王　歡，王慶甫，楊黎黎，張　棟，王偉利，丁昊彬

(1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院,北京 100029)

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基于體外細胞模型的建立探討通絡(luò)止痛方對滑膜炎癥反應(yīng)的影響

王歡1，王慶甫2*，楊黎黎1，張棟1，王偉利1，丁昊彬1

(1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院,北京 100029)

目的建立滑膜炎癥反應(yīng)體外細胞模型，研究通絡(luò)止痛方中君藥的主要有效成分桂皮醛和白芍總苷對滑膜成纖維細胞TNF-α、NO的影響，評價其對膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎滑膜炎癥的作用。方法取大鼠滑膜組織用膠原酶法進行分離培養(yǎng)后，以高、中、低濃度的LPS分別經(jīng)12、24、48 h刺激FLS炎癥反應(yīng)，測定最佳反應(yīng)濃度和時間并誘導FLS；將高、低濃度的桂皮醛和白芍總苷分別經(jīng)12、24、48 h干預(yù)后，Griess法測定NO濃度，ELISA法測定TNF-α釋放量。結(jié)果不同濃度的LPS在不同時間對FLS炎癥反應(yīng)均有一定的誘導作用(P<0．05)，但在1 μg/mL作用24 h時炎癥反應(yīng)程度最高；高、低濃度的CA、TGP在不同時間對滑膜炎癥反應(yīng)均有抑制作用，高濃度組均比低濃度組抑制TNF-α、NO釋放作用強，48 h時2種藥物對TNF-α的釋放抑制作用最強，而NO則是24 h時。結(jié)論不同濃度的CA、TGP均可不同程度有效抑制炎性介質(zhì)的釋放，減輕滑膜炎癥反應(yīng)。

通絡(luò)止痛方；滑膜炎癥；桂皮醛；白芍總苷；TNF-α；NO

通絡(luò)止痛方出自北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院王慶甫教授多年臨床經(jīng)驗和實驗研究的總結(jié)，并由其團隊通過組合方內(nèi)中藥主要有效成分與親水高分子材料、促滲劑和保濕劑共同配制而成一種中藥凝膠劑并申請專利(公開號:CN102091158A)，能顯著緩解疼痛、改善關(guān)節(jié)功能，是一種治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(OA)療效確切的中藥復(fù)方凝膠制劑[1-3]。方中桂枝與白芍相伍為君，源自《金匱要略》中黃芪桂枝五物湯方中桂枝白芍相合治療痹癥解肌發(fā)表、調(diào)和營衛(wèi)之意。研究[4-6]發(fā)現(xiàn)，滑膜炎癥反應(yīng)在膝OA病理進程中發(fā)揮著重要的作用，而滑膜成纖維細胞(FLS)正是其病程中的主要效應(yīng)細胞，其內(nèi)受體通過和脂多糖(LPS)結(jié)合激活免疫系統(tǒng),誘發(fā)滑膜炎癥反應(yīng)，從而合成和釋放一系列細胞因子、炎性介質(zhì)等。本研究以O(shè)A滑膜炎癥的主要效應(yīng)細胞FLS為對象，考察通絡(luò)止痛方中君藥的主要有效成分桂皮醛(CA)和白芍總苷(TGP)在不同時間干預(yù)對不同濃度的LPS誘導后對膝OA滑膜炎癥反應(yīng)的影響，建立中藥有效成分對OA滑膜炎癥的細胞學替代模型，為進一步明確OA的發(fā)生發(fā)展機制、探討有效預(yù)防及治療方案提供實驗參數(shù)。

1　材料

1．1主要試劑桂皮醛、白芍總苷(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度>98%)；LPS、Ⅱ型膠原蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma公司)；RPMI1640培養(yǎng)基、杜氏磷酸緩沖液(D-PBS)(美國Corning公司)；胎牛血清、0．25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco公司)；硝酸鉀、無水對氨基苯磺酸、N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽(國產(chǎn)分析純)；TNF-α試劑盒(CUSABIO BIOTECH CO)。

1．2主要儀器恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；25 cm2培養(yǎng)瓶、96 孔細胞培養(yǎng)板(美國Corning 公司)；電子天平(BS124-S，德國賽多利斯公司)；酶聯(lián)免疫檢測儀(ELx800，美國BioTek公司)；LD5-2B型離心機(北京京立離心機有限公司)。

1．3組織來源 選取雄性Wistar 大鼠 20 只，4～6周齡，體質(zhì)量(180±30)g，由北京中醫(yī)藥大學附屬東直門醫(yī)院實驗動物中心提供,清潔級飼養(yǎng)。

