楊丹麗，張迎秋，李　媛，秦勝堂

(大連醫(yī)科大學 腫瘤干細胞研究院，遼寧 大連 116044)

?

冬凌草甲素對甲狀腺癌BCPAP細胞增殖的抑制作用

楊丹麗，張迎秋，李媛，秦勝堂

(大連醫(yī)科大學 腫瘤干細胞研究院，遼寧 大連 116044)

目的研究冬凌草甲素對甲狀腺癌BCPAP細胞增殖的抑制作用。方法使用0、0.5、1、2、5、10、20、50、100 μmol/L濃度的冬凌草甲素處理甲狀腺癌細胞株BCPAP 48 h后，用CCK8測定細胞增殖率，繪制增殖曲線，計算細胞半數(shù)抵制率(IC50)。實驗組加入接近IC50濃度(10 μmol/L)的冬凌草甲素，對照組細胞正常培養(yǎng)36 h后，采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，利用Western blot檢測凋亡基因PARP、Erk1/2和p-Erk1/2蛋白的表達。結(jié)果冬凌草甲素能顯著抑制BCPAP細胞增殖，在2～20 μmol/L時，具有明顯的量效關(guān)系。流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，實驗組細胞早期凋亡率(2.83±0.70)%，晚期凋亡率(1.43±0.31)%，總凋亡率(4.27±1.01)%，均明顯升高(P<0.05)。Western blot發(fā)現(xiàn)，剪切后的PARP及p-Erk蛋白的表達水平分別上調(diào)了1.5倍和1.8倍，上調(diào)顯著(P值均<0.05)。結(jié)論冬凌草甲素可抑制甲狀腺癌細胞株BCPAP增殖，其可能與誘導細胞凋亡有關(guān)。

冬凌草甲素；甲狀腺癌細胞株BCPAP；細胞增殖；細胞凋亡

[引用本文]楊丹麗，張迎秋，李媛,等.冬凌草甲素對甲狀腺癌BCPAP細胞增殖的抑制作用[J].大連醫(yī)科大學學報，2016,38(4)：330-333.

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，約占全身惡性腫瘤的1%。甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌癥中最常見的組織類型，是典型的分化良好型腫瘤，治愈率高而且預后良好[1-2]。然而侵襲性甲狀腺乳頭狀腫瘤和一些該腫瘤的變異型仍會導致10%左右的病人10年內(nèi)病情復發(fā)和腫瘤轉(zhuǎn)移，所以盡管乳頭狀甲狀腺癌分化良好[3]，但仍能發(fā)生轉(zhuǎn)移而且存在一定的抗藥性，因此針對這種惡性腫瘤的治療方法還需要突破[4]。近期文獻報道冬凌草甲素具有極強的抗腫瘤作用[5-7]，但是它對于甲狀腺癌的作用少有報道。本研究擬探討冬凌草甲素對甲狀腺癌細胞株BCPAP增殖的影響,希望為甲狀腺癌的相關(guān)治療提供幫助。

1　材料和方法

1.1主要試劑與儀器

冬凌草甲素標準品購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；人甲狀腺癌BCPAP細胞株為大連醫(yī)科大學腫瘤干細胞研究院劉強課題組惠贈；細胞凋亡檢測試劑盒購自凱基生物；冬凌草甲素用1 mL DMSO溶解后加入9 mL ddH2O，配制成含10%DMSO濃度為10 mmol/L的儲液，4 ℃保存，使用時用培養(yǎng)基稀釋成相應濃度，對照組為含相應含量DMSO的培養(yǎng)基。

1.2細胞培養(yǎng)

培養(yǎng)所需DMEM培養(yǎng)基、胰酶和胎牛血清均購自Gibco公司。

細胞培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM。0.05%胰酶消化傳代。

1.3CCK8測定細胞增殖率

取對數(shù)生長期細胞，以5×104/mL接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，過夜培養(yǎng)使細胞貼壁。24 h后分別新鮮加入含0(對照組)、0.5、1、2、5、10、20、50、100 μmol/L冬凌草甲素的培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，吸棄培養(yǎng)基，按照試劑盒說明書向每孔中加入10 μL CCK8溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，用酶標儀測定450 nm處的吸光度。將各測試孔的OD值減去本底OD值(完全培養(yǎng)基加10 μL CCK8溶液，無細胞)后，計算細胞增殖率：增殖率=OD實驗組/OD對照組×100%。

