皇甫和平,石冬梅,許文博,徐　超,王 軍,王　巖,沈永恕,史靜柯

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,河南鄭州450046;2.河南省出入境檢驗(yàn)檢疫局,河南鄭州450003)

牛傳染性鼻氣管炎病毒gE基因LAMP檢測(cè)方法的建立

皇甫和平1,石冬梅1,許文博1,徐超2,王 軍1,王巖1,沈永恕1,史靜柯1

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,河南鄭州450046;2.河南省出入境檢驗(yàn)檢疫局,河南鄭州450003)

根據(jù)GenBank收錄的BHV-I NM06株的gE基因序列,利用軟件Primer Explorer V4設(shè)計(jì)2對(duì)LAMP引物,建立IBRV gE基因的LAMP檢測(cè)方法;利用重組質(zhì)粒進(jìn)行了敏感性檢測(cè),利用IBRV、牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒、牛輪狀病毒等進(jìn)行特異性試驗(yàn),并對(duì)臨床采集的50份奶牛鼻腔拭子DNA進(jìn)行了檢測(cè).結(jié)果顯示,建立的LAMP方法能對(duì)重組質(zhì)粒DNA產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng),在58℃～65℃8個(gè)溫度進(jìn)行反應(yīng),結(jié)果無(wú)肉眼可見(jiàn)差異,反應(yīng)最短時(shí)間達(dá)90 min時(shí)可見(jiàn)到陽(yáng)性結(jié)果;該方法的檢測(cè)下限是1.68X104拷貝/μL,對(duì)6種其他微生物呈陰性反應(yīng);50份臨床樣品中檢出2份陽(yáng)性.表明本研究初步建立了IBRV gE基因的LAMP快速檢測(cè)方法,可用于IBRV分離株的鑒定以及臨床樣品的快速檢測(cè).

牛傳染性鼻氣管炎病毒;gE基因;LAMP;建立

牛傳染性鼻氣管炎(IBR)是由牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)引起的牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病,以鼻氣管炎、眼結(jié)膜炎、高熱、流產(chǎn)、傳染性膿皰性外陰陰道炎為主要特征.該病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病,我國(guó)多個(gè)省市均有IBR抗體陽(yáng)性的報(bào)道[1].

目前針對(duì)IBRV的感染,診斷方法主要有ELISA、PCR、qPCR等[2].但這些方法操作較為繁瑣,PCR和 qPCR需要較為貴重的儀器,在普通獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室推廣具有一定的局限性.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loopmediated isothermal amplification,LAMP)是一種體外核酸擴(kuò)增技術(shù),由日本學(xué)者Notomi等發(fā)明[3].該方法利用2-3對(duì)引物,特異性的結(jié)合于靶基因的6個(gè)位點(diǎn),具有特異性強(qiáng),敏感性高,尤其是操作簡(jiǎn)單,無(wú)需昂貴的儀器的優(yōu)點(diǎn).本研究初步建立了IBRV gE基因的LAMP檢測(cè)方法,可用于IBRV DNA的體外快速檢測(cè),適合于在普通獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用.

1　材料

1.1菌株和毒株IBRV、牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒、牛輪狀病毒疫苗毒、α溶血性鏈球菌、β溶血性鏈球菌、魏氏梭菌和豬流感病毒均為本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.2主要試劑通用型LAMP恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒和LAMP可見(jiàn)光染料,購(gòu)自北京天恩澤生物技術(shù)有限公司;Taq PCR Master Mix、DNA Marker-D、4S Green核酸染料、EAUP柱式病毒DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒,均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司.

1.3LAMP擴(kuò)增引物根據(jù)GenBank收錄的BHV-1 NM06株的gE基因序列(登錄號(hào):GU591891.1),利用在線軟件Primer Explorer V4(http://primerex?plorer.jp/elamp4.0.0/index.html)設(shè)計(jì)2對(duì)LAMP引物,并通過(guò)BLAST軟件進(jìn)行在線比對(duì)分析驗(yàn)證.4條引物序列見(jiàn)表1.

表1　LAMP引物及部分gE基因片段序列

1.4重組質(zhì)粒的構(gòu)建參考BHV-I NM06株的gE基因序列和LAMP擴(kuò)增區(qū)域,合成該基因的部分片段序列(225 bp),并通過(guò)Sma I位點(diǎn)克隆至pUC57質(zhì)粒中,重組質(zhì)粒命名為pUC57-gE.合成基因的序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,見(jiàn)表1.

1.5LAMP擴(kuò)增體系的建立及優(yōu)化參考通用型LAMP擴(kuò)增試劑盒的操作步驟,以pUC57-gE質(zhì)粒為DNA模板,建立反應(yīng)體系:LAMP Mix(2X)10 μL、FIP引物終濃度0.8 μmol/L、BIP引物終濃度0.8 μmol/L、F3引物終濃度0.2 μmol/L、B3引物終濃度0.2 μmol/L、MgCL2(25 mmol/L)3 μL、模板DNA (1.48X107拷貝/μL)0.5 μL、Bst DNA聚合酶(8 U/ μL)1.5 μL、LAMP可見(jiàn)光染料1 μL、補(bǔ)水到20 μL.

