張韞佼 姜兆磊 司逸 馬南 梅舉

基礎研究

PCBP2在壓力負荷誘導的小鼠心肌肥厚發(fā)生中的作用

張韞佼 姜兆磊 司逸 馬南 梅舉

目的 探討PCBP2在壓力負荷誘導的小鼠心肌肥厚發(fā)生過程中的作用。方法 選取8～10周齡的雄性C57BL/6小鼠20只，體重23～28 g，隨機分為2組，每組各10只，分別施以主動脈縮窄術（TAC組）和假手術（Sham組）。術后4周應用超聲心動圖評價小鼠的心臟功能，應用心臟重量與體重之比（HW/BW）定量評價心肌肥厚程度。Real-time PCR檢測心肌肥厚標志物Nppa、β-MHC（Myh7）的mRNA水平，同時檢測PCBP2 mRNA水平。Western blot方法檢測Nppa、β-MHC及PCBP2的蛋白水平。比較分析兩組之間的差異。結果 與Sham組相比，TAC組小鼠的心肌肥厚程度明顯增加［TAC組（8.23±1.88）mg/g比Sham組（4.89±0.68）mg/g］，左心室射血分數(shù)［TAC 組（41.38±2.22）%比 Sham 組（59.15±3.58）%］及短軸收縮率［TAC 組（33.61±0.92）%比 Sham 組（43.87±1.37）%］明顯降低（P＜0.05）。TAC 組的心肌肥厚標志物 Nppa、β-MHC 的mRNA水平及蛋白水平均明顯高于Sham組（P＜0.05）。然而，TAC組PCBP2 mRNA水平及蛋白水平卻明顯低于Sham組（P＜0.05），與心肌標志物Nppa、β-MHC的變化趨勢相反。結論 PCBP2在壓力負荷誘導的小鼠心肌肥厚發(fā)生過程中起著負性調(diào)節(jié)作用，上調(diào)PCBP2表達可能會抑制心肌肥厚的發(fā)展。

PCBP2； 心肌肥厚； Nppa； β-MHC

肥厚型心肌病被認為是一種心血管遺傳疾病，跟基因突變密切相關[1-3]。在一般人群中，肥厚型心肌病的發(fā)病約1/500。研究已證實，在胎兒心臟發(fā)育過程中，一組主要以編碼心肌肌節(jié)蛋白基因發(fā)生突變是導致心肌肥厚的重要遺傳基礎。PCBP2是多聚胞嘧啶結合蛋白家族成員之一，能特異性結合富含胞嘧啶RNA片段，在基因表達的轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控中發(fā)揮重要的作用[4,5]。有研究發(fā)現(xiàn)，PCBP2在心肌組織中有表達，表明PCBP2可能在心臟發(fā)育過程中也起著一定的調(diào)控作用[6]。那么，PCBP2在心肌肥厚過程中起著怎樣的作用，目前尚不清楚。本研究擬通過應用主動脈縮窄術建立壓力負荷誘導的小鼠心肌肥厚模型，觀察PCBP2與心肌肥厚標志物心房鈉尿肽前體A（natriuretic peptide precursor-A，Nppa）及 β 肌球蛋白重鏈（β-Mysion Heavy Chain，β-MHC，由基因 Myh7編碼）的表達情況，探討PCBP2在壓力負荷誘導的小鼠心肌肥厚發(fā)生中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性C57BL/6小鼠20只，體重23～28 g，8～10周齡，隨機分為2組，每組各10只。主要儀器與試劑：小動物呼吸機（上海軟龍科技發(fā)展有限公司BW-BM1103），顯微外科手術器械（上海醫(yī)療器械有限公司手術器械廠），手術顯微鏡（上海光學儀器廠），超凈工作臺（蘇州 SW-CJ.IFD），Real-time PCR儀（美國Bio-Rad），蛋白電泳儀（美國Bio-Rad），Western blot成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad），戊巴比妥鈉，異氟烷，蛋白定量試劑盒，定量PCR試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 構建小鼠心肌肥厚模型 TAC組：將小鼠麻醉，氣管插管后，平臥，固定在手術操作板上，消毒、鋪巾。經(jīng)左胸第2肋間進胸，用濕棉簽撥開左肺組織，用鑷子分離主動脈弓降支，將7-0手術縫線穿過分離出的間隙。在主動脈弓降支上方，平行插入一段26G的注射器針頭，用穿過的7-0手術縫線將主動脈血管及針頭一并結扎。最后拔出針頭，關胸，即得到小鼠主動脈縮窄模型，用于構建壓力負荷誘導的小鼠心肌肥厚模型。Sham組：分離主動脈弓降支后，穿線但不結扎；最后抽出縫線，關胸。

