劉　培，宋禮華，，范清林，劉道琴，張　偉，魏　利，趙　婷

不同CHO工程細胞株表達的VEGFR-Fc唾液酸化修飾的研究

劉培1，宋禮華1，2，范清林2，劉道琴2，張偉2，魏利2，趙婷2

目的 比較中國倉鼠卵巢細胞（CHO）工程細胞株表達的VEGFR-Fc的唾液酸化程度的差異，為CHO工程細胞株的篩選提供參數(shù)依據(jù)。方法 從唾液酸單糖、寡糖鏈這兩個層次分析VEGFR-Fc的唾液酸化程度。唾液酸單糖的定量：酸水解釋放出的唾液酸用熒光試劑1，2-diamino-4，5-methylenedioxybenzene（DMB）衍生后，采用熒光-親水保留液相色譜（HILIC-FLD）檢測。寡糖鏈的結(jié)構(gòu)分析：糖苷酶PNGase F釋放出的寡糖鏈經(jīng)鄰氨基苯甲酰胺（2-AB）衍生后，一部分利用陰離子交換色譜原理分析寡糖鏈上唾液酸的平均數(shù)；一部分經(jīng)HILIC原理分析VEGFR-Fc寡糖鏈指紋圖譜。結(jié)果 6株工程細胞株表達的VEGFR-Fc唾液酸含量在3～12 mol NANA/mol蛋白之間，參考品Aflibercept為10.46 mol NANA/mol蛋白；每個寡糖鏈的唾液酸平均數(shù)在0.28～1.0之間；寡糖鏈的特征指紋譜圖顯示VEGFR-Fc有12個共有峰，各樣品、參考品均有以上共有峰，但各峰的峰高有差異。結(jié)論 不同的CHO工程細胞株所表達的糖蛋白的唾液酸化程度存在差異。

唾液酸；唾液酸化；糖基化；HILIC-FLD

網(wǎng)絡出版時間：2016-5-9 15：43：10 網(wǎng)絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.008.html

糖蛋白是蛋白質(zhì)在翻譯后經(jīng)過糖基化修飾形成，被廣泛應用于治療各種疾病，占據(jù)著較大的市場。糖基化作為蛋白質(zhì)翻譯后的主要修飾之一，調(diào)節(jié)并穩(wěn)定蛋白構(gòu)象，增加其可溶性，介導受體對蛋白的識別作用，影響蛋白類藥物的生物學活性［1-2］。因此，有必要對糖蛋白類生物藥物的糖基化修飾進行系統(tǒng)研究，其中唾液酸化程度的監(jiān)控尤為重要。唾液酸化作為糖基化修飾的一部分，兩者密不可分，相互依存。唾液酸是寡糖鏈最外側(cè)的酸性單糖，帶有負電荷起抗蛋白水解的作用，位于寡糖鏈的最末端，擔當著信號使者的角色，故而影響糖蛋白類藥物的體內(nèi)吸收、半衰期以及理化性質(zhì)［3］。唾液酸家族包括多個成員，為人所熟知的是N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-acetylneuraminic acid，NANA），N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（N-glycolylneuraminic acid，NGNA）。而糖蛋白類抗體藥物中主要是NANA，NGNA很少。糖蛋白類重組藥物多數(shù)是由CHO等哺乳細胞表達生成，在生產(chǎn)工藝中，糖蛋白類藥物的糖基化、唾液酸化受多種因素的影響，包括細胞株、營養(yǎng)成分、pH、溫度、細胞生長周期、溶解氧、攪拌速度等［4］，較難控制。因此，篩選工程細胞株則是相對最有效的方法。該研究以人源化融合糖蛋白［5］（vascular endothelial growth factor receptor-IgG Fc，VEGFR-Fc）為例，主要從唾液酸單糖、寡糖鏈的唾液酸化這兩個方面分析比較6株不同的CHO工程細胞株所表達的目的蛋白的唾液酸化修飾的差異，為生產(chǎn)工藝中工程細胞株的篩選提供理論依據(jù)。目前糖基化、唾液酸化修飾的研究方法有很多種，應用較為廣泛的是熒光高效液相色譜（fluorescence detector-high performance liquid chromatography，HPLC-FLD）［6］。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑 乙腈（HPLC grade）、NANA（≥98%）、NGNA（≥95%）、2-AB、DMB、氰基硼氫化鈉購自美國Sigma公司；PNGase F（#P0704S）、O-Glycosidase（#P0733S）購自美國New England Biolabs公司；RapiGest SF、GlycoWorks試劑套裝、GlycoWorks親水保留色譜（hydrophilic interaction chromatography，HILIC）1cc小柱購自美國Waters公司；所有用水為超純水，其他試劑均為分析純類化合物。高效液相色譜系統(tǒng)采用Waters-1525型HPLC儀，Waters熒光檢測器2475。色譜柱的型號為Waters XBridgeTMAmide column（3.5 μm，4.6 mm×150 mm），Shodex Asahipak NH2P-50（5 μm，2.0 mm× 150 mm）。真空離心濃縮儀購自美國Thermo Fisher公司。DMB衍生液：8 mmol/L DMB、1.5 mol/L冰醋酸、0.8 mol/L β-巰基乙醇、0.25 mol/L硫代硫酸鈉、0.25 mol/L亞硫酸鈉。2-AB衍生液：10 mg 2-AB溶解于800 μl醋酸/DMSO（3∶7，v∶v）后，加入12 mg氰基硼氫化鈉。VEGFR-Fc為安徽安科生物工程（集團）股份有限公司自主研發(fā)的IgG Fc融合蛋白，參考品為市售的Aflibercept。

