田翠翠，肖邦定*

(1：中國科學院水生生物研究所，武漢 430072)(2：中國科學院藻類生物學重點實驗室，武漢 430072)

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輪葉黑藻(Hydrilla verticillata)根系泌氧對沉積物中典型鐵氧化菌和鐵還原菌的影響*

田翠翠1,2，肖邦定1,2*

(1：中國科學院水生生物研究所，武漢 430072)(2：中國科學院藻類生物學重點實驗室，武漢 430072)

鐵作為地殼中豐度最高的氧化還原敏感元素，對湖泊沉積物的氧化還原作用具有重要的指示意義. 水生植物根系泌氧在根際形成微域的氧化圈，根際是氧化、還原同時發(fā)生的生物活躍區(qū). 以輪葉黑藻(Hydrillaverticillata)為研究對象，利用微電極和熒光定量PCR探討根系泌氧作用對沉積物中典型鐵氧化菌(嘉利翁氏菌)和典型鐵還原菌(地桿菌)的影響. 結(jié)果表明，輪葉黑藻生長迅速，通過根系泌氧作用影響沉積物中鐵的價態(tài)和形態(tài)，是根際鐵循環(huán)的重要參數(shù)，并對根際微區(qū)微生物有一定的影響. 根系泌氧使根際嘉利翁氏菌和地桿菌數(shù)量增加，進一步影響根際微生物鐵循環(huán). 實驗結(jié)果可為微生物對根際鐵循環(huán)的研究提供一定的理論基礎(chǔ).

輪葉黑藻；根系泌氧；嘉利翁氏菌；地桿菌；熒光定量PCR；沉積物

鐵(Fe)是地殼中豐度最高的氧化還原敏感性金屬元素，約占5.1%，對湖泊沉積物的氧化還原作用具有重要的指示意義[1]. 沉積物中鐵氧化物具有吸附、解吸、氧化還原、催化等功能，能夠直接影響各種生物地球化學反應過程[2-3]，如能夠有效地吸附沉積物或水體中氮和磷等營養(yǎng)元素[4]. 在湖泊沉積物中Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)可通過氧化還原反應實現(xiàn)相互轉(zhuǎn)化. Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)之間的氧化還原作用對湖泊沉積物的地球化學研究有重要意義[3].

輪葉黑藻(Hydrillaverticillata，以下簡稱黑藻)是一種多年生沉水植物，因其具有生存范圍廣、適應性強、繁殖能力強等特點而廣泛用于恢復富營養(yǎng)化水體的先鋒物種. 黑藻通過根系泌氧作用將O2由根系向外分泌到根際環(huán)境中，這樣在保證植物根系生長對O2需求的同時，也維持了環(huán)境的局部氧化狀態(tài). 根系泌氧不斷使根際沉積物中存在的Fe(Ⅱ)被氧化，生成鐵氧化物或鐵氫氧化物，這些物質(zhì)可以在植物的根表面沉積，這種通過連續(xù)的氧化作用使植物根表的周圍緊附一層由結(jié)晶態(tài)或無定形態(tài)鐵的氧化物或氫氧化物沉淀，稱之為鐵膜[5]，其反應過程可表示為：

4Fe2++O2+10H2O→4Fe(OH)3+8H+

有研究表明，鐵膜具帶正負電荷的基團和較大的表面積，可以通過吸附或共沉淀等作用，影響沉積物中其他元素的遷移轉(zhuǎn)化和生物有效性，從而減少根系對有毒離子的吸收，維持植物正常生長[6-7].

