趙愛(ài)娟，李　紅，圖　雅，李　霄*

(1.北京工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，北京 100124；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700)

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·方藥研究·

訶子與草烏不同比例配伍對(duì)3種雙酯型生物堿含量的影響

趙愛(ài)娟1，李紅1，圖雅2*，李霄1*

(1.北京工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，北京 100124；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700)

目的建立草烏中主要毒性成分3種雙酯型生物堿的HPLC含量測(cè)定方法，并測(cè)定其含量，探討訶子-草烏不同比例配伍對(duì)3種雙酯型生物堿含量的影響，闡釋配伍減毒的原理。方法采用HPLC含量測(cè)定方法對(duì)3種雙酯型生物堿進(jìn)行含量測(cè)定,色譜條件為:采用Extend C18柱(4．6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇-0．05%氨水流動(dòng)相梯度洗脫，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm，流速1 mL/min。結(jié)果訶子-草烏不同比例(草烏單煎、0．5∶1、1∶1、2∶1、3．3∶1、5∶1)配伍合煎后，3種雙酯型生物堿含量變化趨勢(shì)略有不同。在水煎液中，3種雙酯型生物堿總含量表現(xiàn)出先升高后降低的拋物線狀趨勢(shì)。在訶子-草烏(2∶1)合煎液中3種雙酯型生物堿總含量最大，在訶子-草烏(5∶1)合煎液中3種雙酯型生物堿總含量最低且低于單煎液。結(jié)論訶子-草烏不同比例配伍對(duì)水煎液中3種雙酯型生物堿的含量具有很大影響，一方面促進(jìn)3種雙酯型生物堿的溶出，另一方面在訶子配伍比例較高時(shí)，又加速了生物堿的水解。

草烏；訶子；配伍；HPLC；雙酯型生物堿

草烏為毛茛科植物北烏頭(AconitumkusnezoffiiReichb．)的干燥塊根[1]。據(jù)《無(wú)誤蒙藥鑒》記載，草烏是蒙藥泵阿的一種，其生品有劇毒[2]。草烏在蒙醫(yī)藥中主要以干燥的母根入藥，性溫，味辛，效輕，有大毒，具有殺“黏”，燥“協(xié)日烏素”，止痛等多種功效，常用于多種疾病及疑難雜癥的治療。其發(fā)揮藥效作用主要成分是烏頭堿，次烏頭堿和新烏頭堿，同時(shí)也是其毒性成分，誤食或用藥不慎則發(fā)生中毒[3]。訶子為使君子科植物訶子(TerminaliachebulaRetz．)或絨毛訶子(TerminaliachebulaRetz．var．tomentellaKurt．)的干燥成熟果實(shí)，所含化學(xué)成分豐富多樣，主要包括鞣質(zhì)類、酚酸類、三萜類、黃酮類、揮發(fā)油等成分[4]，用于治療多種疾病。

在蒙醫(yī)用藥時(shí)草烏多與大量的訶子配伍使用或經(jīng)過(guò)訶子炮制后入藥[5-7]，李瑞等[8]統(tǒng)計(jì)出在《蒙藥方劑》中有草烏的方劑39個(gè)，而其中19個(gè)方劑同訶子配伍，這表明草烏與訶子的配伍能在一定程度上緩解草烏的毒性，且主要與訶子中含有的鞣質(zhì)類成分有關(guān)，但對(duì)于訶子是如何在配伍中降低草烏毒性的目前并不十分明確[9-10]。本研究通過(guò)對(duì)訶子草烏不同配伍比例水煎液中主要毒性成分3種雙酯型生物堿的含量檢測(cè)，從化學(xué)成分分析的角度分析配伍規(guī)律，解釋訶子與草烏配伍減毒的科學(xué)內(nèi)涵，為蒙醫(yī)藥處方中訶子-草烏配伍應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1　儀器與試藥

Agilent 1200分析型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；Millipore MilliQ超純水制備儀(LABCONCO公司)；METTLER AE 240型電子天平(十萬(wàn)分之一，瑞士梅特勒公司)；Rotavapor R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琪BUCHI公司)；電熱套(上海樹(shù)立儀器儀表有限公司)；0．45 μm過(guò)濾膜(美國(guó)Millipore公司)。