1.2方法

1.2.1唾液酸單糖的定性與定量 樣品的處理：取20 μg樣品蛋白、參考品Aflibercept，補水至100 μl，加入等體積的0.2 mol/L三氟乙酸，80℃水解60 min［7］。取出后離心，冰浴中冷卻，精確吸取90 μl，加入10 μl DMB衍生液，50℃避光衍生150 min，冰浴中放置，在進行HPLC分析前加入等體積的乙腈。標準品NANA，NGNA采用同樣的方法水解、標記。

色譜條件：Waters XBridgeTMAmide column（3.5 μm，4.6 mm×150 mm），柱溫60℃；熒光檢測器激發(fā)波長373 nm，發(fā)射波長448 nm；流動相A為100 mmol/L甲酸胺，B為純乙腈；流速為0.5 ml/min，A相在30 min由開始的0%變?yōu)?3.1%。進樣量：20 μl。

數(shù)據(jù)處理：以水配制0.1 mmol/L NANA標準品溶液，分別取10 μl（1.0 nmol）、15 μl（1.50 nmol）、20 μl（2.0 nmol）、30 μl（3.0 nmol）、40 μl（4.0 nmol）制備標準曲線；以水作為空白對照，并用水將上述各管體積補至100 μl。水解、標記處理操作同樣品。然后按下列公式計算每mol蛋白分子中唾液酸基團的數(shù)目：唾液酸含量（mol/mol蛋白）=（SA/ P）Mr；其中SA為根據(jù)標準曲線計算的參考品或供試品中唾液酸基團總數(shù)（nmol），P為蛋白取樣量（μg），Mr為VEGFR-Fc相對分子質(zhì)量（97 ku，不包括寡糖成分）。

1.2.2唾液酸程度化的分析

1.2.2.1糖蛋白寡糖鏈的釋放 取VEGFR-Fc融合蛋白、標準品Aflibercept 100 μg左右，加入RapiGest SF使其終濃度為0.1%RapiGest SF，再分別加入0.5 mol/L DTT（2 μl，37℃、30 min）、0.5 mol/L IAM（4 μl，室溫避光孵育30 min）還原，烷基化后，加入2 μl PNGaseF酶37℃孵育過夜。糖蛋白酶切后取適量樣品進行SDS-PAGE電泳與酶切前比較，檢驗酶切效率。

