張　壽,常　蘭,雷乃虎,嚴(yán)作云,李福壽,任青加,顏廷勝

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系,青海西寧810016;2.青海省都蘭縣獸醫(yī)站,青海都蘭816100;3.青海省天峻縣獸醫(yī)站,青海天峻817200)

牦牛乏情期和懷孕期卵巢微血管密度的測定

張壽1,常蘭1,雷乃虎1,嚴(yán)作云2,李福壽3,任青加3,顏廷勝3

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系,青海西寧810016;2.青海省都蘭縣獸醫(yī)站,青海都蘭816100;3.青海省天峻縣獸醫(yī)站,青海天峻817200)

為進(jìn)一步保護(hù)牦牛資源和提高牦牛繁殖能力提供基礎(chǔ)資料,本研究對牦牛乏情期和懷孕期卵巢中微血管進(jìn)行了研究.采用免疫組織化學(xué)技術(shù)和圖象分析方法對牦牛乏情期卵巢、懷孕期卵巢微血管密度進(jìn)行測定.結(jié)果乏情期和懷孕期牦牛卵巢微血管光密度值不同.懷孕期有黃體側(cè)卵巢的黃體處微血管光密度值最大,懷孕期有黃體側(cè)卵巢微血管光密度值次之,乏情期卵巢、懷孕期無黃體側(cè)卵巢和懷孕期有黃體側(cè)卵巢的無黃體處微血管光密度值為較小,且后三者之間差異不顯著(P>0.05),而懷孕期有黃體側(cè)卵巢的黃體處、懷孕期有黃體側(cè)卵巢的微血管光密度值與其他各組間差異均顯著(P<0.05).

牦牛;卵巢;微血管;光密度值

動物卵巢的功能直接影響著其繁殖性能,而決定卵巢功能的主要因素之一就是卵巢微血管密度(microvessel density,MVD).微血管密度大,血液供應(yīng)充足,卵巢上卵泡的發(fā)育、黃體的形成,以及激素的分泌就有了保障.國內(nèi)外學(xué)者對不同動物的卵巢結(jié)構(gòu)、微血管的變化等進(jìn)行了許多研究,如陳洋[1]等探討了綿羊發(fā)情周期不同時期各級卵泡微血管生成狀態(tài)及卵泡微血管生成與卵泡發(fā)育的關(guān)系,Imanirad P等[2]、孫健等[3]對小鼠卵巢微血管進(jìn)行了研究.但迄今為止還未見到有關(guān)牦牛卵巢微血管的研究報道,為進(jìn)一步保護(hù)牦牛資源和提高牦牛繁殖能力提供基礎(chǔ)資料,我們進(jìn)行了此項研究.

1　材料與方法

1.1試驗動物選擇生活在青海省天峻縣(平均海拔4 000 m)臨床健康的乏情期和懷孕期(懷孕2個月)成年(5歲)母牦牛各5頭,放血致死,迅速取兩側(cè)卵巢,4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定.

1.2主要儀器LEICA RM2235手搖式切片機(德國);KH-P2恒溫攤片烤片機;Olympus BX51型光學(xué)顯微鏡(日本);Olympus BA310圖象采集系統(tǒng)(日本);IMAGE PRO PLUS 6.0圖象分析系統(tǒng)(美國).

1.3主要試劑多聚甲醛,蘇木精染液,酒精,二甲苯,兔抗CD34抗體(批號:BA0532),UltraSensitiveTMSP超敏試劑盒(兔)(KIT-9706批號:1310169706),DAB顯色試劑盒(批號:08H22C22).

1.4免疫組織化學(xué)染色方法經(jīng)4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定的卵巢組織,常規(guī)石蠟包埋、切片,片厚4 μm;切片脫蠟至水,蒸餾水洗3次,每次3 min,再用0.01 mol/L PBS沖洗3次,每次8 min,以下每步驟間均以0.01 mol/L PBS充分洗滌;修復(fù)液高壓修復(fù)2 min;滴加內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑37℃溫箱孵育20 min;加非免疫動物血清(羊) 37℃溫箱孵育45 min,不洗;入兔抗CD34多克隆抗體(1∶200),4℃冰箱過夜;滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG,37℃溫箱孵育2 h;滴加鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化酶,37℃溫箱孵育30 min;用DAB顯色劑顯色6 min,蒸餾水終止反應(yīng);蘇木精染液復(fù)染、脫水、透明、封片.

