劉海燕,侯　巍,王遠微,楊發(fā)龍

(1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院,四川成都611130;2.四川省動物疫病預(yù)防控制中心,四川成都610041; 3.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川成都610041;4.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶北碚400715)

四川地區(qū)豬沙門菌的分離鑒定及其耐藥性分析

劉海燕1,侯巍2,王遠微3,4,楊發(fā)龍3

(1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院,四川成都611130;2.四川省動物疫病預(yù)防控制中心,四川成都610041; 3.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川成都610041;4.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶北碚400715)

為了解四川地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)豬群的沙門菌的帶菌情況,采用病原菌的形態(tài)學(xué)觀察、生化鑒定、血清學(xué)鑒定和PCR鑒定方法對采自四川10個規(guī)?；i場的600份健康豬糞便進行了沙門菌分離鑒定,并對鑒定出27株沙門菌進行了藥物敏感性試驗和耐藥分析.結(jié)果表明,來自四川地區(qū)的10個健康豬群的沙門菌總檢出率為4.5%(27/600);各個市縣的沙門菌的分離率介于1.7%～6.7%之間;分離到沙門菌對四環(huán)素、復(fù)方新諾明以及氟苯尼考的耐藥率分別為96.3%、96.3%和92.6%,耐藥率大于85%的藥物有氨芐西林、奧格門丁、卡那霉素和恩諾沙星,慶大霉素(74.1%)和大觀霉素(77.8%)的耐藥率也比較嚴(yán)重,頭孢噻呋、頭孢唑啉、達氟沙星和多黏菌素E是較為敏感的藥物.

豬;沙門菌;分離鑒定;耐藥性

沙門菌(Salmonella)是重要的人獸共患病之一的病原,可引起人和動物多種不同臨床表現(xiàn)的發(fā)病,是人類食物中毒的主要病原之一.它不但影響畜牧業(yè)的健康發(fā)展,而且嚴(yán)重威脅人民的身體健康.注射或者飼料添加抗生素是目前全世界各國防治沙門菌疾病的主要方式,但近年來臨床抗生素的濫用以及飼料中的添加造成了沙門菌的嚴(yán)重耐藥[1].若不能及時研究并解決沙門菌耐藥豬場的沙門菌感染問題,會給沙門菌病的預(yù)防及控制造成巨大的困難.

本文對四川各市縣規(guī)?；B(yǎng)豬場進行了沙門菌的分離鑒定,了解四川地區(qū)豬沙門菌的流行情況及耐藥特征,為該地區(qū)豬沙門菌病的科學(xué)防治提供理論依據(jù).

1　材料與方法

1.1樣本采集從2014年8月至2014年12月,分別在四川省各地區(qū)的10個規(guī)?；i場,用棉拭子采集臨床健康豬直腸糞便樣本,60份/豬場,不同生長周期(哺乳期、保育期、生長期)各采集20份,共600份.

1.2培養(yǎng)基及主要試劑科瑪嘉沙門菌顯色培養(yǎng)基,鄭州博賽生物技術(shù)股份公司;多價菌體(O)抗血清,杭州天和微生物試劑有限公司;Taq DNA聚合酶、DNA Markers、dNTPs,TaKaRa公司;瓊脂糖,Oxoid公司;沙門菌參考菌株以及藥敏質(zhì)控菌株ATCC25922均由西南民族大學(xué)動物醫(yī)學(xué)實驗室保存提供.

1.3細(xì)菌的分離培養(yǎng)與形態(tài)觀察將采集的樣本接種到BPW增菌液中,于37℃培養(yǎng)箱中增菌24 h,然后取1 mL轉(zhuǎn)種到TTB選擇性增菌液中,42℃,培養(yǎng)24 h.然后將增菌液分別接種于科馬嘉顯色培養(yǎng)基和S.S.培養(yǎng)基上,于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.挑取S.S.培養(yǎng)基和科馬嘉顯色培養(yǎng)基上的疑似菌落,按照常規(guī)方法進行革蘭染色鏡檢,觀察菌體的形態(tài)、大小.

1.4生化鑒定挑取純化新鮮培養(yǎng)物接種于微量生化反應(yīng)管中,于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h,對照生化編碼手冊進行鑒定.

1.5血清學(xué)鑒定采用沙門菌A-F多價血清玻板凝集試驗對符合沙門菌生化特性的陽性菌株做血清學(xué)鑒定,其操作遵循產(chǎn)品使用說明書.