微生物活性控制著湖泊沉積物中的氧化還原反應，微生物可利用有機物作為電子供體進行呼吸代謝，當O2存在時，O2是首選的電子受體[2]. 根系泌氧使根系周圍與根際之間形成氧化還原電位差以及反相的鐵氧濃度梯度，成為微氧型鐵氧化菌的良好生存場所[8-11]. 其中，嘉利翁氏菌(Gallionella)是一種典型的微氧型鐵氧化菌，屬于亞硝化單胞菌目(Nitrosomonadales)，能以Fe(Ⅱ)為能源進行化能自養(yǎng)，或利用有機碳源進行混合營養(yǎng)代謝. 細菌鐵氧化過程不僅能合成有機物，還能產(chǎn)生大量的無定形羥基氧化鐵，為異化鐵還原菌提供了理想的基質(zhì)，因而有利于促進水生植物根際鐵的生物地球化學循環(huán)[12-14]. 地桿菌(Geobacter)是厭氧環(huán)境中分布最廣泛的鐵還原菌，屬于δ-變形菌門[15]. 有研究表明以鐵氧化物為末端電子受體的Fe(Ⅲ)的異化還原有可能是最早的微生物代謝形式，廣泛存在于土壤、沉積物等環(huán)境中[16]. 微生物異化Fe(Ⅲ)還原是兼性厭氧菌和嚴格厭氧菌將Fe(Ⅲ)作為末端電子受體的厭氧呼吸過程. 在這一過程中，鐵還原微生物以一些有機和無機組分作為碳源和能源[17].

微生物是湖泊沉積物鐵循環(huán)的核心參與者，鐵氧化菌和鐵還原菌在營養(yǎng)元素循環(huán)及微量元素的遷移轉(zhuǎn)化等方面的重要作用，使二者成為目前研究的熱點. 本研究選取黑藻為研究對象，研究其根系泌氧作用對沉積物中鐵形態(tài)及其對根際沉積物中嘉利翁氏菌和地桿菌的影響，旨在探討植物根系泌氧作用對沉積物中鐵循環(huán)的影響.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究主要選取浙江省東錢湖(29°52′N,121°34′E)沉積物為研究對象. 用彼得森采泥器采集湖中心0～10 cm表層新鮮沉積物，置于便攜式冰箱快速帶回實驗室，鮮泥直接過80目篩(避免沉積物中大顆粒物損壞電極)，過篩后混勻，待其自然沉降1 d后備用，實驗開始時沉積物總氮(TN)含量為2.590.14 mg/g，總磷(TP)含量為0.120.03 mg/g，有機質(zhì)(OM)含量為13.41%1.66%，總鐵(TFe)含量為13.460.44 mg/g，亞鐵(Fe(Ⅱ))含量為6.740.17 mg/g，pH值為7.040.05.

實驗用黑藻采自云南滇池草海，采集后立即帶回實驗室，用自來水沖洗數(shù)次并去除里面混雜的水草及其他藻類，然后于實驗室內(nèi)馴化培養(yǎng)，備用.

1.2 實驗設計

將50 ml注射器頂端截掉，用注射器自帶的活塞塞住底部(圖1)，加入7 cm左右厚的沉積物，靜置一夜. 取性狀一致、長度均為5 cm的黑藻扦插于注射器內(nèi)，用錫箔紙包裹注射器，保證不透光. 對照組不扦插黑藻，其余同實驗組，對照組和實驗組各設置18個重復. 放入整理箱(70 cm×50 cm×50 cm)中，小心注入自來水，使水深保持在40 cm左右. 放入恒溫室內(nèi)培養(yǎng)，溫度為25℃培養(yǎng)，12 h/12 h光照/遮光(1500 lx/0 lx). 實驗中每天用蒸餾水補足蒸發(fā)減少的水分，培養(yǎng)周期為60 d，每10 d取1次樣，取樣方法為對照組和實驗組各隨機取出3支注射器用于后續(xù)測定.

取樣時，小心取出注射器，先用微電極測定植物周圍2 mm處溶解氧的微觀剖面，然后進行破壞性取樣，并將粘附在植物根上的沉積物定義為根際沉積物[18]，對照組去除表層的沉積物(1 cm)后定義為非根際沉積物，小心收集后，20℃保存用于理化性質(zhì)的測定和DNA的提取.