1.5觀察與數(shù)據(jù)統(tǒng)計在光學(xué)顯微鏡下400倍放大觀察切片,每枚卵巢選3張切片,每組共15張,每張切片選6-7個微血管密度大、染色深的不重復(fù)視野,用圖象采集系統(tǒng)采集圖片,所采集的圖片用IMAGE PRO PLUS 6.0軟件(德國)進(jìn)行累計光密度值的測定,每組累計光密度值中從大到小依次取60個數(shù)據(jù)進(jìn)行單位光密度值計算,所得數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件做統(tǒng)計學(xué)處理,結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,并對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析并比較.

2　結(jié)果

2.1卵巢微血管形態(tài)和分布免疫組化染色結(jié)果顯示,卵巢中有大量微血管存在,主要分布于卵巢皮質(zhì)、髓質(zhì)和黃體.卵巢皮質(zhì)和髓質(zhì)中的微血管在乏情期和懷孕期的分布和形態(tài)大致相同.但黃體內(nèi)微血管在分布和形態(tài)上與卵巢皮質(zhì)和髓質(zhì)的有明顯區(qū)別,黃體內(nèi)的微血管染色深、管腔較大(見中插彩版圖1).

2.2牦牛乏情期和懷孕期卵巢微血管密度乏情期和懷孕期牦牛卵巢微血管光密度值不同.懷孕期有黃體側(cè)卵巢的黃體處微血管光密度值最大,懷孕期有黃體側(cè)卵巢微血管光密度值次之,乏情期卵巢、懷孕期無黃體側(cè)卵巢和懷孕期有黃體側(cè)卵巢的無黃體處微血管光密度值為較小,且后三者之間差異不顯著(P>0.05),而懷孕期有黃體側(cè)卵巢的黃體處、懷孕期有黃體側(cè)卵巢的微血管光密度值與其他各組間差異均顯著(P<0.05)(見表1).

表1　牦牛乏情期和懷孕期卵巢微血管密度

3　討論

血管新生(angiogenesis)是指在機體生長發(fā)育過程中或創(chuàng)傷修復(fù)、缺血、缺氧和炎癥等情況下,原有微血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cellE,C)經(jīng)過出芽、遷移、增殖與基質(zhì)重塑等最終形成新毛細(xì)血管的過程.在正常生理條件下,血管增生主要出現(xiàn)于卵巢、子宮、胎盤等處,且呈周期性變化,這與生殖功能的調(diào)節(jié)密切相關(guān).在排卵前,原始卵泡主要依靠間質(zhì)血管供血,并沒有血管網(wǎng)存在.原始卵泡開始發(fā)育后,微血管出現(xiàn)在卵泡膜層,而且隨著卵泡由原始卵泡發(fā)育為竇前卵泡及由竇前卵泡進(jìn)一步發(fā)育為竇狀卵泡的過程,微血管的密度也同步增加.在卵泡發(fā)育過程中,血管生成持續(xù)進(jìn)行,最終形成巨大的微血管網(wǎng),但是都僅限于分布在卵泡膜層,并未突破基膜進(jìn)入顆粒細(xì)胞層.排卵后,即黃體發(fā)育早期,血管增生最為明顯.隨著卵泡液的流出,卵泡壁塌陷,由于顆粒細(xì)胞層和卵泡內(nèi)膜細(xì)胞之間的去聚合作用,內(nèi)皮細(xì)胞合成分泌的蛋白酶降解基膜,基膜消失,血液流入卵泡腔中,形成早期黃體,隨后原卵泡膜中的血管內(nèi)皮細(xì)胞開始以出芽的形式遷移進(jìn)黃體化的顆粒細(xì)胞區(qū)域,緊接著就進(jìn)行劇烈的血管生成,即內(nèi)皮細(xì)胞增殖、相互粘附并連接,而后形成管腔樣結(jié)構(gòu),隨著基質(zhì)重塑和平滑肌細(xì)胞的包繞及血管的相互吻合形成血管網(wǎng),最終擴(kuò)散到整個黃體組織,為黃體的發(fā)育提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)及激素[4-6].早期黃體快速形成致密的毛細(xì)血管網(wǎng)可以確保產(chǎn)生激素的細(xì)胞獲得氧氣、營養(yǎng)、并合成激素,同時釋放大量的激素用于早期妊娠的建立和維持[4-5].本次研究表明,牦牛懷孕早期(2個月)黃體處微血管密度最大,且懷孕期黃體側(cè)卵巢的微血管密度明顯大于發(fā)情期卵巢,說明牦牛懷孕早期有黃體側(cè)卵巢微血管大量增加有利于黃體的形成和孕酮的分泌,這對高海拔低氧環(huán)境下牦牛的正常懷孕具有十分重要意義.另外本次研究得出牦牛懷孕期無黃體側(cè)卵巢、懷孕期有黃體側(cè)卵巢無黃體處的微血管和乏情期卵巢之間無顯著性差異,這說明牦牛懷孕后,無黃體側(cè)卵巢和乏情期的卵巢一樣都處于靜止?fàn)顟B(tài),不隨懷孕的生理變化而產(chǎn)生微血管的增生,這可能是牦牛卵巢微血管變化的特點,也是牦牛的發(fā)情表現(xiàn)為季節(jié)性發(fā)情的原因之一.

