徐長(zhǎng)賡,周永輝,楊艷北,郝美琪,陳儉清,李艷華

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱150030)

阿司匹林對(duì)木糖葡萄球菌體外生物被膜的作用

徐長(zhǎng)賡,周永輝,楊艷北,郝美琪,陳儉清,李艷華

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱150030)

通過(guò)阿司匹林對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜干預(yù)作用的研究,為木糖葡萄球菌生物被膜的治療提供理論參考.通過(guò)結(jié)晶紫染色法(CV)、XTT分析法和激光共聚焦顯微鏡方法研究阿司匹林對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜的作用及生物被膜下活菌和死菌的分布情況.結(jié)果顯示,阿司匹林對(duì)木糖葡萄球菌有抑菌作用并且對(duì)其生物被膜的干預(yù)作用顯著.

阿司匹林;木糖葡萄球菌生物被膜;結(jié)晶紫染色法;激光共聚焦顯微鏡;XTT分析法

奶牛乳房炎不僅是奶業(yè)危害十分嚴(yán)重的疾病之一,而且是導(dǎo)致奶牛淘汰的第三大疾病.近幾年,血漿凝固酶陰性葡萄球菌被認(rèn)為是導(dǎo)致奶牛乳房炎的病原菌,木糖葡萄球菌(Staphylococ?cus xylose)是一種血漿凝固酶陰性葡萄球菌(CNS).此菌廣泛分布于自然界,雖然以往認(rèn)為是非致病菌[1],但是木糖葡萄球菌能夠形成生物被膜(BF)[2],是引起奶牛乳房炎不易治愈和反復(fù)發(fā)作的重要原因之一.

生物被膜是細(xì)菌產(chǎn)生的多聚復(fù)合物基質(zhì)將自身包繞,粘附于無(wú)活性物體或活體表面,形成的有一定結(jié)構(gòu)的細(xì)菌群體;生物被膜內(nèi)細(xì)菌可以抵抗宿主免疫力,同時(shí)對(duì)抗生素產(chǎn)生廣泛的耐藥性,造成感染難以治愈,反復(fù)發(fā)作[3].目前國(guó)外有研究結(jié)果表明,阿司匹林能干預(yù)白色念珠菌生物被膜形成,可以有效抑制生物被膜的生長(zhǎng)和成熟,且具有濃度依賴性[4].但是阿司匹林對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜是否具有干預(yù)作用國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道,故研究擬通過(guò)在體外建立木糖葡萄球菌生物被膜模型,觀察阿司匹林對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜的作用,為其治療木糖葡萄球菌生物被膜相關(guān)感染提供科學(xué)依據(jù).

1　材料與方法

1.1菌株及試劑木糖葡萄球菌ATCC700404,ATCC29971,ATCC35924,購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù);阿司匹林(Sigma公司);甲醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);TSB(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司);XTT試劑盒(凱基生物科技發(fā)展有限公司);Live/dead試劑盒(Molecular Probes);酶標(biāo)儀(美國(guó)Epoch公司);激光共聚焦顯微鏡(萊卡Leica公司).

1.2菌種的復(fù)蘇、傳代將木糖葡萄球菌ATCC700404,ATCC29971,ATCC35924復(fù)蘇后接種到TSB培養(yǎng)基中,放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h.以相同接種方法對(duì)木糖葡萄球菌進(jìn)行傳代純化培養(yǎng)后,即可備用.

1.3藥物的配制精密稱取阿司匹林1.00 g,溶于10 mL甲醇中,配成濃度為100 mg/mL的藥物.作為儲(chǔ)備液.取1 mL儲(chǔ)備液過(guò)0.22 μm的有機(jī)相濾膜,用甲醇溶液稀釋后供測(cè)量MIC使用.

1.4阿司匹林對(duì)木糖葡萄球菌最小抑菌濃度的測(cè)定(MIC)試驗(yàn)操作及結(jié)果按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的標(biāo)準(zhǔn)微量稀釋法進(jìn)行判定[5].

1.5亞抑菌濃度下對(duì)木糖葡萄菌生物被膜的干預(yù)作用向96孔板中加入菌液和各個(gè)濃度藥物共200 μL(藥物終濃度分別為1/2MIC,1/4MIC,1/ 8MIC,1/16MIC).另設(shè)空白對(duì)照孔(只含有培養(yǎng)基)、甲醇對(duì)照孔(加入與藥物等量體積的甲醇)和陰性對(duì)照孔(未加藥物的生物被膜生長(zhǎng)對(duì)照).每個(gè)濃度3組平行.于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.固定,結(jié)晶紫染色,用酶標(biāo)儀在570 nm處,測(cè)定吸光度.