新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿(成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)依次為MUST-14100909、MUST-15013008、MUST-14100908，供含量測(cè)定用)，甲醇(色譜純，賽默飛世爾科技有限公司)，氯仿(分析純，北京化工廠)，硅藻土(化學(xué)醇，天津市福晨化學(xué)試劑廠)，去離子水(Millipore MilliQ超純水制備儀制備)；草烏由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院松林教授提供，并鑒定為為毛莨科植物北烏頭(AconitumkusnezoffiiReichb．)的干燥塊根。訶子由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院松林教授提供，并鑒定為使君子科植物訶(TerminaliachebulaRefz．)的干燥成熟果實(shí)。

2　方法與結(jié)果

2．1對(duì)照品溶液制備精密稱取新烏頭堿對(duì)照品1．8 mg置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成濃度為0．360 mg/mL單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，再精密量取新烏頭堿對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL置于10 mL容量瓶中，以甲醇定容，即得新烏頭堿質(zhì)量濃度為0．072 mg/mL對(duì)照品溶液；精密稱取烏頭堿對(duì)照品11．0 mg置于2 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成烏頭堿濃度為5．500 mg/mL單一對(duì)照品溶液；精密稱取次烏頭堿對(duì)照品5．4 mg置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成濃度為1．080 mg/mL單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密量取0．6 mL單一對(duì)照品儲(chǔ)備液于5 mL容量瓶中，加甲醇定容，得濃度為0．129 6 mg/mL的稀釋液，再精密量取稀釋液0．4 mL于5 mL容量瓶中，加甲醇定容，得濃度為0．010 4 mg/mL二級(jí)稀釋液。

2．2供試品的制備2．2．1草烏、訶子單煎液的制備分別精密稱取草烏、訶子粗粉各5g，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加水10倍量，回流提取30 min，紗布過(guò)濾，再將藥渣加水10倍量，回流提取20 min，過(guò)濾，合并濾液，將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至膏狀，加入10 g硅藻土拌勻，晾干，再用氯仿50 mL回流提取2次，20 min/次，合并氯仿提取液，回收氯仿，甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至2 mL容量瓶，甲醇定容，混勻，用0．45 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾，備用。

2．2．2合煎液的制備分別精密稱取訶子粗粉2．5、5、10、16．67、25 g，分別與精密稱取的草烏粗粉5 g混勻，使其質(zhì)量比分別為0．5∶1、1∶1、2∶1、3．3∶1、5∶1，按照2．2．1項(xiàng)所述處理樣品。

2．2．3藥渣提取液的制備取草烏單煎、訶子-草烏合煎2次后，經(jīng)紗布過(guò)濾后的殘留藥渣，迅速用適量純水清洗2次，過(guò)濾，取藥渣，加入硅藻土5 g拌勻，晾干，再用氯仿50 mL回流提取2次，每次20 min，合并氯仿提取液，回收氯仿，甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至1 mL容量瓶，甲醇定容，混勻，用0．45 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾，備用。2．3色譜條件Extend-C18色譜柱(4．6 mm×50 mm，5 μm)；流動(dòng)相:甲醇(B)-0．05%氨水(D)梯度洗脫，0～5 min，40%～45%(B)；5～10 min，45%～55%(B)；10～16 min，55%～56%(B)；16～22 min，56%～65%(B)；22～32 min，65%～71%(B)；32～40 min，71%～80%(B)；40～47 min，80%～83%(B)；47～53 min，83%～92%(B)；53～58 min，92%～95%(B)；58～60 min，95%～100%(B)；流速為 1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2．4線性關(guān)系考察分別精密吸取濃度為0．072、5．500、0．010 368 mg/mL的新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿對(duì)照品溶液，分別注入液相色譜儀，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(μL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:新烏頭堿Y=853．65X+11．41，r=0．999 8；烏頭堿Y=666．06X+3 334．5，r=0．995 5；次烏頭堿Y=1 157．9X+0．529 2，r=0．999 1。結(jié)果表明新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿分別在0．07～1．44 μg，5．50～165．00 μg，0．010～0．083 μg呈良好的線性關(guān)系。

2．5精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取混合對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣5次，按2．3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄峰面積，新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿峰面積的RSD分別為0．9%、1．6%、0．9%，出峰時(shí)間RSD為0．1%、0．1%、0．08%，表明儀器精密度良好。