1.2.2 測定小鼠的心臟功能及心肌肥厚情況 用異氟烷將小鼠麻醉后，取仰臥位，剃去左前胸部的毛，涂抹耦合劑。應用超聲心動圖準確測量小鼠的左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）及左室短軸收縮率（fractional shortening，F(xiàn)S）。心肌肥厚定量：處死小鼠，測量小鼠的心臟重量及體重，應用心臟重量與體重之比（HW/BW）定量評價其心肌肥厚程度。

1.2.3 Real-time PCR檢測 使用Premier 5.0軟件進行引物設計，序列見表1。取小鼠心肌組織50 mg，按TrIzol Reagent（Invitrogen）說明書的步驟，抽提心肌組織RNA（100 ng），使用one-step RT-PCR kit（Qiagen）RT-PCR進行逆轉(zhuǎn)錄，然后通過Real-time PCR 分別檢測心肌組織中 Nppa、β-MHC（Myh7）及PCBP2 mRNA水平。

1.2.4 Western blot檢測 Western blot檢測小鼠心肌組織中 Nppa、β-MHC（Myh7）及 PCBP2 蛋白水平：將100 mg小鼠心肌組織勻漿后，BCA法檢測蛋白濃度，加樣，電泳，免疫印跡，定量分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 運用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析。計量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組之間比較采用t檢驗。P＜0.05表明差異有統(tǒng)計學意義。

表1 Real-time PCR引物序列

2 結果

2.1 心肌肥厚情況及心臟功能測定結果 心臟超聲評估小鼠的心臟功能，結果顯示，與Sham組相比，TAC組術后4周小鼠的HW/BW明顯增加（P＜0.05），而 LVEF、FS 則明顯下降（P＜0.05，見表 2），表明壓力負荷誘導的小鼠心肌肥厚模型構建成功。

表2 兩組心肌肥厚情況及心臟功能測定結果（±s）

表2 兩組心肌肥厚情況及心臟功能測定結果（±s）

注：HW/BW：心臟重量與體重之比；LVEF：左室射血分數(shù)；FS：左室短軸收縮率。與Sham組相比，aP＜0.05

組別 HW/BW（mg/g） LVEF（%） FS（%）Sham 組 4.89±0.68 59.15±3.58 43.87±1.37 TAC 組 8.23±1.88a41.38±2.22a33.61±0.92a

2.2 Real-time PCR檢測結果 與Sham組相比，TAC組的Nppa、Myh7 mRNA水平明顯升高。然而，TAC組PCBP2 mRNA水平則明顯低于Sham組，與Nppa、Myh7 mRNA水平的變化趨勢相反，表明PCBP2在壓力負荷誘導的小鼠心肌肥厚發(fā)生過程中起著負性調(diào)節(jié)作用。見圖1。

圖1 Nppa、Myh7、PCBP2 mRNA相對表達情況

2.3 Western blot檢測結果 與Sham組相比，TAC組的Nppa、Myh7蛋白表達明顯增加。然而，TAC組PCBP2蛋白水平則低于Sham組，與Nppa、Myh7蛋白表達的變化亦呈相反趨勢，也表明PCBP2在壓力負荷誘導的小鼠心肌肥厚發(fā)生過程中起著負性調(diào)節(jié)作用。見圖2。

圖2 Myh7、Nppa、PCBP2 蛋白表達情況

3 討論

肥厚型心肌病早期患者可以沒有任何癥狀和不適，但是到了晚期可能會出現(xiàn)惡性心律失常、心衰甚至猝死，是導致年輕人猝死的首要原因[7]。然而，目前臨床上仍缺乏治療肥厚型心肌病的有效方法。因此，進一步深入研究肥厚型心肌病的發(fā)病機制、優(yōu)化其治療方案，對改善肥厚型心肌病的療效及預后具有十分重要的意義。心臟負荷的增加被認為是引起心肌肥厚的主要原因。心肌細胞由于受到負荷的刺激，細胞核內(nèi)DNA含量增加，RNA/DNA比值增大，蛋白質(zhì)合成增加、線粒體體積變大。而由于哺乳動物心肌細胞已喪失有絲分裂能力，所以細胞數(shù)量不增，但每個細胞中的肌節(jié)數(shù)目增加，從而導致細胞變粗、變長，進而發(fā)生心肌肥厚。心肌肥厚是心臟力學改變引起的一系列生理生化的適應性反應，高血壓、心肌缺血以及神經(jīng)體液的激活，都可導致病理性的心肌肥厚。在心肌肥厚過程中，不僅心肌細胞的體積增大，細胞肌節(jié)數(shù)目也增加[8]。