2　方法

2．1FLS的體外分離與培養(yǎng)將大鼠麻醉后仰位固定，于膝關(guān)節(jié)處縱行切開表面皮膚，分離肌肉、韌帶后取出滑膜組織，D-PBS漂洗3次，用手術(shù)剪剔除周圍脂肪、軟骨等組織，將修剪后的滑膜組織再次漂洗，剪成糊狀后，加入10倍以上組織體積的Ⅱ型膠原酶，置于5%CO2的37 ℃飽和濕度培養(yǎng)箱中消化培養(yǎng)，期間輕輕振搖幾次,2 h后,用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾消化后的液體,1 500 r/min離心5 min,用先前配制好的培養(yǎng)液(細胞培養(yǎng)液為含10%滅活胎牛血清，青霉素、鏈霉素各100 U/mL的RPM1640培養(yǎng)基)制成細胞懸液收集并接種到培養(yǎng)瓶中，隔天換液，當細胞生長至瓶底面積的80%左右時,以1∶3的傳代比例進行傳代，并取處于對數(shù)生長期的細胞(2-5代)用于實驗。

2．2實驗分組及給藥方法

2．2．1LPS誘導FLS炎癥反應(yīng)最佳時間和濃度的測定取1×105/mL細胞濃度的細胞懸液100 μL/孔接種于96孔板，置于5%CO2的37 ℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日，吸棄各孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入各組受試液100 μL/孔。1)LPS高濃度組:LPS濃度為10 μg/mL；2)LPS中濃度組:LPS濃度為1 μg/mL；3)LPS低濃度組:LPS濃度為100 ng/mL；4)空白對照組:細胞培養(yǎng)液。37 ℃恒溫分別孵育12、24、48 h后，收集孔內(nèi)上清液，測得各組TNF-α與NO含量，選擇含量最高的1組作為下一步研究LPS誘導FLS炎癥反應(yīng)的干預(yù)濃度和時間。

2．2．2不同濃度的CA和TGP在不同時間對FLS炎癥反應(yīng)程度影響的測定取1×105/mL細胞濃度的細胞懸液100 μL/孔接種于96孔板，置于5%CO2的37 ℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日，吸棄各孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入各組上述最佳濃度的LPS 100 μL/孔，在最佳干預(yù)時間培養(yǎng)后，吸棄藥液并加入各組受試液100 μL/孔。1)CA高濃度組:CA濃度為100 ng/mL；2)CA低濃度組:CA濃度為10 ng/mL；3)TGP高濃度組:TGP濃度為10 μg/mL；4)TGP低濃度組:TGP濃度為1 μg/mL；5)空白對照組:細胞培養(yǎng)液。37 ℃恒溫分別再孵育12、24、48 h后，吸取各孔內(nèi)上清于EP管內(nèi)，標號置于4 ℃冰箱中儲存待測。

2．3NO釋放量的測定用雙蒸餾水配制濃度為100 μmol/L的硝酸鉀溶液并2倍稀釋成6個濃度作為梯度標準貯備液。用雙蒸餾水配制1%的對氨基苯磺酸溶液(A液)、0．1%的N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽溶液(B液)。96孔酶標板加入上述待測樣品100 μL/孔、A液B液各50 μL/孔，室溫靜置反應(yīng)30 min后于540 nm處測得各孔反應(yīng)液的吸光值。

2．4TNF-α含量測定TNF-α含量用Rat TNF-αELISA試劑盒進行測定。

3　結(jié)果

3．1膝OA滑膜炎癥反應(yīng)體外細胞模型的建立LPS高、中、低濃度組在12、24、48 h對FLS TNF-α、NO的釋放都有著一定的促進作用，且不同作用時間和LPS濃度作用下二者含量變化趨勢大致相同。整體看來，在24 h作用后，LPS相同濃度組的TNF-α和NO的含量與其他時間點比相對較高；而在相同時間內(nèi)，LPS中濃度組的TNF-α和NO含量最高。其中，空白組也有一定量的TNF-α和NO釋放，這是因為來源為膝OA患者的滑膜組織本身就有一定的炎癥反應(yīng)。但經(jīng)SPSS 17．0 Oneway ANOVA 統(tǒng)計分析后，各LPS濃度組與空白組比較仍存在顯著性差異(P<0．05)。結(jié)果顯示，LPS高、中、低濃度組對FLS分別經(jīng)12、24、48 h誘導后，LPS中濃度組即LPS濃度為1 μg/mL干預(yù)24 h時，TNF-α、NO的含量最高，F(xiàn)LS的炎癥反應(yīng)最強，此即作為誘導炎癥反應(yīng)模型的最佳干預(yù)濃度及時間。結(jié)果見圖1、圖2。

3．2不同濃度的CA、TGP在不同時間對TNF-α、NO釋放量的影響在LPS最佳濃度(1 μg/mL)和最佳時間(24 h)誘導FLS炎癥反應(yīng)后，分別以高、低濃度的CA、TGP干預(yù)12、24、48 h，結(jié)果顯示，CA、TGP的高、低濃度組均對FLS TNF-α、NO的釋放有不同程度的抑制作用,其中,2種藥物的高濃度組均比低濃度組抑制作用強。CA、TGP對TNF-α釋放的抑制在48 h時作用最強；而對NO含量的降低則在24 h最明顯(P<0．05)。CA高、低濃度組在各相同時間點對TNF-α和NO釋放的抑制作用均比TGP強(P<0．05)。結(jié)果見圖3、圖4。

