楊獻玲，徐多多，高　陽*，李紅月，王海洋

(1．吉林省藥品檢驗所，長春130033;2．長春中醫(yī)藥大學，長春 130117)

?

高效液相色譜法建立黃芪多糖特征圖譜研究

楊獻玲1，徐多多2，高陽2*，李紅月2，王海洋2

(1．吉林省藥品檢驗所，長春130033;2．長春中醫(yī)藥大學，長春 130117)

目的探討高效液相色譜法建立黃芪多糖特征圖譜。方法利用高效液相色譜法對PMP 柱前衍生化的黃芪多糖進行糖組成分析。結果黃芪多糖特定圖譜由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖4種單糖4個共有峰組成。結論高效液相色譜法建立的黃芪多糖特征圖譜，其操作方法簡便，具有良好的重復性及穩(wěn)定性，可有效控制黃芪多糖的內在質量。

黃芪多糖;鼠李糖;單糖;圖譜;高效液相色譜法

黃芪多糖是黃芪發(fā)揮作用的主要成分，由豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根經(jīng)提取、濃縮、純化而成的水溶性雜多糖。黃芪多糖可作為免疫促進劑或調節(jié)劑，同時具有抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、調節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、降血糖、保肝等作用[1-6]。在多糖的化學研究中單糖組成分析是一項重要內容，隨著現(xiàn)代科學儀器及研究手段的發(fā)展,通過 PMP柱前衍生化高效液相色譜法[7-9]進行組成糖分析，為黃芪多糖特定圖譜的建立提供了簡便、高效的方法，該方法具有分離度高，重現(xiàn)性好等優(yōu)勢。該特征圖譜的建立對控制黃芪多糖的質量具有十分重要的意義。

1　材料

1．1藥品黃芪多糖由吉林敖東藥業(yè)集團延吉股份有限公司提供，甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖均購自Sigma公司，純度均 99%以上。

1．2試劑與儀器1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)和三氟乙酸(TFA)均購自國藥集團化學試劑有限公司。乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。Aglient 1200高效液相色譜儀(美國，包括自動進樣器，二元泵，紫外檢測器);梅特勒-托利多儀器有限公司AB204-N分析天平。

2　方法與結果

2．1色譜分離和檢測條件采用Agilent ZORBAX XDB C18(5μ，250 mm×4．6 mm)色譜柱,磷酸鹽緩沖液(pH 6．8 )-乙腈(85∶15)為流動相A，磷酸鹽緩沖液( pH 6．8)-乙腈( 60∶40)為流動相B，梯度洗脫( 0～10 min，流動相A由100% →92%;10～30 min，流動相A由92% →70%；30～40 min，流 動 相 A 為70%；40～50 min，流動相A由70% →100% )，流速0． 9 mL/min，檢測波長250 nm，進樣量10 μL。在上述條件下，樣品中4組分均能達到良好的基線分離，理論板數(shù)按葡萄糖衍生物峰計算應不低于30 000。

2．2參照物溶液的制備取無水葡萄糖對照品5 mg，精密稱定，置螺帽試管中，加水2 mL使溶解，搖勻，加1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液(PMP)1．2 mL，氫氧化鈉溶液1 mL，混勻，密封，于70 ℃水浴加熱30 min，取出，冷卻至室溫，加0．3 mol/L鹽酸溶液調節(jié)pH至中性，混勻，用等體積三氯甲烷萃取3次，取水層，濾過，濾液作為參照物溶液[10-12]。2．3供試品溶液制備取黃芪多糖約10 mg，精密稱定，置螺帽試管中，加三氟乙酸2 mL，使溶解，密封，于100 ℃烘箱中水解8 h，吹干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，吹干，重復3次，加水2 mL使溶解，即得黃芪多糖水解液。將水解液加上述1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液1．2 mL，氫氧化鈉溶液1 mL，混勻，置70 ℃水浴加熱30 min，取出，冷卻至室溫，加0．3 mol/L鹽酸溶液調節(jié)pH至中性，混勻，用等體積三氯甲烷萃取3次，取水層，濾過，濾液作為供試品溶液[10-12]。

2．4方法學考察2．4．1精密度試驗取同一批供試品溶液，連續(xù)進樣6次，考察各色譜峰相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果，各色譜峰相對保留時間 RSD 0．041%～0．063%。表明儀器的精密度良好。

2．4．2穩(wěn)定性試驗取同一批供試品溶液，分別在 0、2、4、8、16、24 h 進樣，考察各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果，各色譜峰相對保留時間的RSD為0．046%～0．054%。表明供試品溶液24 h內穩(wěn)定性良好。

2．4．3重復性試驗取同一批樣品6份，精密稱定，按照2．3項下方法制備供試品溶液，分別進樣，考察各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果，各色譜峰相對保留時間的RSD為0．685%～0．827%。表明該方法的重復性良好。