1.2.2.2糖鏈的提取回收和熒光標記 取酶切后蛋白樣品100 μl加入700 μl乙腈，上樣于90%乙腈活化的固相萃取柱1cc小柱，用25 mmol/L碳酸氫銨的5%乙腈水溶液洗脫收集酶切下的寡糖鏈，真空蒸發(fā)干燥多聚糖。干燥后的多聚糖加入20 μl 2-AB衍生液，65℃水浴3 h。

1.2.2.3去除過量標記試劑 取標記過的寡糖鏈20 μl加入200 μl乙腈后，再次用固相萃取柱1cc小柱洗脫去除多余的標記物，真空蒸發(fā)干燥寡糖鏈后，加入等體積的乙腈，-20℃保存待HPLC分析。

1.2.2.4唾液酸程度化的分析［8］色譜條件：采用Shodex Asahipak NH2P-50（5 μm，2.0 mm×150 mm），流動相A為2.5%醋酸，2.0%三乙胺，用水配制；流動相B為1.0%醋酸，乙腈配制；流速為0.2 ml/min。熒光檢測器的激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長428 nm。進樣量為20 μl。洗脫程序：0～2 min，10%A；2～50 min，10%A-100%A；50～67 min，100%A；67～72 min，100%A-10%A；72～82 min，10%A。

數(shù)據(jù)處理：記錄色譜圖，將每個寡糖基團中所有檢測到的峰面積進行積分，計算Z值確定糖鏈的唾液酸化程度，即每個寡糖中唾液酸的平均數(shù)。第1組峰表示末端不含唾液酸的糖鏈（0SA），第2組峰表示末端含1個唾液酸的糖鏈（1SA），第3組峰表示末端含2個唾液酸的糖鏈（2SA），第4組峰表示末端3個含唾液酸的糖鏈（3SA），第5組峰表示末端含4個唾液酸的糖鏈（4SA），計算公式為：Z值=（1×1SA峰面積+2×2SA峰面積+3×3SA峰面積+4×4SA峰面積）/（0SA峰面積+1SA峰面積+ 2SA峰面積+3SA峰面積+4SA峰面積）。

1.2.2.5寡糖鏈的分析 Waters XBridgeTMAmide column（3.5 μm，4.6 mm×150 mm），流動相A為100 mmol/L甲酸胺；流動相B為純乙腈；激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長428 nm。梯度洗脫條件見表1。進樣量為20 μl。

表1　梯度洗脫條件

2　結(jié)果

2.1唾液酸的定性分析 標準品NANA、NGNA的色譜圖見圖1A，NANA的保留時間為21.45 min，NGNA的保留時間為23.30 min。樣品的唾液酸色譜見圖1B，色譜峰的保留時間為21.44 min，據(jù)保留時間可判定樣品蛋白中含有NANA，未檢測到NG-NA。

2.2唾液酸的定量分析 記錄色譜圖，將色譜圖中的NANA峰面積進行積分，以NANA標準品溶液的峰面積對唾液酸含量作標準曲線回歸方程：Y= 108X+107，相關(guān)系數(shù)R的平方為：R2=0.999。樣品唾液酸含量測定的色譜圖見圖1B，根據(jù)峰面積，按“1.2.1”項中的數(shù)據(jù)處理方法計算樣品的NANA含量。6株不同CHO工程細胞株表達的VEGFR-Fc的唾液酸含量的測定結(jié)果見表2。

2.3SDS-PAGE分析酶切效果 SDS-PAGE是分析蛋白質(zhì)相對分子量的常用方法。本研究采用SDS-PAGE比較了唾液酸含量比較高的A6細胞株表達的VEGFR-Fc與參考品Aflibercept（圖2），可見分子量沒有明顯差異。比較PNGase F酶、O-Glyco-sidase酶酶切后的蛋白分子量，可以看出該融合蛋白主要為N-糖基化，O位糖基化很少或者沒有。由于SDS-PAGE的分辨率不高，所以只能初步判定蛋白分子量的完整性以及糖苷酶酶切效率，并不能用于精確分析糖蛋白修飾的差異。