[1]陳洋,王典,曹穎楠,等.綿羊發(fā)情周期卵巢微血管密度的觀察[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2012,04:637-640.

[2]Imanirad P,Solaimani K P,Crisan M,et al.HIF1α is a regulator of hematopoietic progenitor and stem cell development in hypoxic sites of the mouse embryo[J].Stem Cell Research,2014,12(1):24-35.

[3]孫健,肖紅衛(wèi),鄭新民,等.不同劑量PMSG對未性成熟小鼠卵巢發(fā)育的影響[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2009,28(4):450-452.

[4]羅倩萍,張正紅,陳佳潔,等.VEGF在家畜黃體早期發(fā)育過程中對血管生成的調(diào)控作用[J].家畜生態(tài)學(xué)報,2011,06:124-128.

[5]吳艷青,張正紅,羅倩萍,等.HIF-1在卵巢黃體發(fā)育過程中對血管新生的調(diào)控作用[J].中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報,2012,10: 1042-1048.

[6]況立洪.轉(zhuǎn)錄因子Nrf2對大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞在血管生成中作用的影響及其機制的體外研究[D].重慶:第三軍醫(yī)大學(xué),2013.

Determination of yak Microvessel Density Anestrus and Pregnancy in ovariand

ZHANG Shou1,CHANG Lan1,LEI Nai-hu1,YAN Zuo-yun2,LI Fu-shou3,REN Qing-jia3,YAN Ting-sheng3
(1.College of Agriculture and Animal Husbandry in Qinghai University,Xining 810016,China; 2.Veterinary Statiox in Dulan lounty,Dulan 810016,China;3.Veterinary Station in TianJun County,Tianjun 817200,China)

Microvascular optical density values on anestrus and pregnancy ovarian of Yak were determined and compared to provide basic data for further protection of resources and improve the reproductive capacity of yak.Microvascular optical density values on anestrus and pregnancy ovarian of Yak were analyzed by using immunohistochemical technique and image analysis meth?od.There was a difference in microvascular optical density value on anestrus and pregnant ovarian of yak.The microvessel density in corpus luteum was maximum and then was the ovarian with corpus luteum.anestrus ovarian and no corpus luteum ovarian and ar?ea of except corpus luteum in corpus luteum ovarian were smaller,but there was no significant difference between the three(P> 0.05).The microvessel density in corpus luteum and ovarian with corpus luteum were significantly difference between the value with other groups,respectively(P<0.05).

yak;ovarian;microvessel;optical density value

CHANG Lan

S823.8+5

A

0529-6005(2016)06-0039-02

2015-03-06

國家自然科學(xué)基金(31360590);青海省科技應(yīng)用基礎(chǔ)項目(2014-ZJ-711)

張壽(1964-),男,教授,本科,從事動物醫(yī)學(xué)教學(xué)及科研工作,E-mail:895169158@qq.com

常蘭,E-mail:changlan0123@163.com