討了EPO/EPOR通路在成體脊髓NSCs中的作用。首先依照課題組前期方法［11］，從成年SD大鼠脊髓內(nèi)分離出NSCs，檢測NSCs表面標(biāo)記物Nestin，結(jié)果證實其為NSCs。成體脊髓NSCs的EPOR免疫熒光染色結(jié)果顯示，實驗組及對照組NSCs上均可表達EPOR，且實驗組表達較對照組增強；Western blot法對成體脊髓NSCs中的EPOR進行定量檢測，顯示實驗組及對照組均有EPOR蛋白表達，且實驗組表達較對照組顯著增強。通過定性及定量兩種檢測方法均顯示rhEPO可促進NSCs上的EPOR表達。成體NSCs的分化實驗顯示，成體NSCs能在體外條件下分化為神經(jīng)元及星型膠質(zhì)細胞，且加入rhEPO后，NSCs分化為神經(jīng)元數(shù)目比值顯著增高，表明rhEPO能促進成體脊髓NSCs向神經(jīng)元方向分化，這與EPO對胚胎來源神經(jīng)干細胞的作用相一致［5］。以上研究結(jié)果表明，rhEPO能使EPOR蛋白表達增加，并促進成體NSCs向神經(jīng)元分化，這可能是rhEPO通過激活NSCs的EPO/EPOR通路，引起EPOR表達上調(diào)，進而影響了成體NSCs的分化過程，具體作用機制有待于進一步探討。

綜上所述，成體大鼠脊髓組織分離培養(yǎng)可獲得NSCs，在rhEPO作用下，可能通過激活EPO/EPOR信號通路，促進NSCs向神經(jīng)元方向定向分化。

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Experimental study on the effect of EPO/EPOR signaling pathway on the differentiation of neural stem cells in adult spinal cord

Wang Shaobin1，Zhang Hui2，Li Xiaobo2，et al
（1Dept of Orthopaedics，The Fourth Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2Dept of Orthopaedics，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To study the influence of the erythropoietin（EPO）and erythropoietin receptor（EPOR）signaling pathway on the differentiation of adult rat spinal cord neural stem cells（NSCs）.Methods Adult SD rat spinal cord cells were cultured in DMEM/F12 medium and the 3rd generation of the NSCs was chosen as the experimental object：in the experimental group the recombinant human erythropoietin（rhEPO）was further added into the culture medium，meanwhile in a control group only using saline with an equal volume.By using immunofluorescence staining and Western blot，we measured EPOR expression in the NSCs，while we observed the differentiation of NSCs by immunofluorescence staining.Results The results of immunofluorescence staining showed that EPOR expression could be measured in both NSCs of the experimental group and the control group，and the experimental group EPOR protein maintained at a higher level than that of the control group.Western blot results showed that the expression level of EPOR protein in the experimental group was higher than that in the control group，the difference was statistically significant（P＜0.01）.Immunofluorescence staining results of differentiation showed the NSCs of experimental group could differentiate into neurons，whose different proportion was more than the control group，the difference was significant（P＜0.01）.Conclusion rhEPO can activate EPO/EPOR signaling pathway，thereby enhancing the differentiate ability of adult neural stem cells of spinal cord into neurons.

neural stem cells；erythropoietin；differentiation；erythropoietin receptor

R 651.21

A

1000-1492（2016）06-0804-05

2016-01-18接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81171173）；安徽省自然科學(xué)基金（編號：11040606Q25）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院骨科，合肥 230022

2安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，合肥 230022

王少濱，男，碩士研究生；

尹宗生，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：yinzongsheng1961@sina.com