圖1 注射器模擬實驗Fig.1 Model of syringe experiment

1.3 分析測定

沉積物總鐵(TFe)和亞鐵(Fe(Ⅱ))用3 mol/L HCl提取16 h后，5000 轉(zhuǎn)/min離心5 min，上清液用2,2-聯(lián)吡啶分光光度法測定[19]. 為研究沉積物中鐵氧化物的結(jié)晶度以及生物可利用性，采用5步連續(xù)提取的方法[11]獲得沉積物中不同形態(tài)的鐵. 具體做法為：先用1.0 mol/L MgCl2(pH=5)提取可交換態(tài)鐵，再用0.1 mol/L焦磷酸鈉提取有機結(jié)晶態(tài)鐵，然后用0.2 mol/L草酸/草酸銨(pH=3)提取貧結(jié)晶態(tài)鐵，再用DCB溶液(含0.03 mol/L Na3C6H5O7·2H2O,0.125 mol/L NaHCO3和0.06 mol/L Na2S2O4)提取強結(jié)晶態(tài)鐵，最后用濃硝酸提取剩余鐵. 所有的提取液用2,2-聯(lián)吡啶分光光度法測定其中的鐵[19].

沉積物-水界面的微觀剖面利用微電極進行測量(圖1). 實驗用穿刺型氧電極(OXY25, ?=25 μm, Unisense，丹麥)研究沉積物-水界面幾毫米至幾厘米內(nèi)的變化. 具體做法是：先將微電極連接在四通道主機(Unisense，丹麥)上進行極化和校正. 在穿刺樣品時將微電極安裝在1個馬達控制器(MC-232, Unisense，丹麥)上，用顯微操縱器控制(MM 33, Unisense，丹麥)將電極和電腦相連. 通過調(diào)節(jié)相應的參數(shù)(響應時間為3 s，步距均為500 μm)來研究沉積物-水界面剖面微尺度上的變化. 實驗時在黑藻根系周圍2 mm以內(nèi)進行穿刺(圖1).

DNA的提取按照E.Z.N.A. soil kit土壤DNA提取試劑盒(Omega，美國)的說明書進行. DNA提取后，先用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA. 然后對目標DNA進行普通PCR擴增，擴增條件見表1.

熒光定量PCR標準品的制備是將純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體(Takara，日本)連接，制備總細菌、嘉利翁氏菌和地桿菌標準品. 具體方法為：將普通PCR產(chǎn)物通過凝膠電泳檢測后用Axygen膠回收試劑盒(Axygen，美國)進行純化，然后根據(jù)pMD18-T載體說明書進行連接反應，再將連接產(chǎn)物導入到大腸桿菌內(nèi)(DH 5α，Takara，日本). DNA片段成功插入到pMD18-T載體中后，重組克隆體在含有AMP的瓊脂培養(yǎng)基上將顯示白色菌落. 挑選單個的白色菌落用于擴大培養(yǎng)，同時通過普通PCR檢測，檢查有無目標條帶；檢測完成后，去除沒有條帶的，委托武漢天一輝遠生物科技有限公司進行測序，測序完成后將所得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比對，并通過Bankit提交至Genbank數(shù)據(jù)庫，獲得序列號. 按Axygen質(zhì)?；厥赵噭┖?Axygen，美國)上的說明書進行質(zhì)粒提取. 利用限制性內(nèi)切酶AatⅡ(TaKaRa，日本)進行酶切反應. 酶切后的質(zhì)粒用微量分光光度計測定質(zhì)粒OD260，計算質(zhì)粒濃度，并以此作為熒光定量PCR的標準品.

表1 熒光定量PCR引物和條件

熒光定量PCR按表1中的引物對總細菌、嘉利翁氏菌和地桿菌進行擴增，反應體系如下：總體積為10.0 μl，其中iTaq Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad，美國)5 μl，引物各0.5 μl，模板DNA 0.5 μl，無菌水3.5 μl. 擴增條件見表1. 用上述已插入目標基因的質(zhì)粒10倍梯度稀釋后用做標準曲線，為確保實驗數(shù)據(jù)的有效性，實驗時設置3個陰性對照和6個不同梯度的標準品，每個樣品和標準品各設3個平行，以基線(背景)熒光信號標準差的10倍作為閾值，溶解曲線均為單一峰. 實驗時擴增效率和標準曲線相關(guān)性(r2)見表1.