目前，肥厚型心肌病被認為是遺傳性疾病，與基因突變密切相關[1-3,9,10]。通過基因檢測可以早期確診肥厚型心肌病。心房鈉尿肽前體A（Nppa）及β肌球蛋白重鏈（β-MHC）是常用的心肌肥厚標志物[11,12]。Nppa基因定位于染色體1p36，編碼心房鈉尿肽（ANP）的前體[12]。ANP是由心房肌細胞合成并分泌的肽類激素，主要作用是使血管平滑肌舒張和促進腎臟排鈉、排水。β-MHC是肌球蛋白的重要組成部分，在心臟收縮功能中起著至關重要的作用[11]。Myh7基因是編碼心臟β-MHC的基因，該基因?qū)π募》屎窈托呐K功能有著重大影響，是公認的能引起心肌肥厚的主要致病基因[2,9]。以往的研究已證實，在心肌肥厚發(fā)生中，Nppa及β-MHC表達明顯增加[11-13]。本研究通過應用主動脈縮窄術建立壓力負荷成功構建出小鼠心肌肥厚模型，結果發(fā)現(xiàn)，與Sham組相比，TAC組小鼠的心肌肥厚程度明顯增加，左心室射血分數(shù)及短軸收縮率明顯降低；TAC組的心肌肥厚標志物Nppa、Myh7 mRNA水平及蛋白水平均明顯增加，這與以往的研究結果相一致，從分子水平進一步驗證了心肌肥厚模型構建成功。

PCBP2作為多聚胞嘧啶結合蛋白家族成員之一，可以特異性地與單鏈polyC富含區(qū)結合，可參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、蛋白相互作用等過程，對RNA的復制和翻譯起著重要的調(diào)控作用[4,5]。有圍繞PCBP2的研究報道，主要集中于PCBP2調(diào)控病毒RNA的復制過程及與病毒之間的關系[14,15]。還有研究發(fā)現(xiàn)，PCBP2在腫瘤的調(diào)控中也起著重要作用[16,17]。此外，在心肌發(fā)育過程中，PCBP2也表達于心肌組織中，表明PCBP2可能在心臟發(fā)育過程中起著一定的調(diào)控作用[6]。但PCBP2在心肌肥厚過程中究竟起著促進作用還是抑制作用，目前仍不清楚。在本研究中，我們在壓力負荷誘導的小鼠心肌肥厚模型中，應用Real-time PCR及Western blot檢測小鼠心肌中PCBP2的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)TAC組小鼠PCBP2 mRNA水平及蛋白水平明顯低于Sham組，與心肌標志物Nppa、Myh7的變化趨勢相反。因此我們推測，PCBP2在壓力負荷誘導的小鼠心肌肥厚發(fā)生過程中起著負性調(diào)節(jié)作用，上調(diào)PCBP2表達可能會抑制心肌肥厚的發(fā)展。

綜上所述，主動脈縮窄術建立的壓力負荷可成功誘導構建出小鼠心肌肥厚模型，PCBP2在壓力負荷誘導的小鼠心肌肥厚發(fā)生過程中起著負性調(diào)節(jié)作用，其可能成為心肌肥厚治療的新靶點，上調(diào)PCBP2的表達可能是治療心肌肥厚的新策略。

［1］ Maron BJ， Maron MS.Hypertrophic cardiomyopathy.Lancet，2013，381：242-255.

［2］楊忠偉，徐艷萍，馮秀麗，等.用變性高效液相色譜檢測和脫氧核糖核酸測序方法對三個肥厚型心肌病家系β肌球蛋白重鏈基因突變的分析結果.中國循環(huán)雜志，2011，26：442-445.

［3］孔德華，王愛玲，陳多學，等.家族性肥厚型心肌病患者MYBPC3基因突變篩查.臨床心血管病雜志，2010，26：93-96.

［4］Makeyev AV，Liebhaber SA.The poly（C）-binding proteins：a multiplicity of functions and a search for mechanisms.Rna，2002，8：265-278.

［5］Han W，Xin Z，Zhao Z，et al.RNA-binding protein PCBP2 modulates glioma growth by regulating FHL3.J Clin Invest，2013，123：2103-2118.

［6］Chan SY，Chan AK，Cheung BP，et al.Identification of genes expressed during myocardial development.Chin Med J（Engl），2003，116：1329-1332.

［7］Hershberger RE，Hedges DJ，Morales A.Dilated cardiomyopathy：the complexity of a diverse genetic architecture.Nat Rev Cardiol，2013，10：531-547.

［8］Dorn GW 2nd.Physiologic growth and pathologic genes in cardiac developmentand cardiomyopathy.Trends Cardiovasc Med，2005，15：185-189.