2．5樣品測定按照2．3項下方法制備10批樣品的供試品溶液，按照2．1項下色譜條件進行檢測，得到10批樣品特征圖譜，通過比較不同樣品色譜峰，確定 4個共有峰，相對保留時間見表1。

表1　10批黃芪多糖特定圖譜共有峰的相對保留時間

2．6圖譜分析、數(shù)據(jù)處理和相似度評價

2．6．1圖譜分析、數(shù)據(jù)處理試驗中將現(xiàn)有已知對照品甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖按照2． 2項下方法制備對照品溶液，分別進樣，通過保留時間確定供試品溶液1號峰為鼠李糖，2號峰為葡萄糖，3號峰為半乳糖，4號峰為阿拉伯糖。通過比對確定在15～20 min之間的色譜峰為PMP溶劑峰。通過10批樣品圖譜分析，上述4個色譜峰為各批樣品所共有，因此確定為共有特征峰。在共有特征峰中，葡萄糖所占比例最大，因此以其為參照峰。

2．6．2相似度評價采用計算機輔助相似度評價系統(tǒng)比較10批樣品HPLC圖譜全譜相似度，10批供試品相似度達到0．9以上。表明10批供試品具有較好的相似度。

3　小結

特征圖譜的相似性是通過色譜的整體性和模糊性來體現(xiàn)的，在不完全清楚樣品的所有成分時，特征圖譜相似性評價可以反映其內在質量的均一性和穩(wěn)定性。但是，在整體圖譜相似性良好的情況下，樣品所含有效成分的含量仍然可能存在較大差異。因此，有必要在特征圖譜評價基礎上盡可能增加有效成分的含量測定，進一步評價藥品質量。

[1]吳梅,譚睿.黃芪多糖研究進展[J].川北醫(yī)學院學報,2013,28(1):17-22.

[2]趙霞.黃芪炮制品中多糖成分含量的比較研究[J].中醫(yī)臨床研究,2014,36(6):45-46.

[3]孔祥峰,胡元亮.黃芪多糖的免疫藥理學研究進展[J].中獸醫(yī)學雜志,2003,20(3):34-36.

[4]曹明明,高彥宇,馬育軒,等.黃芪化學成分及對心肌缺血再灌注損傷保護作用的研究進展[J].中醫(yī)藥信息,2015,32(3):120-123.

[5]楊慶珍,劉德旺,田義新,等.黃芪多糖化學結構與藥理作用研究進展[J].北方園藝,2015(7):168-175.

[6]劉爽.黃芪藥理作用的研究進展[J].北方藥學,2015,12(12):95.

[7]張海珠,史志婷,王瑩,等.柱前衍生化高效液相色譜分析云南松松塔多糖的單糖組成[J].中國實驗方劑學雜志,2015,21(24):30-33.

[8]馮湘沅,成莉鳳,段盛文,等.苧麻水解液中單糖類組分的柱前衍生-高效液相色譜法檢測[J].紡織學報,2015,36(12):16-19.

[9]朱照武,莊洋,向春林,等.單糖柱前PMP衍生HPLC測定方法探討[J].湖北民族學院學報(自然科學版)，2015,33(3):337-341.

[10]張守軍,王榮申,劉兵,等.柱前衍生化HPLC法測定香椿子多糖的單糖組成[J].山東化工,2015,44(17):71-73.

[11]孫聰,韓業(yè)超,吳強.高效液相色譜法測定保元清血顆粒中黃芪甲苷含量方法的建立及評價[J].吉林大學學報(醫(yī)學版),2012,38(4):805-808.

[12]商曉慧,曲晨龍,張健鵬.海膽殼多糖的提取及PMP柱前衍生化高效液相分析[J].時珍國醫(yī)藥,2015,26(4):830-832.

Establishing specific chromatogram of Milkvetch Root polysaccharides by HPLC

YANG Xianling1,XU Duoduo2,GAO Yang2*,LI Hongyue2,WANG Haiyang2

(1.Jilin Institute For Drug Control,Changchun 130033，China;2.Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China)

ObjectiveTo establish specific chromatogram of Milkvetch Root polysaccharides.MethodsThe monosaccharide composition of Milkvetch Root polysaccharides was determined by HPLC after preparing pre-column derivatization as PMP derivant.ResultsThere were 4 peaks from the specific chromatogram which were rhamnose,glucose,galactose and arabinose monosaccharide respectively.ConclusionThe HPLC method establishing specific chromatogram is a simple,rapid,sensitive and convenient,which can be applied to the quality control of Milkvetch Root polysaccharides.

Milkvetch root polysaccharides;rhamnose;monosaccharide;chromatogram;HPLC

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.04.014

中華人民共和國國家科技部“中藥提取物標準研究平臺建設”(2012ZX09304005004)。

楊獻玲(1980-),女,大學本科,主管藥師，主要從事藥品檢驗及質量標準的建立與復核。

高陽,男,副研究員,電子信箱-gaoyang-1979@hotmail.com

R284.3

A

2095-6258(2016)04-0701-03

2016-02-25)