圖1　唾液酸測定色譜圖A：NANA和NGNA標準色譜圖；B：蛋白樣品結(jié)合唾液酸色譜圖

表2　不同細胞株表達的VEGFR-Fc的唾液酸含量和Z值

圖2　還原型SDS-PAGEM：Marker；1、3、5泳道分別為參考品Aflibercept，切除O-寡糖鏈，切除N-寡糖鏈；2、4、6為A6細胞株表達的VEGFR-Fc樣品，切除O-寡糖鏈，切除N-寡糖鏈

2.4唾液酸化的分析 樣品的唾液酸化寡糖色譜圖見圖3，第1、2、3、4、5組峰分別表示0個（0SA）、1個（1SA）、2個（2SA）、3個（3SA）和4個（4SA）唾液酸的糖鏈，對所有檢測到的峰面積進行積分，根據(jù)“1.2.2.4”的數(shù)據(jù)處理公式計算獲得各個細胞株表達的VEGFR-Fc的唾液酸化結(jié)果見表2。A6細胞株表達的VEGFR-Fc的唾液酸化程度最高，平均每個寡糖鏈上攜帶1個唾液酸，而參考品Aflibercept的寡糖鏈上的唾液酸平均數(shù)為0.84。

圖3　VEGFR-Fc含不同唾液酸數(shù)的寡糖色譜圖

2.5糖基化的分析 色譜圖顯示CHO工程細胞株表達的VEGFR-Fc樣品有12個共有色譜峰（圖4），A1、A6細胞株表達的目的蛋白的寡糖鏈結(jié)構(gòu)相同，但是各個寡糖鏈的相對值卻稍有差異。從圖5中可看出不同工程細胞株表達的VEGFR-Fc樣品的糖基化修飾結(jié)構(gòu)與參考品Aflibercept一致，但各寡糖鏈所占的比例不同。結(jié)合唾液酸化的檢測結(jié)果顯示，唾液酸化與糖基化修飾明顯相關(guān)，唾液酸化程度越高，親水保留能力強的寡糖鏈所占比例明顯增加。親水保留能力強表明寡糖鏈的結(jié)構(gòu)復雜，其末端更有可能攜帶唾液酸。這也初步解釋了在動物試驗中A1細胞株表達的VEGFR-Fc的半衰期相對較短，而隨著唾液酸化程度的提高，A6細胞株表達的VEGFR-Fc的半衰期明顯增長。

圖4　VEGFR-Fc的寡糖色圖譜

圖5　6株CHO工程細胞株表達的VEGFR-Fc和參考品Aflibercept的寡糖色圖譜

3　討論

經(jīng)典的學說認為NGNA是腫瘤細胞的特異性抗原，人源化蛋白寡糖鏈中的唾液酸主要是NANA［9］。為了區(qū)分NANA、NGNA，減少糖蛋白的用量，唾液酸的測定主要用的是反相C8或者C18色譜柱聯(lián)合液相色譜系統(tǒng)。Chemmalil et al［10］利用親水保留液相色譜聯(lián)合納克激光計數(shù)檢測器測定了糖蛋白的唾液酸含量，探索了唾液酸測定的新方向。本實驗首次利用酰胺基色譜柱的HILIC原理，聯(lián)合熒光液相色譜分析了6株CHO工程細胞株表達的VEGFR-Fc的唾液酸含量，線性關(guān)系良好，NANA、NGNA得到了良好的分離效果，精密度的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.47%，準確度的RSD為0.7%，冰浴中24 h內(nèi)的穩(wěn)定性RSD為0.2%。通過氨基酸序列初步估計該融合蛋白單鏈理論上有5個N-糖基化位點，唾液酸化的結(jié)果分析顯示0～2SA的寡糖鏈占0.95以上，故該融合蛋白的寡糖鏈主要以2分支存在，最多可能有20 mol NANA/mol蛋白，上述計算結(jié)果均在理論值范圍內(nèi)。本文所建立的HILIC-FLD測定唾液酸含量的方法沒有在時間上取得優(yōu)勢，但相對反相柱而言，HILIC柱對高極性的唾液酸有更好的保留作用，更適用于唾液酸等極性物質(zhì)的測定。