1.6亞抑菌濃度對(duì)木糖葡萄菌生物被膜下細(xì)菌活性的測(cè)定XTT工作液按照試劑盒的說(shuō)明書配制.將培養(yǎng)好的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板取出,棄掉菌液,滅菌PBS沖洗2次,每孔分別加入100 μL新TSB培養(yǎng)基和20 μL XTT工作液,放入37℃恒溫孵箱中培養(yǎng)3 h后用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定每孔在450 nm處的吸光值.試驗(yàn)重復(fù)3次.細(xì)菌存活率計(jì)算

1.7live/dead染色法測(cè)定木糖葡萄菌生物被膜下死菌和活菌的分布情況從6孔板中取出已形成生物被膜的蓋玻片,用滅菌PBS輕輕漂洗,除去BF表面的游離細(xì)菌.在每張玻片BF表面滴加配制好的熒光染液(SYT09/PI),避光孵育15 min,再用滅菌生理鹽水漂洗掉未結(jié)合的熒光探針,再將已形成生物被膜的蓋玻片蓋在滴有組分C的載玻片上,置CLSM觀察.分別采用綠色通道接收綠色信號(hào),紅色通道接收紅色信號(hào)[6].

1.8數(shù)據(jù)分析本試驗(yàn)采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理與分析,數(shù)據(jù)以(-X±SD)表示,采用多重比較和單因素方差分析對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和比較.(P<0.05為差異性顯著,P<0.01為差異性極顯著).

2　結(jié)果

2.1阿司匹林對(duì)木糖葡萄球菌MIC的結(jié)果通過(guò)試驗(yàn)可以得出,阿司匹林對(duì)木糖葡萄球菌ATCC700404的MIC為0.625 mg/mL.阿司匹林對(duì)木糖葡萄球菌ATCC29971的MIC為1.25 mg/mL.阿司匹林對(duì)木糖葡萄球菌ATCC35924的MIC為1.25 mg/ mL.

2.2不同藥物濃度下干預(yù)生物被膜形成能力的檢測(cè)通過(guò)結(jié)晶紫染色,在酶標(biāo)儀570 nm處,測(cè)定各個(gè)藥物濃度的OD值,結(jié)果見(jiàn)圖1.OD值隨著藥物濃度的增大而減小,呈現(xiàn)負(fù)相關(guān).經(jīng)過(guò)SPSS軟件分析,每個(gè)濃度的OD值與陰性對(duì)照存在顯著性差異(P<0.05).甲醇對(duì)照組和菌液對(duì)照組的OD值之間,沒(méi)有顯著性差異(P>0.05),說(shuō)明阿司匹林對(duì)3株木糖葡萄球菌的生物被膜均有干預(yù)作用.

2.3不同藥物濃度下對(duì)生物被膜內(nèi)細(xì)菌活性的分析通過(guò)XTT染色法測(cè)定木糖葡萄球菌生物被膜下細(xì)菌的活性,由圖2可見(jiàn),隨著藥物濃度的減小,A值不斷增大,活菌數(shù)增多,細(xì)菌存活率不斷上升.與結(jié)晶紫染色得到的結(jié)果相吻合,這表明阿司匹林可以抑制生物被膜內(nèi)細(xì)菌.

圖1　阿司匹林對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜的干預(yù)作用

2.4live/dead染色法觀察生物被膜下活菌和死菌分布情況通過(guò)live/dead染色法測(cè)定木糖葡萄菌生物被膜下死菌和活菌的分布情況,結(jié)果見(jiàn)圖3.圖3(a)顯示,在未加藥的情況下,橫截面紅綠通道信號(hào)的疊加圖,其中,紅色熒光代表死菌(死菌被PI著色發(fā)出紅色熒光),綠色熒光代表活菌(活菌被SYTO9著色發(fā)出綠色熒光),部分圖像呈橙色或桔黃色,一般認(rèn)為是死菌和活菌重疊造成.可觀察到細(xì)菌密集,層疊如集云狀,綠色熒光占據(jù)視野,幾乎看不到紅色熒光.圖3(b)顯示,當(dāng)阿司匹林濃度為1/2MIC時(shí),紅綠通道信號(hào)的疊加圖.橫截面圖中明顯可見(jiàn)死菌(紅色熒光).細(xì)菌之間有許多不能被SYTO9/PI著色的黑色區(qū)域,呈管道或泡狀,但認(rèn)為BF結(jié)構(gòu)已經(jīng)形成.