獲得的總細菌序列在Genbank中的登錄號為KP714253，嘉利翁氏菌基因序列在Genbank中的登錄號為KP714251；地桿菌基因序列在Genbank中的登錄號為KP714257.

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

數(shù)據(jù)處理利用SPSS 19.0軟件進行. 利用單因素方差分析或t-檢驗進行顯著性水平檢驗，顯著性水平為P<0.05. 圖表采用Origin 8.0作圖.

2 結(jié)果

2.1 根系生長特征

黑藻各項生長指標均隨培養(yǎng)時間的增長而顯著增加，其中，葉片是黑藻進行光合作用的主要場所，隨著培養(yǎng)時間的增加，黑藻生長迅速，生物量不斷增加. 黑藻根系隨著培養(yǎng)時間的延長而迅速生長，尤其表現(xiàn)在根系生物量的增加(表2).

表2 不同時間黑藻生長狀況*

*數(shù)據(jù)為平均值標準差，同列上標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

2.2 根際微區(qū)溶解氧濃度的垂直剖面變化

為了研究種植黑藻后對沉積物-水界面微觀剖面的影響，利用微電極原位研究溶解氧(DO)濃度垂直剖面的變化，結(jié)果顯示，黑藻組水體DO濃度為174 μmol/L，而對照組僅為137 μmol/L(圖2a)，這說明黑藻的存在使水體DO濃度增加. 當微電極進入泥水界面后，DO濃度迅速下降，至界面下3 mm左右處降為0. 當微電極繼續(xù)向下到7 mm左右，出現(xiàn)1個明顯的峰值，峰值大小為40 μmol/L，峰寬為8 mm，顯著大于黑藻根莖(約1 mm)，這進一步說明黑藻根系泌氧的存在.

從有氧層厚度來看，對照組有氧層厚度為5.5 mm左右(圖2b)，且隨時間變化不明顯. 種植黑藻后有氧層厚度顯著增加(P<0.05)，均大于8 mm，且隨培養(yǎng)時間呈增加的趨勢，說明黑藻能使沉積物中DO濃度增加.

圖2 沉積物-水界面DO垂直剖面變化(培養(yǎng)40 d)(a)和有氧層厚度變化(b)Fig.2 In situ measurement of oxygen profile(cultured 40 d)(a)and oxic layer thickness (b)of the water-sediment interface

2.3 黑藻對沉積物中鐵形態(tài)的影響

種植黑藻后，根際沉積物中Fe(Ⅱ)含量占總鐵含量的45%左右(圖3)，且顯著低于對照組(62.53%6.60%). 從鐵的形態(tài)來看(圖4)，沉積物中可交換態(tài)鐵和有機結(jié)合態(tài)鐵含量相對較少，不同處理組沉積物中鐵主要以貧結(jié)合態(tài)鐵和結(jié)合態(tài)鐵的形式存在. 黑藻組貧結(jié)合態(tài)鐵的含量顯著高于對照組，而結(jié)合態(tài)鐵含量顯著低于對照組，這主要是因為根系泌氧作用促進根際沉積物中Fe(Ⅱ)的氧化. 實驗結(jié)束時沉積物中總鐵含量為13.150.17 mg/g，與實驗開始時沉積物中總鐵含量并沒有顯著差異，說明植物對鐵的吸收作用很小，主要是鐵形態(tài)發(fā)生變化.