1.6PCR鑒定選取Rahn K等[8]研究報道的擴增沙門菌屬invA基因特異性片段的引物,目的片段大小284 bp,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,其序列如下:P1:5′-GTGAAAT?TATCGCCACGTTCGGGCAA-3′,P2:5′-TCATCG?CACCGTCAAAGGAACC-3′;對以上鑒定為陽性的菌株進行PCR擴增,反應(yīng)條件和反應(yīng)體系見文獻.

1.7藥敏試驗采用最小抑菌濃度(MIC)方法評價分離菌株的耐藥情況.用大腸桿菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株,設(shè)立只有菌液沒有藥液的陽性對照組和不含藥液和菌液的陰性對照組.

2　結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌的分離培養(yǎng)從采集的600份樣本中分離到疑似沙門菌47株,染色鏡檢均為革蘭陰性短小桿菌、大小均一、多散在、無芽抱、無莢膜.S.S.平板上的菌落較小、無色透明或中間黑色周圍無色透明、邊緣整齊、光滑凸起;科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上為紫紅色的菌落.

2.2生化鑒定結(jié)果鏡檢的47株疑菌中有35株細(xì)菌符合沙門菌生化特征.35株分離菌能分解葡萄糖、甘露醇、麥芽糖,產(chǎn)酸產(chǎn)氣;不利用乳糖和蔗糖;能利用枸櫞酸鹽;不分解尿素;甲基紅試驗陽性;硫化氫試驗產(chǎn)生H2S.

2.3血清學(xué)鑒定結(jié)果符合生化特性的35株疑似菌中有30株細(xì)菌與沙門菌A-F多價血清發(fā)生了凝集反應(yīng).

2.4PCR鑒定結(jié)果對分離出的30株疑似沙門菌進行PCR鑒定,其中27株細(xì)菌擴增得到invA基因大小為284 bp的片段,與預(yù)期目的片段大小相同,部分結(jié)果見圖1.隨機抽取5株細(xì)菌的擴增片段產(chǎn)物進行克隆測序,結(jié)果顯示與GenBank中沙門菌的invA基因同源性為100%,證明所擴增序列正確.

2.5健康豬沙門菌攜帶率用生化試驗、血清學(xué)試驗結(jié)合PCR檢測對四川省各地區(qū)采集的600份樣本進行沙門菌的分離鑒定.共分離到27株沙門菌,檢出率為4.5%(27/600).各地區(qū)豬場的檢出率見表1.

表1　四川不同地區(qū)10個豬場沙門菌的檢出率

2.6藥敏試驗結(jié)果當(dāng)陽性對照組細(xì)菌明顯生長,陰性對照組無細(xì)菌生長時,以實驗組孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC值.以MIC值位于美國臨床試驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會標(biāo)準(zhǔn)的敏感(susceptible,S)、中介(intermediate,I)、耐藥(resistance,R)分界點值范圍判斷結(jié)果.27株待檢沙門菌對14種抗生素表現(xiàn)出不同程度的耐藥,結(jié)果見表2.對氨芐西林、卡那霉素、大觀霉素、四環(huán)素、奧格門丁、慶大霉素、氟苯尼考、復(fù)方新諾明、恩諾沙星等抗生素的耐藥率比較高,從74.1%到96.3%.對頭孢噻肟、多黏菌素E和頭孢唑啉比較敏感.

圖1　沙門菌invA基因PCR檢測

表2　沙門菌對14種抗生素的耐藥情況

3　討論

本試驗從四川各市縣規(guī)?；B(yǎng)豬場采樣,通過生化試驗、血清學(xué)試驗以及PCR試驗,共分離鑒定出27株沙門菌.由于生化試驗存在一定的誤差,而沙門菌與志賀菌以及大腸桿菌均有一定的交叉抗原,因而血清學(xué)試驗結(jié)果也不能作為完全的判定標(biāo)準(zhǔn).PCR鑒定方法是目前比較穩(wěn)定和公認(rèn)的鑒定方法,結(jié)合生化和血清學(xué)鑒定結(jié)果比較準(zhǔn)確.現(xiàn)在大量關(guān)于鑒定沙門菌屬特異性引物被報道.但在2003年Malorny等人用43種不同血清型沙門菌和47種非沙門菌對4種沙門菌特異性引物進行比較,發(fā)現(xiàn)僅invA基因引物可以檢出全部沙門菌,僅在一些大腸桿菌和枸櫞酸桿菌中invA基因會擴增出非特異性條帶,由于與目的條帶大小差距較大,不會影響結(jié)果判斷,其余3對引物均有漏檢[2].因此本研究選擇invA基因引物作為鑒定引物.