1.4流式細胞儀檢測細胞凋亡

使用凱基生物的Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒，調(diào)整細胞濃度為1.5×105/mL，將細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔2 mL，培養(yǎng)過夜使細胞貼壁吸棄培養(yǎng)基，實驗組加入含10 μmol/L冬凌草甲素的培養(yǎng)液2 mL，對照組加入含0.2 μLDMSO的培養(yǎng)液2 mL，培養(yǎng)36 h。0.05%胰酶消化后，取(1～5)×105個重懸的細胞1000 g離心5 min后棄上清，按說明書分別加入500 μL binding buffer重懸，5 μL Annexin V輕輕混勻，及5 μL PI混勻，室溫避光反應15 min，進行流式細胞儀檢測。

1.5Western blot實驗

收集相應10 μmol/L冬凌草甲素處理36 h的實驗組細胞和DMSO處理36 h的對照組細胞裂解提取蛋白。以10%SDS-PAGE膠分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移膜。5%脫脂奶粉封閉后分別以不同的抗體(DNA修復酶PARP/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶erk1/2及p-erk1/2，根據(jù)抗體說明書1∶1000稀釋)4 ℃孵育過夜，洗去一抗后，以辣根過氧化物酶(HRP)連接的二抗室溫孵育1 h，洗滌，ECL試劑盒顯示條帶，β-actin作為內(nèi)參。

1.6統(tǒng)計學方法

2　結(jié)　果

2.1冬凌草甲素對BCPAP細胞體外增殖作用的影響

冬凌草甲素作用于BCPAP細胞系48 h后，細胞增殖率曲線可見冬凌草甲素濃度在2～20 μmol/L時，濃度越高細胞增殖率越低，具有明顯的量效關(guān)系。見圖1。其細胞半數(shù)抑制率(IC50)為10.49 μmol/L，隨著冬凌草甲素濃度的進一步增加，BCPAP細胞系的增殖率明顯下降，最終接近于停止。

圖1　不同濃度冬凌草甲素(0～100 μmol/L)作用于BCPAP細胞48 h后的增殖曲線Fig 1 The proliferation curve of different concentrations of Oridonin (0-100 μmol/L)on BCPAP cell after 48 h

2.2流式細胞儀結(jié)果分析

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率均升高(t分別為18.59,4.61,12.87)，尤其是早期凋亡組變化更為顯著，差異均有顯著性意義(P<0.05)。見表1，圖2。

表 1冬凌草甲素對BCPAP細胞凋亡的影響

Tab 1 Effect of oridonin inducing apotosis of BCPAP cells(%)

早期凋亡率晚期凋亡率總凋亡率對照組2.83±0.701.43±0.31 4.27±1.01實驗組34.87±3.031)4.40±0.661)39.27±3.611)

1)與對照組比較，P<0.05

圖2　冬凌草甲素對BCPAP細胞凋亡的影響Fig 2 Oridonin induces the apoptosis of BCPAP cellsA:對照組；B:實驗組

2.3PARP和Erk1/2的表達

Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組被剪切PARP和磷酸化Erk1/2的表達上調(diào)，根據(jù)灰度值比較分析，剪切后的PARP及p-Erk的表達水平分別上調(diào)了1.5倍和1.8倍，上調(diào)顯著(P值均<0.05)。見圖3。

圖3　凋亡相關(guān)蛋白表達水平Fig 3 Expression levels of apoptosis-related proteins

3　討　論

冬凌草甲素是植物冬凌草中的一種四環(huán)二萜化合物，是冬凌草中的主要活性成分[8]。近年來中藥活性成分治療腫瘤成為研究的熱點之一[9]。已有許多文獻報道冬凌草甲素對多種腫瘤具有殺傷作用[10-11]，但是它對于甲狀腺癌的作用還無從得知。本研究發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素可顯著抑制甲狀腺癌BCPAP細胞株的增殖，誘導其凋亡。

本研究采用不同濃度的冬凌草甲素作用于BCPAP細胞48 h，發(fā)現(xiàn)濃度在2～20 μmol/L時，隨著濃度的增加，冬凌草甲素對BCPAP的增殖抑制作用增強，具有明顯的濃度依賴性。采用接近IC50的濃度(10 μmol/L)進行后續(xù)研究，探討冬凌草甲素抑制細胞增殖的機制。

本研究采用流式細胞術(shù)AV-PI雙染的方法檢測了冬凌草甲素作用于甲狀腺癌細胞株BCPAP 36 h后細胞凋亡比率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，實驗組細胞凋亡比例顯著升高，尤其早期凋亡的比例更為顯著，這提示冬凌草甲素可能是通過誘導細胞發(fā)生早期凋亡來抑制增殖。本研究利用western blot檢測了冬凌草甲素作用后，凋亡相關(guān)蛋白及通路核心分子的變化。結(jié)果表明冬凌草甲素的加入明顯上調(diào)了被剪切PARP及p-Erk的蛋白水平，而并不改變total Erk的蛋白表達，這與Erk磷酸化之后發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導作用是一致的。這一結(jié)果有助于進一步探討其作用機制。