圖3 沉積物中Fe(Ⅱ)占總鐵含量百分比的變化Fig.3 The percentage changes of Fe(Ⅱ) of the total Fe in sediments

圖4 實驗結(jié)束時沉積物中各形態(tài)鐵含量百分比的變化Fig.4 The percentage changes of different Fe fractions in sediments at the end of experiment

2.4 沉積物中典型鐵氧化菌和鐵還原菌的變化

從總細菌的拷貝數(shù)來看，除第50 d外，黑藻組和對照組并無顯著差異(圖5). 嘉利翁氏菌的拷貝數(shù)隨著培養(yǎng)時間呈增加的趨勢，在第60 d略有下降. 從數(shù)量上來看，除第40 d外，黑藻組嘉利翁氏菌拷貝數(shù)均高于對照組，從平均值來看，黑藻組嘉利翁氏菌拷貝數(shù)是對照組的1.92倍. 地桿菌拷貝數(shù)在培養(yǎng)10 d后，隨著培養(yǎng)時間的增加基本呈持平狀態(tài). 從數(shù)量上來看，黑藻組地桿菌數(shù)均高于對照組，從平均值來看，黑藻組地桿菌拷貝數(shù)是對照組的1.94倍.

圖5 沉積物中總細菌、嘉利翁氏菌和地桿菌拷貝數(shù)的變化Fig.5 Changes in gene copies of total Bacteria, Gallionella and Geobacter in different sediments

3 討論

3.1 黑藻對沉積物-水界面溶解氧濃度的影響

沉積物-水界面的溶解氧濃度主要受植物根系泌氧和沉積物自身耗氧等因素的影響. 本研究利用微電極技術(shù)，原位確定了根系泌氧的存在(圖2a). 水生植物根系泌氧是植物在長期淹水缺氧環(huán)境中自然選擇的結(jié)果，通過植物組織內(nèi)部強大的通氣組織來實現(xiàn)[22]. 黑藻通過葉片進行光合作用產(chǎn)生O2，通過莖、根等通氣組織輸送到植物根系，供根系呼吸. 通氣組織是具有巨大空間的海綿組織，它能夠在植物組織內(nèi)部為氣體存儲和交換提供一個方便的內(nèi)部通道，使其傳送的氧氣被鄰近組織細胞消耗或擴散到根尖和根際沉積物中[23]，并使沉積物-水界面有氧層厚度增加(圖2b).

3.2 根系泌氧對根際鐵循環(huán)的影響

根系泌氧可以誘導根表鐵膜的形成[24]，普遍的觀點認為根際Fe(Ⅱ)通過化學氧化轉(zhuǎn)化為Fe(Ⅲ)而形成鐵膜[1,25]，從而影響植物對養(yǎng)分的吸收、還原性物質(zhì)的毒害作用和其它一些重金屬元素的存在形態(tài)等[25]. 因而，植物根表鐵膜的形成必須具備兩個條件，一是植物根際處于局部氧化狀態(tài)，二是生長介質(zhì)中存在大量的Fe(Ⅱ).

O2將根際Fe(Ⅱ)氧化成Fe(Ⅲ)(圖3)，由于該過程是可自發(fā)的反應[26]，所以對于在此過程中是否有微生物驅(qū)動的Fe(Ⅱ)氧化存在很大爭議. 但是已有報道稱鐵氧化菌可大大加快鐵的氧化反應速度，鐵氧化菌存在時氧化鐵的能力比純化學作用氧化鐵的能力要高出數(shù)倍[27]. 有研究表明在此過程中微生物的氧化占20%～75%[24,28-29]，表明細菌鐵氧化在根際鐵循環(huán)過程中起到至關(guān)重要的作用. 已有的研究表明，嘉利翁氏菌易于在高Fe(Ⅱ)(5～25 mg/L)、低O2濃度(<50 μmol/L)和偏中性pH(6.0～7.6)條件下生存[28]，這與本研究的條件相似. 種植黑藻的沉積物中，隨著根系的生長，植物根系生物量不斷增加，O2通過根系徑向泌氧擴散到根際缺氧環(huán)境中，可以為嘉利翁氏菌提供適宜的環(huán)境條件[25]. 從實驗結(jié)果來看，根際沉積物中嘉利翁氏菌的數(shù)量雖略有增加，但是統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，根際和非根際沉積物中嘉利翁氏菌的數(shù)量并無顯著差異(圖5b)，這主要是因為沉積物中鐵氧化菌和非生物鐵氧化過程共同存在. 有研究表明，鐵氧化菌和非生物鐵氧化過程競爭，通過微好氧或厭氧呼吸作用進行鐵氧化作用，并獲得微生物生長所需要的能量[27]. 細菌鐵氧化過程不僅能合成有機物，還能產(chǎn)生大量的貧結(jié)合態(tài)鐵(圖4)，促進沉積物中鐵形態(tài)的轉(zhuǎn)化，并為異化鐵還原菌提供理想的基質(zhì)[12,30-31]，根際地桿菌數(shù)量也顯著高于對照組(圖5c). 因此，植物根系泌氧有利于增加鐵氧化菌和鐵還原菌的數(shù)量，促進沉積物中微生物鐵循環(huán)[32].