本試驗沙門菌總分離率為4.5%(27/600),低于加春生[2]等對哈爾濱地區(qū)豬沙門菌的檢出率5.83%(35/600)以及張瑋[4]對安徽省6個地區(qū)豬場沙門菌的檢測結(jié)果6.11%(22/360).這可能是不同地區(qū)豬場抗生素的添加種類及添加量不同引起的.此外,除綿陽和樂山兩地區(qū)的分離率略高于其他地區(qū)之外,其他8個地區(qū)的分離率都相對較低,這可能是四川是養(yǎng)豬大省,豬場的飼養(yǎng)管理,特別是沙門菌的控制做得較好.

藥敏試驗顯示,分離的豬源沙門菌對于氨芐西林、奧格門丁、慶大霉素、卡那霉素、恩諾沙星、四環(huán)素、氟苯尼考以及復(fù)方新諾明都有耐藥性,甚至對氟苯尼考的耐藥率達92.6%、對四環(huán)素和復(fù)方新諾明的耐藥率達到96.3%,這可能與飼料中長期添加磺胺類藥物、氯霉素以及四環(huán)素類抗菌素有關(guān);而對頭孢唑啉、達氟沙星敏感,對頭孢噻呋、多黏菌素E較為敏感,提示可以使用以上藥物進行治療.當(dāng)前,抗生素濫用導(dǎo)致耐藥性普遍存在,從本試驗結(jié)果看出,雖然四川省沙門菌檢出率較低,但是耐藥性仍然存在,要徹底消滅該病,必須淘汰帶菌豬,建立無菌豬群,消滅傳染源,切斷垂直傳播途徑.在人們高度關(guān)注食品安全的今天,沙門菌這一食源性疾病,必須引起高度重視.

[1]加春生,毛澤明,王曉楠,等.豬沙門菌的分離鑒定及其耐藥性分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,45(8):49-54.

[2]任學(xué)兵,湯德元,楊澤平,等.豬沙門菌耐藥性的研究進展[J].豬業(yè)科學(xué),2009,12:36-39.

[3]Malorny B,Hoorfar J,Bunge C,et al.Multicenter Validation of the Analytical Accuracy of Salmonella PCR:towards an International Standard[J].Applied and Environmental Microbiology,2003,1(69): 290-296.

[4]張瑋.安徽省部分豬場生豬沙門菌帶菌情況與耐藥性研究[D].合肥:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué),2010:56-58.

Identification and resistanceofSalmonellaisolated from pigs of Sichuan province

LIU Hai-yan1,HOU Wei2,WANG Yuan-wei3,4,YANG Fa-long3
(1.Chengdu Agricultural College,Chengdu 611130,China;2.Animal disease prevention and control center of Sichuan province,Chengdu 610041,China;3.College of Life Science and Technology,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China;4.College of food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China)

27 Salmonella strains were isolated from 600 feces in the rectal of pigs from the large-scale pig farms of Sichuan province by morphological observation,biochemical system,serological identification and polymerase chain reaction.Antimicrobial susceptibility test and drug resistance of 27 strains to 14antibacterial were performed by Krby-Bauer method.The results showed that the overall detection rate of Salmonella was 4.5%and the total rate of separation was from 1.7%to 6.7%in the different cities of Sichuan.The resistant rate of 27 strains to tetracycline,sulfamethoxazole,florfenicol,ampicillin,augmentin,kanamycin,enroflox?acin,gentamicin,and spectinomycin was 96.3%,96.3%,92.6%,88.9%,88.2%,85.2%,85.2%,74.1%and 77.8%,respectively. However,they were sensitive to cefotaxime,cefazolin,danofloxacin and polymyxin e.The findings show that Salmonella infections exist in pig farms in Sichuan and the antimicrobial resistance of Salmonella is very severe.

pig;Salmonella;isolation and identification;resistance

YANG Fa-long

S852.61+2

A

0529-6005(2016)06-0086-03

2015-09-10

"十二五"高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(2012-AA101304)

劉海燕(1979-),女,講師,碩士,從事病原微生物研究,E-mail:280170380@qq.com

楊發(fā)龍,E-mail:yfalong@hotmail.com