總之，本研究顯示冬凌草甲素可抑制甲狀腺癌BCPAP細胞增殖，其機制可能是通過誘導細胞凋亡[12]。今后將進一步深入探討其對腫瘤抑制作用的機制和對細胞周期的影響，為甲狀腺癌的臨床治療提供實驗基礎(chǔ)。

[1] Bae JM. Thyroid Cancer: We Need a Carcinogen-specific Genome Study[J]. J Korean Med Sci,2015, 30(12): 1920-1921.

[2] Williams D. Thyroid Growth and Cancer[J]. Eur Thyr J,2015,4(3):164-173.

[3] Baser B, Munjal VR, Roy MT. Papillary carcinoma of thyroid with an unusual presentation[J]. Indian J Laryngol Head Neck Surg, 2015,67(suppl 1):145-148.

[4] Lin RY. Thyroid cancer stem cells[J]. Nature Rev Endocrinol,2011,7(10): 609-616.

[5] 趙冬,劉紅耀,趙喚.冬凌草甲素對膀胱癌T24細胞增殖的抑制作用[J].中國當代醫(yī)藥,2013,20(14):4-5,8.

[6] Li Y, Wang Y,Wang S, et al. Oridonin phosphate-induced autophagy effectively enhances cell apoptosis of human breast cancer cells[J]. Med Oncol, 2015,32(1): 365.

[7] 劉加軍,張俊峰,林東軍,等.冬凌草甲素對Nalm-6細胞的增殖抑制作用及其作用機制[J].中華腫瘤防治雜志,2009,16(13):966-969,989.

[8] 劉淑云,譚英姿,范明松,等.冬凌草甲素研究進展[J].中國當代醫(yī)藥,2012,19(13):17-18,20.

[9] Gui Z, Li S, Liu X, et al. Oridonin alters the expression profiles of microRNAs in BxPC-3 human pancreatic cancer cells[J]. BMC Complemen Alternat Med,2015,15(1):117.

[10] Shi M, Ren X, Wang H, et al. A novel combination of oridonin and valproic acid in enhancement of apoptosis induction of HL-60 leukemia cells[J]. Int J Oncol,2016,48(2):734-746.

[11] Liu Y, Liu YZ, Zhang RX,et al. Oridonin inhibits the proliferation of human osteosarcoma cells by suppressing Wnt/beta-catenin signaling[J]. Int J Oncol,2014,45(2):795-803.

[12] Gu Z, Wang X, Qi R, et al. Oridonin induces apoptosis in uveal melanoma cells by upregulation of Bim and downregulation of Fatty Acid Synthase[J]. Biochem Biophys Res Commun,2015, 457(2): 187-193.

Study of Oridonin inhibiting proliferation of thyroid carcinoma cell line BCPAP

YANG Dan-li, ZHANG Ying-qiu, LI Yuan, QIN Sheng-tang

(InstituteofCancerStemCell,DalianMedicalUniversity，Dalian116044，China)

Objective To investigate the mechanism of Oridonin on proliferation of BCPAP thyroid carcinoma. Methods Thyroid carcinoma cell line BCPAP was treated 48 h with Oridonin. CCK8 method was used to detect cell proliferation rate, flow cytometry used in apoptosis analysis and western blot method used to detect PARP and Erk1/2 expression. SAS 9.3 software was used in statistical analysis. Results Oridonin inhibited proliferation of BCPAP thyroid carcinoma significantly and had dose-dependent in middle-level concentration (2-20 μmol/L).The cells treated with oridonin showed higher apoptosis frequency than those non-treated (P<0.05). Spliced PARP and p-Erk1/2 expression increased in cells treated with oridonin. Conclusion Oridonin would inhibit proliferation of BCPAP by induction cell apoptosis.

Oridonin; thyroid carcinoma cell line BCPAP; cell proliferation; cell apoptosis

楊丹麗(1987-)，女，河南商丘人，助理實驗師。E-mail：ydanli963@163.com

秦勝堂，助理實驗師。E-mail：qinlang8188@163.com

論著10.11724/jdmu.2016.04.04

R736.1

A

1671-7295(2016)04-0330-04

2015-12-05;

2016-04-06)