圖2　木糖葡萄球菌生物被膜下的細(xì)菌存活率

圖3　木糖葡萄球菌激光共聚焦圖

3　討論

木糖葡萄球菌是一種血漿凝固酶陰性葡萄球菌,因其感染奶牛乳房后的難治愈性及反復(fù)發(fā)作性,給奶牛養(yǎng)殖戶造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失,其生物被膜的形成是奶牛隱性乳房炎難治愈和反復(fù)發(fā)作的主要原因[7].生物被膜的形成包括初始粘附階段、表面微菌落的形成、分化成熟3個(gè)過(guò)程.生物被膜一旦形成,膜內(nèi)細(xì)菌比浮游細(xì)菌耐藥性增加100～1 000倍以上.生物被膜阻止和抑制巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞、抗體及抗生素侵入生物被膜中殺滅細(xì)菌,導(dǎo)致感染反復(fù)發(fā)生,難以控制[8].抑制細(xì)菌生物被膜產(chǎn)生,同時(shí)抑制細(xì)菌生物被膜的形成亦是現(xiàn)階段新型抗菌藥物研發(fā)的重要方向.

有文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道阿司匹林對(duì)細(xì)菌的生物被膜有干預(yù)作用,并且呈現(xiàn)劑量依賴性[9].但是,目前尚未有阿司匹林對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜干預(yù)的相關(guān)報(bào)道.阿司匹林作為最古老最常用的非甾類抗炎藥物,除解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗凝等作用外,最近研究顯示其還具有抗真菌和抗細(xì)菌等藥理作用[10].由于它克服了抗生素毒副作用較大、易使微生物產(chǎn)生耐藥性的弊端又具有抗菌性、使用安全等優(yōu)點(diǎn),所以在臨床上應(yīng)用日趨廣泛.本試驗(yàn)采用亞MIC濃度的阿司匹林對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜進(jìn)行干預(yù),應(yīng)用結(jié)晶紫染色方法顯示,阿司匹林在亞MIC濃度下對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜有明顯的干預(yù)作用.生物被膜總量隨著藥物濃度的增加不斷減少.但結(jié)晶紫染色法是對(duì)生物被膜總量進(jìn)行測(cè)定,無(wú)法反映生物被膜內(nèi)細(xì)菌的活力情況.所以XTT可以在不破壞生物被膜完整結(jié)構(gòu)的情況下進(jìn)行生物被膜中細(xì)菌活性的研究,結(jié)合激光共聚焦顯微鏡的圖片可以更加直觀的觀察到生物被膜下細(xì)菌的活性分布[11].用藥后,生物被膜下的活菌數(shù)明顯減少.1/2MIC藥物濃度時(shí)效果顯著.所以,通過(guò)XTT分析法和激光共聚焦顯微鏡聯(lián)合觀察生物被膜下細(xì)菌活性也表明阿司匹林在亞MIC濃度對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜有明顯的干預(yù)作用.

生物被膜的形成亦受很多基因的調(diào)控.Yan?nick D等人[12]研究表明,木糖葡萄球菌中存在大量bap基因,并且基于bap基因的廣泛分布,木糖葡萄球菌生物被膜的形成依賴于bap基因的表達(dá).我們?cè)诤罄m(xù)的試驗(yàn)中將探討阿司匹林是否可能通過(guò)抑制bap基因的表達(dá)來(lái)干預(yù)木糖葡萄球菌生物被膜形成.

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Effect of aspirin againstStaphylococcus xylosusbiofilmin vitro

XU Chang-geng,ZHOU Yong-hui,YANG Yan-bei,HAO Mei-qi,CHEN Jian-qing,LI Yan-hua
(College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Aspirin against Staphylococcus xylose biofilm showed that it could be provide a new therapeutic approach for the in?fection caused by biofilm.The effect of aspirin against Staphylococcus xylose biofilm was assessed by the crystal violet staining (CV).The bacteria activity under the mature biofilm was used to measure by XTT and CLSM.The results indicated that aspirin in?hibited the growth of bacterial and had a significant impact on Staphylococcus xylose biofilm(P<0.05).Our data show that,the as?pirin on Staphylococcus xylosus biofilm has a significant intervention effect.

Aspirin;StaphylococcusxyloseBiofilm;crystalvioletstaining(CV);Confocallaserscanningmicroscopy(CLSM); XTT

LI Yan-hua

R 96

A

0529-6005(2016)06-0033-03

2015-07-14

國(guó)家自然科學(xué)基金(GA15B201)

徐長(zhǎng)賡(1992-),男,碩士生,研究方向?yàn)楂F醫(yī)藥理學(xué),E-mail:616167294@qq.com

李艷華,E-mail:liyanhua1970@163.com