反應(yīng)過(guò)程如下:將各組分混勻,分別在58、59、60、61、62、63、64、65℃保溫,反應(yīng)時(shí)間在30、45、60、75、90、105 min和120 min 7個(gè)時(shí)間段進(jìn)行優(yōu)化,80℃10 min滅活Bst DNA聚合酶.結(jié)果觀察,直接觀察反應(yīng)液顏色變化,如果發(fā)生LAMP擴(kuò)增,顏色由反應(yīng)前的淺紫色變成天藍(lán)色,并顯渾濁;如不加可見(jiàn)光染料,觀察渾濁度的變化.

1.6靈敏度和特異性檢測(cè)將重組質(zhì)粒(1.68X 1010拷貝/μL)做10倍倍比稀釋,以不同稀釋度的質(zhì)粒溶液為模板進(jìn)行LAMP檢測(cè).

以IBRV、牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒、牛輪狀病毒疫苗毒、豬流感病毒、α溶血性鏈球菌、β溶血性鏈球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的基因組DNA或反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板,進(jìn)行LAMP檢測(cè),并設(shè)置無(wú)模板空白對(duì)照.上述病原DNA或cDNA的濃度分別為1.48X107拷貝/μL、3.07X1011拷貝/μL、6.6X 1010拷貝/μL、3.1X1011拷貝/μL、2.18X106拷貝/μL、7.97X107拷貝/μL、2.79X105拷貝/μL.

1.7臨床樣品檢測(cè)參考病毒DNA抽提試劑盒操作步驟,對(duì)2014年在河南省濮陽(yáng)、周口、太康等地采集的50份奶牛鼻腔棉拭子抽提DNA后,進(jìn)行LAMP檢測(cè).

2　結(jié)果

2.1LAMP擴(kuò)增體系的建立及反應(yīng)條件優(yōu)化根據(jù)LAMP擴(kuò)增試劑盒的操作步驟,在不加LAMP可見(jiàn)光染料時(shí),肉眼觀察可見(jiàn)空白對(duì)照呈透明清亮狀,而重組質(zhì)粒擴(kuò)增呈渾濁狀,見(jiàn)圖1.加入可見(jiàn)光染料時(shí),標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒擴(kuò)增后顏色變成天藍(lán)色,并顯渾濁,空白對(duì)照仍呈淺紫色,透明,見(jiàn)圖2.

圖1　未添加可見(jiàn)光染料的LAMP反應(yīng)

圖2　添加可見(jiàn)光染料的LAMP反應(yīng)

通過(guò)對(duì)58℃～65℃8個(gè)溫度下進(jìn)行反應(yīng)的結(jié)果觀察,發(fā)現(xiàn)上述不同溫度對(duì)反應(yīng)結(jié)果無(wú)影響,見(jiàn)圖3;通過(guò)在7個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察,發(fā)現(xiàn)90 min后,陽(yáng)性結(jié)果明顯,見(jiàn)圖4.

圖3　溫度敏感性試驗(yàn)

圖4　時(shí)間敏感性試驗(yàn)

2.2特異性、敏感性試驗(yàn)結(jié)果用建立的LAMP方法檢測(cè)7種病原微生物,結(jié)果顯示,只有IBRV為陽(yáng)性,其余均為陰性,見(jiàn)圖5.該方法對(duì)10份不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板檢測(cè),最低可檢測(cè)到1.68X104拷貝/μL,見(jiàn)圖6.

圖5　特異性試驗(yàn)

圖6　敏感性試驗(yàn)

2.3臨床樣品檢測(cè)結(jié)果用建立的LAMP檢測(cè)方法對(duì)2014年采集的50份奶牛鼻腔棉拭子DNA檢測(cè),結(jié)果有2份為陽(yáng)性.

3　討論

本研究初步建立了IBRV gE基因的LAMP檢測(cè)方法.主要選擇牛的常見(jiàn)病原微生物進(jìn)行特異性試驗(yàn),包括牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒、牛輪狀病病毒、α-溶血性菌、β-溶血性鏈球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌等,該方法特異性強(qiáng),僅對(duì)IBRV有陽(yáng)性反應(yīng),其他為陰性;敏高度較高,檢測(cè)下限為1.68X 104拷貝/μL;反應(yīng)時(shí)間較短,90 min即可.該方法操作簡(jiǎn)單,不需要貴重的儀器,僅需要一臺(tái)恒溫水浴鍋,肉眼即可判斷結(jié)果,可用于IBRV的快速鑒定,尤其適合在獸醫(yī)臨床一線進(jìn)行應(yīng)用.