2．6重復(fù)性試驗(yàn)取同一批藥材粉末約5 g，共5份，精密稱定，照2．2．1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2．3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄峰面積，新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿峰面積的RSD分別為0．7%、1．5%、0．9%，表明實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2．7穩(wěn)定性試驗(yàn)取2．2．1項(xiàng)下供試品溶液，分別于1、2、5、15、24 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿RSD分別為1．2%、1．2%、1．2%，表明溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2．9專屬性試驗(yàn)精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、訶子單煎液、硅藻土回流提取液各20 μL，按按2．3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿的出峰時(shí)間分別是30．3、36．6、42．5 min，與相鄰色譜峰達(dá)到色譜分離，峰形對(duì)稱，且訶子、硅藻土對(duì)3種生物堿峰無(wú)干擾。

2．10樣品測(cè)定取2．2項(xiàng)下供試品溶液，按2．3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果訶子草烏比例為(0∶1、0．5∶1、1∶1、2∶1、3．3∶1、5∶1)時(shí)，新烏頭堿的平均含量29．927、12．489、7．821、0．067、0．000、0．000 μg/g，烏頭堿平均含量846．148、2 389．087、2 800．365、3 092．950、1 419．239、775．000 μg/g，次烏頭堿平均含量23．160、2．309、2．490、3．203、1．219、0．931 μg/g，藥渣中3種生物堿總含量65．647、44．770、43．031、25．429、100．826、104．653 μg/g，沉淀中3種生物堿總含量12．913、30．828、36．536、12．661、9．604、7．242 μg/g。

3　討論

通過(guò)對(duì)草烏與訶子不同比例合煎液中新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿3種雙酯型生物堿含量的檢測(cè)，可以看出訶子與草烏不同比例配伍合煎，可顯著改變水煎液中3種雙酯型生物堿的含量。

在3種雙酯型生物堿中，烏頭堿的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他2種雙酯型生物堿，所以烏頭堿的變化趨勢(shì)也基本代表了3種雙酯型生物堿變化趨勢(shì)。在訶子與草烏不同比例配伍煎煮中，3種雙酯型生物堿含量的變化呈現(xiàn)拋物線形狀，在訶子-草烏比例為(草烏單煎、0．5∶1、1∶1、2∶1)進(jìn)行配伍時(shí)，3種雙酯型生物堿總量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，分析其原因，應(yīng)該是訶子中鞣質(zhì)成分促進(jìn)了生物堿的溶出，同時(shí)在上述比例下，也能降低3種雙酯型生物堿的水解程度；在訶子-草烏比例為(2∶1、3．3∶1、5∶1)配伍時(shí)，3種雙酯型生物堿總量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，原因是隨著訶子比例的增高，鞣質(zhì)的增多，煎液中酸性增強(qiáng)，加速了生物堿的分解。從本研究可以看出，3種雙酯型生物堿溶出變化與草烏與訶子配伍比例有直接關(guān)系，一方面，訶子鞣質(zhì)成分在一定量時(shí)，能夠促進(jìn)生物堿的溶出，也能夠抑制生物堿的水解。另一方面，在訶子配伍比例較大，酸性較強(qiáng)時(shí)，更加快了生物堿的水解，導(dǎo)致水煎液中3種雙酯型生物堿含量降低，與文獻(xiàn)[11-15]鞣質(zhì)抑制生物堿的溶出相悖。

通過(guò)對(duì)煎煮后藥渣及沉淀中3種雙酯型生物堿的檢測(cè)，可以看到藥渣及沉淀中3種雙酯型生物堿含量較低，說(shuō)明3種雙酯型生物堿穩(wěn)定性較差，很容易分解；進(jìn)而也能夠佐證在訶子較高比例配伍時(shí)，溶液中3種雙酯型生物堿含量較低的原因。

草烏在蒙藥應(yīng)用中常用訶子進(jìn)行炮制，炮制的方法是將訶子-草烏(1∶2)共煎，然后將草烏撈出，曬干入藥，從這個(gè)炮制過(guò)程看，上述研究也能給出科學(xué)的解釋，因?yàn)樵谠X子-草烏(1∶2)共煎時(shí)，訶子能夠?qū)⒉糠蛛p酯型生物堿溶出，所以既降低了毒性，又保證了藥效，科學(xué)合理。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:1部[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:236.

[2]占布拉道爾吉.無(wú)誤蒙藥鑒[M].呼和浩特:內(nèi)蒙古人民出版社,1998.

[3]李杰,韓翠玲.含草烏蒙藥的用藥特點(diǎn)及安全性分析[J].中國(guó)民族醫(yī)藥雜志,2015,21(2):38-40.

[4]劉芳,秦紅飛,劉松青.訶子化學(xué)成分與藥理活性研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房,2012,23(7):670-672.