圖1　不同濃度LPS在不同時間點對TNF-α釋放量的影響

圖2　不同濃度LPS在不同時間點對NO釋放量的影響

圖3　不同濃度的CA、TGP在不同時間對TNF-α釋放量的影響

圖4　不同濃度的CA、TGP在不同時間對NO釋放量的影響

4　討論

骨質(zhì)增生和軟骨變性作為膝OA的主要病理變化往往將人們對該疾病的認識過多的引導向關(guān)注其骨性改變的研究[7]，然而，越來越多的研究[8-16]證明，滑膜炎癥才是導致軟骨降解、關(guān)節(jié)退變和加速OA病情進展的重要環(huán)節(jié)。

通絡(luò)止痛方中，桂枝辛、甘、溫，有溫通經(jīng)脈，助陽化氣之功效；白芍苦、酸、微寒，有養(yǎng)血斂陰、柔肝止痛之功效。兩者合用，一辛散一酸收，一祛邪一扶正，一溫陽和絡(luò)一活血和絡(luò)，將《傷寒論》中“調(diào)和”思想體現(xiàn)的淋漓盡致，尤怡《金匱心典》:“外證得之,解肌和營衛(wèi),內(nèi)證得之，化氣和陰陽”?，F(xiàn)代藥理學研究[17-18]證明，桂枝的主要活性成分桂皮醛具有溫陽通絡(luò)、擴張血管的功效；而白芍的主要活性成分白芍總苷具有鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)的作用。到目前為止，對桂皮醛和白芍總苷抗炎作用的研究較少，其抗炎程度與濃度、時間及不同條件LPS干預(yù)的相關(guān)性研究尚未有報道。本研究通過在高、中、低濃度的LPS經(jīng)不同時間誘導FLS選取的最佳濃度和時間的同時，分別以不同劑量的CA和TGP經(jīng)12、24、48 h干預(yù)后，檢測上述指標，結(jié)果顯示，CA和TGP均對滑膜炎癥反應(yīng)有不同程度的抑制作用。兩種藥物的高濃度組均比低濃度組抑制TNF-α、NO釋放作用強。48 h 時2種藥物對TNF-α的釋放量降低最明顯，而NO則在24 h，這可能與過多合成的NO反過來促發(fā)FLS的免疫反應(yīng)有關(guān)。該實驗結(jié)果在建立滑膜炎癥細胞學模型的同時更好的進行了中藥有效成分抗炎作用的評價和篩選，為進一步探求中藥有效成分抑制OA滑膜炎癥的作用機制，探討預(yù)防及治療OA的有效方案提供新的思路。

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Tongluozhitong decoction on synovitis based on establishment of cell model in vitro

WANG Huan1,WANG Qingfu2*,YANG Lili1,ZHANG Dong1,WANG Weili1,DING Haobin1

(1.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;2.The Third Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

ObjectiveTo establish the cell model of synovitis in vitro,as well as to investigate the influence of cinnamic aldehyde(CA) and total glucosides of paeonia(TGP) in Tongluozhitong decoction on the releasement of TNF-α and NO of fibroblast-like synovicyte(FLS),which could evaluate the role that drugs played on the synovitis in knee osteoarthritis(OA).MethodsFLS were removed from the Wistar rats and cultured with collagenases digestion.Then the cells were treated with 3 different concentrations of LPS,12/24/48 h later,the optimum concentration and time were chosen to induce the inflammatory reaction of FLS.High and low concentrations of CA and TGP were given for 12/24/48 h respectively,and the release amount of TNF-α was examined by ELISA assay,and Griess method was used on NO.ResultsAll the different concentrations of LPS could induce the inflammatory reaction of FLS,especially the middle concentration of LPS( 1 μg/mL) at 24 h later.High concentration of CA and TGP could more significantly inhibit the inflammation of FLS(P<0.05).Among the three points in time,the strongest effect on tumornecrosis factor-α( TNF-α) was found in 48h treatment,while nitric oxide( NO) was 24 h.ConclusionDifferent concentrations of CA and TGP could inhibit the synovitis.Reduce the synovitis reaction.

Tongluozhitong decoction;synovitis;Cinnamaldehyde;Radix paeoniae alba total glycosides;TNF-α;NO

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.04.009

國家自然科學基金面上項目(81373662)；北京中醫(yī)藥大學自主選題項目(2015-JYB-XS202)。

王歡(1986-)，女，博士研究生，主要從事中醫(yī)藥臨床研究。

王慶甫，男，教授，電話-(010)52075209，電子信箱-qingpu-wang@sohu.com

R285.5

A

2095-6258(2016)04-0684-04

2015-12-12)