［9］Gómez J，Reguero JR，Morís C，et al.Mutation analysis of the main hypertrophic cardiomyopathy genes using multiplex amplification and semiconductor next-generation sequencing.Circ J，2014，78：2963-2971.

［10］潘齊川，徐潮，馮建忠，等.一個家族性肥厚型心肌病大家系致病基因的定位研究.中國醫(yī)藥，2013，8：1527-1530.

［11］Van Driest SL，Jaeger MA，Ommen SR，et al.Comprehensive analysis of the beta-myosin heavy chain gene in 389 unrelated patients with hypertrophic cardiomyopathy.J Am Coll Cardiol，2004，44：602-610.

［12］Deschepper CF，Masciotra S，Zahabi A ，et al.Functional alterations of the Nppa promoter are linked to cardiac ventricular hypertrophy in WKY/WKHA rat crosses.Circ Res，2001，88：223-228.

［13］Blair E，Redwood C，de Jesus Oliveira M，et al.Mutations of the light meromyosin domain of the beta-myosin heavy chain rod in hypertrophic cardiomyopathy.Circ Res，2002，90：263-269.

［14］Sean P，Nguyen JH，Semler BL.The linker domain of poly（rC）binding protein 2 is a major determinant in poliovirus capindependent translation.Virology，2008，378：243-253.

［15］Sean P，Nguyen JH，Semler BL.Altered interactions between stem-loop IV within the 5′noncoding region of coxsackievirus RNA and poly （rC） binding protein 2：effects on IRES-mediated translation and viral infectivity.Virology，2009，389：45-58.

［16］Molinaro RJ，Jha BK，Malathi K，et al.Selection and cloning of poly（rC）-binding protein 2 and Raf kinase inhibitor protein RNA activators of 2′，5′-oligoadenylate synthetase from prostate cancer cells.Nucleic Acids Res，2006，34：6684-6695.

［17］Chang JS，Santhanam R，Trotta R，et al.High levels of the BCR/ABL oncoprotein are required for the MAPK-hnRNP-E2 dependent suppression of C/EBPalpha -driven myeloid differentiation.Blood，2007，110：994-1003.

The effect of PCBP2 on the development of cardiac hypertrophy induced by pressure overloading in mice

ZHANG Yun-jiao，JIANG Zhao-lei，SI Yi，et al.Department of Cardiothoracic Surgery，Xinhua Hospital，School of Medicine，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200092，China

Objective The pressure overload cardiac hypertrophy was constructed by transaortic constric－tion（TAC）in mice.To explore the effect of PCPB2 on the development of pressure overload cardiac hypertrophy in mice.Methods 20 male C57BL/6 mice（age 8-10 weeks，weight 23-28 kg）were used to construct the model.The mice were divided into 2 groups：TAC group（TAC surgery） and Sham group（Sham surgery）.Cardiac function was evaluated by echocardiography at postoperative 4 weeks.Also，the degree of cardiac hypertrophy was assessed with the ratio of heart weight/body weight（HW/BW）.Real-time PCR was used to detected the mRNA of PCBP2 and cardiac hypertrophic marker（Nppa，β-MHC）.Western blot was used to examined the protein of PCBP2 and cardiac hypertrophic markers（Nppa，β-MHC）.The differences between the two groups were analyzed.Results Compared with Sham group，cardiac hypertrophy and HW/BW ratio were significantly higher in TAC group［TAC group（8.23±1.88）mg/g vs Sham group（4.89±0.68）mg/g］，but cardiac function was lower in TAC group［LVEF：TAC group（41.38±2.22）%vs Sham group（59.15±3.58）%；LVFS：TAC group（33.61±0.92）%vs Sham group（43.87±1.37）%（P＜0.05）］.The mRNA or proteins of Nppa and β-MHC of TAC group were higher than those of Sham group（P＜0.05）.However，both the mRNA and protein of PCBP2 were significantly lower than those of Sham group（P＜0.05）.Conclusion PCBP2 was a negative factor for the development of pressure overload cardiac hypertrophy in mice.Upregulation of PCBP2 may be able to inhibit the development of cardiac hypertrophy.

PCBP2； Cardiac hypertrophy； Nppa； β-MHC

MEI Ju，E-mail：ju_mei63@126.com

國家臨床重點專科項目（項目編號：）；上海申康醫(yī)院發(fā)展中心新興前沿技術項目（項目編號：SHDC12014107）；上海新華醫(yī)院院級科研課題（項目編號：15YJ13）

200092 上海市，上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院心胸外科

梅舉，E-mail：ju_mei63@126.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．10．021

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2016）10-0944-04

2016-05-07）