[5]高寶芝,陳濤.草烏在中醫(yī)藥和蒙醫(yī)藥研究的概述[J].北方藥學(xué),2010,7(1):38-41.

[6]楊紅霞,杜玉枝,肖遠(yuǎn)燦,等.訶子制草烏的炮制工藝研究[J].華西藥學(xué)雜志,2011,26(6):572-576.

[7]王聿成,王璞,董玲,等.草烏毒性及“減毒存效”實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué),2014,4(1):41-43.

[8]李瑞,李文軍.蒙醫(yī)、藏醫(yī)談訶子[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,1995,2(6):34-35.

[9]劉帥,李飛,侯躍飛,等.訶子中的鞣質(zhì)成分對(duì)訶子湯制草烏的影響——訶子制草烏炮制原理探討Ⅰ[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(5):158-160.

[10]楊暢,李飛,侯躍飛,等.訶子草烏配伍與訶子制草烏水煎液中生物堿含量的比較——訶子制草烏炮制原理探討Ⅱ[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(4):130-132.

[11]王璞,王嘉倫,王亞旭,等.藏藥處方使用訶子烏頭配伍的概況及減毒機(jī)理分析[J].世界中醫(yī)藥,2015,10(2):301-303.

[12]劉秋雨,林森,劉曉艷,等.鞣酸對(duì)草烏中雙酯型生物堿水解的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2014,29(6):1972-1974.

[13]王亞旭,王嘉倫,王聿成,等.訶子對(duì)草烏毒性生物堿含量影響的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2015,29(2):70-72.

[14]XU Qingxuan,WANG Yong,LIU Chunming,et al.Structure identification of five unknown dilipo-alkaloids extracted from processed tuber of Aconitum Carmiechaeli by electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].Analytical Sciences:the International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry,2003,19(12):1599-1603.

[15]劉帥,劉曉艷,林森,等.訶子制草烏模擬炮制品在人工胃液與腸液中的水解行為研究[J].中國(guó)藥房,2015,26(13):1752-1754.

Terminalia chebula combined with Aconitum kusnezoffii in different proportions compatibility to the content of three kinds of double ester type Aconitum alkaloids

ZHAO Aijuan1,LI Hong1,TU Ya2*,LI Xiao1*

(1.School of Life Science,Beijing University of Technology,Beijing 100124,China;2.China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China)

ObjectiveTo explore the principles of compatibility of attenuated,we have established the method of HPLC for determination three kinds of double ester type Aconitum alkaloids,which were determined in different proportion of Terminalia combined with Aconitum.MethodsThe HPLC method was used to determine content of the three Diester alkaloids by chromatographic conditions:ExtendC18 column (4.6 mm ×250 mm,5 μm) was used,the moving phase was ammonia and methanol-0.05% gradient elution,column temperature was set at 30℃,detection wavelength 235 nm,and the flow rate 1 mL·min-1.ResultsIt is slightly different about the change trend of the content of three kinds of double ester alkaloids after compatibility decoction of Terminalia and Aconitum in different ratios (0.5∶1,1∶1,2∶1 and 3.3∶1,5∶1).The trend of the total content of three kinds of Diester alkaloids was increased firstly and then decreased with the ratio of Myrobalam increasing,which is like a parabola,The total content in the solution was the largest when the ratio was set at 2∶1,and when the ratio was set at 5∶1,the content of three kinds of double ester type alkaloids was least,which was lower than the content of these alkaloids in the Aconitum single decoction.ConclusionAconitum and Terminalia in different proportions compatibility decoction,significantly changed three kinds of diester alkaloids content;on the one hand,it promoted the dissolution of three kinds of diester type alkaloids,on the other hand,it accelerated the hydrolysis of three kinds of alkaloids when the high compatibility proportion of Terminalia was set in Aconitum and Terminalia proportions compatibility decoction.

AconitumkusnezoffiiReichb;TerminaliachebulaRetz;compatibility;HPLC;Diester alkaloid

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.04.013

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目面上項(xiàng)目“基于草烏減毒效應(yīng)的訶子化學(xué)成分及緩和藥性特征的相關(guān)研究”(81274192)。

趙愛(ài)娟(1988-)，女，碩士研究生，主要從事中藥化學(xué)成分與分析。

李霄，博士，副研究員，電話-13520468471，電子信箱-lixiao@bjut.edu.cn

R284.3

A

2095-6258(2016)04-0697-04

2016-01-04)

圖雅，教授，電話-(010)64089685，電子信箱- tuya126@126.com