該方法對(duì)臨床中采集的50份奶牛鼻腔棉拭子DNA進(jìn)行了檢測(cè),有2份陽(yáng)性,對(duì)應(yīng)的牛具有紅鼻子、呼吸道感染等癥狀,與臨床診斷(IBR)一致,同時(shí)也進(jìn)一步在分子水平驗(yàn)證了該病例的診斷.IBRV具有潛伏感染的特性,血清學(xué)陽(yáng)性即代表動(dòng)物感染,以往課題組對(duì)河南省奶牛IBR血清學(xué)檢測(cè)的陽(yáng)性率59.29%[4],說(shuō)明河南省奶牛群中IBRV感染普遍,而此次在50份臨床樣品中僅檢測(cè)出2份陽(yáng)性,陽(yáng)性率為4%,表明當(dāng)前牛群中發(fā)病的或處于散毒期的牛只比例較低.

LAMP檢測(cè)方法在具有高靈敏度的同時(shí),也使得其比普通PCR擴(kuò)增更加容易污染導(dǎo)致假陽(yáng)性,應(yīng)高度重視擴(kuò)增產(chǎn)物的污染,常規(guī)措施包括使用可見(jiàn)光染料,反應(yīng)后不開(kāi)蓋直接進(jìn)行肉眼檢測(cè);嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)分區(qū),反應(yīng)體系配制區(qū)、樣本處理加樣區(qū)、反應(yīng)和結(jié)果分析區(qū);在進(jìn)行電泳檢測(cè)時(shí),可選擇其他距離較遠(yuǎn)實(shí)驗(yàn)室;如果實(shí)驗(yàn)室一旦遭到污染,所有相關(guān)試劑必需全部更換,必要時(shí)更換實(shí)驗(yàn)室[5].

IBRV具有持續(xù)感染和潛伏感染的特點(diǎn),這給該病的根除計(jì)劃造成很大難度.基因缺失疫苗免疫是控制該病的有效措施,但想根除該病,需要有相應(yīng)的區(qū)分強(qiáng)弱毒的診斷方法.本研究針對(duì)IBRV的gE基因建立了LAMP快速檢測(cè)技術(shù),為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)針對(duì)gE基因缺失的IBRV疫苗鑒別診斷方法奠定了基礎(chǔ).

[1]鄒世穎,何倩妮,劉蕾,等.中國(guó)北方六省市牛傳染性鼻氣管炎病流行病學(xué)分析[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2012,48(2):47-48.

[2]徐曉琴,冷雪,李真光,等.牛傳染性鼻氣管炎診斷方法研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2010,31(1):81-86.

[3]Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,et al.Loop-mediated iso?thermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res,2000,28 (12):63-68.

[4]石冬梅,王巖,張華,等.河南省奶牛傳染性鼻氣管炎血清學(xué)調(diào)查[J].畜牧與獸醫(yī),2011,43(6):67-68

[5]周廣舟,徐蘇麗,譚曉榮,等.LAMP技術(shù)在動(dòng)物病毒病原檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2013,29(2): 179-182.

Development of a LAMP assay for detecting gE geneof Infectious BovineRhinotracheitis virus

HUANG FU He-ping1,SHI Dong-mei1,XU Wen-bo1,XU Chao2,WANG Jun1,WANG Yan1,SHEN Yong-shu1,SHI Jing-ke1
(1.Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou 450046,China; 2.Henan Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau,Zhengzhou 450003,China)

Two pairs of LAMP primers were designed using the software Primer Explorer V4 to establish the detection method for IBRV based on,the gE gene sequence of NM06 IBRV strain.The detection limit was measured using the recombinant plasmid DNA.Seven microorganisms,including IBRV,Bovine virus diarrhea mucosal disease virus,Bovine rotavirus vaccine,etc.,were used to assess the specificity of the assay.In addition,the method was evaluated with 50 clinical samples collected from dairy cat?tle.The results showed that,the established method turned a positive response to the recombinant plasmid DNA,and showed no visible differences from 58℃～65℃,with the shortest response time of 90 min and the low detection limit of 1.68X104copies/μL,and there were no positive reaction to 6 other microorganisms,and 2 positive reaction in 50 clinical samples.In conclusion,we es?tablished a rapid LAMP method for the detection of gE gene,which can be used for the identification of IBRV isolates and rapid detection of clinical samples.

Infectious Bovine Rhinotracheitis virus;gE gene;LAMP;Development

SHI Dong-mei

S852.65

A

0529-6005(2016)06-0014-03

2015-07-31

河南省重大科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(132102110053);河南省教育廳科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(13B230335、14B230006)

皇甫和平(1977-),男,講師,博士,主要從事動(dòng)物疾病發(fā)病機(jī)理研究,E-mail:hepinghf@163.com

石冬梅,E-mail:dongmeishi126@126.com