沉積物中同時檢測到嘉利翁氏菌和地桿菌表明Fe(Ⅱ)氧化和Fe(Ⅲ)還原是同時存在的. 而根際沉積物中大量貧結(jié)合態(tài)鐵氧化物表明Fe(Ⅱ)氧化速率高于Fe(Ⅲ)還原速率[31]. Weiss等[11]通過室內(nèi)模擬實驗發(fā)現(xiàn)根際鐵還原速率是非根際的2倍，也說明根際鐵還原的重要性. 另外一個影響鐵還原菌的重要因素是沉積物中有機質(zhì)含量[31]，這主要是由于有機質(zhì)可以為異化鐵還原提供電子供體[33]. 因而，根際沉積物中高豐度的貧結(jié)合態(tài)鐵、嘉利翁氏菌和地桿菌(圖4和圖5)表明根系泌氧作用有利于促進根際微生物鐵循環(huán).

4 結(jié)論

1)黑藻的根系泌氧能使沉積物-水界面的溶解氧濃度增加，表層有氧層厚度增加.

2)黑藻通過根系泌氧作用將根際環(huán)境中Fe(Ⅱ)氧化，并改變沉積物中鐵的形態(tài)，是根際鐵循環(huán)的重要參數(shù).

3)黑藻根系泌氧對根際耗氧微區(qū)微生物有一定的影響：根系泌氧使根際嘉利翁氏菌和地桿菌數(shù)量增加，進一步影響根際微生物鐵循環(huán).

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Effects of root radial oxygen loss of Hydrilla verticillata on typical iron-oxidizing bacteria and iron-reducing bacteria in sediment

TIAN Cuicui1,2& XIAO Bangding1,2**

(1:InstituteofHydrobiology,ChineseAcademyofSciences,Wuhan430072,P.R.China)(2:KeyLaboratoryofAlgalBiologyofChineseAcademyofSciences,Wuhan430072,P.R.China)

Iron is the most ubiquitously abundant redox active transition metal on earth, which has an important indication on lake sediments.Root radial oxygen loss (ROL) of aquatic plant allows root to create a rhizosphere oxidized zone and the rhizosphere is a biologically active zone in which oxidation and reduction occurred simultaneously. In the present study, microelectrodes and real time qPCR were used to investigate the effects of ROL ofHydrillaverticillataon typical iron-oxidizing bacteria (Gallionella) and iron-reducing bacteria (Geobacter) in sediment. The results showed thatH.verticillatagrew quickly, and changed valence state and fraction of iron. ROL was an important parameter, which affected the bacterial communities of rhizosphere. The abundances of Gallionella and Geobacter were higher in the rhizosphere, suggesting that the rhizosphere promoted microbial Fe cycling. These results provide insight into the contribution of microorganism in Fe cycling.

Hydrillaverticillata; radial oxygen loss; Gallionella; Geobacter; real time qPCR; sediment

*國家水體污染控制與治理科技重大專項(2013ZX07102005)資助.2015-09-08收稿；2015-11-16收修改稿. 田翠翠(1989～)，女，博士研究生，實驗師；E-mail：tiantian5629@126.com.

**通信作者；E-mail：bdxiao@ihb.ac.cn.