早期Beck et al［11］發(fā)現(xiàn)CHO細胞株與NSO細胞株表達的糖蛋白的糖基化結(jié)構(gòu)相同，但是相對含量卻有差異。唾液酸單糖的分析只能初步了解糖蛋白末端唾液酸的含量。為了更深入了解CHO工程細胞株表達的VEGFR-Fc的唾液酸化修飾的差異，需要進一步分析其寡糖結(jié)構(gòu)。初步的SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，該融合蛋白主要是N-糖基化，這也與大多數(shù)文獻研究［4］結(jié)果一致，即抗體類蛋白的糖基化修飾類型主要是N位糖基化。因此寡糖分析采用PNGase F酶切除蛋白骨架中的N-糖鏈。這些寡糖鏈經(jīng)2-AB標記后根據(jù)電荷強度通過離子交換色譜法進行分離，然后依據(jù)不同數(shù)目的唾液酸的寡糖面積計算Z值，Z值越大，表示寡糖鏈中唾液酸含量越多。同時衍生后的寡糖鏈通過HILIC色譜法分析獲得了VEGFR-Fc的寡糖鏈指紋圖譜。經(jīng)過以上分析，唾液酸化程度相對較高的A6細胞株表達的VEGFR-Fc的每個寡糖鏈上平均有1個唾液酸，寡糖鏈指紋圖譜顯示其有12個共有峰，故該融合蛋白理論上的唾液酸含量應為12 mol NANA/mol蛋白，本文所建立的HILIC-FLD的測定結(jié)果為11.9 mol NANA/mol蛋白，同樣計算顯示其他細胞株及參考品所得的結(jié)果也基本相同，說明該方法準確可靠。

本文相對全面地分析了CHO工程細胞株表達的VEGFR-Fc的唾液酸化修飾差異，篩選出唾液酸化程度較高的細胞株，為生產(chǎn)工藝中唾液酸化的調(diào)控奠定了良好的基礎。從VEGFR-Fc的唾液酸化的研究結(jié)果可以推斷其他重組糖蛋白也可用同樣的篩選策略進行唾液酸化的調(diào)控。

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On the sialylation levels of VEGFR-Fc from different CHO cell strains

Liu Pei1，Song Lihua1，2，F(xiàn)an Qinglin2，et al
（1Dept of Biochemistry and Molecular Biology，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Anhui Anke Biotechnology（Group）Co.，Ltd，Hefei 230000）

Objective To describe the sialylation levels of VEGFR-Fc from different CHO cell strains for screening out the better CHO cell strain.Methods The analysis of sialic acid was from two levels：monosaccharide constituent and structural analysis of the glycan chains of glycoconjugates.The sialic acids were liberated by mild acid hydrolysis and then derivatized using 1，2-diamino-4，5-methylenedioxybenzene（DMB）.The derivatives were separated by hydrophilic interaction liquid chromatography on an amide column.The second level was to remove the oligosaccharides from VEGFR-Fc by Peptide N-glycolsidase F（PNGase F），and derivatized with 2-aminobenzamide（2-AB）.The labels could then be analyzed by anion exchange and hydrophilic interaction chromatography coupled to fluorescence detector.Results The sialic acid content of 6 VEGFR-Fc isoforms varied between 3～12 mol NANA/mol protein，and Aflibercept contained 10.46 mol NANA/mol protein.The average content of sialic acid in each oligosaccharide chain was 0.28～1.0.The typical finger chromatogram of VEGFR-Fc oligosaccharides was built and 12 characteristic peaks were pointed out.Conclusion Combined together，these two levels analysis sufficiently demonstrate there is a difference in the degree of salivary acid acidification of VEGFR-Fc from different CHO cell strains.

sialic acid；sialylation；glycosylation；HILIC-FLD

R 917.796

A

1000-1492（2016）06-0778-05

2016-03-04接收

1安徽醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室，合肥2300322安徽安科生物工程（集團）股份有限公司，合肥 230000

劉 培，女，碩士研究生；宋禮華，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：Sonlh@ ankebio.com