丁海生，徐德全，2，3，羅　琰，劉　敏，2*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070；2.農(nóng)業(yè)部豬遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；3.生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430070)

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杜洛克豬與梅山豬副性腺組織學(xué)比較及精漿蛋白mRNA表達(dá)分析

丁海生1，徐德全1，2，3，羅琰1，劉敏1，2*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070；2.農(nóng)業(yè)部豬遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；3.生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430070)

旨在探討杜洛克公豬和梅山公豬精囊腺和尿道球腺的組織學(xué)特征及精漿蛋白mRNA的表達(dá)，運(yùn)用石蠟切片并通過(guò)HE染色，分別在光學(xué)顯微鏡下對(duì)75日齡、270日齡梅山公豬與270日齡杜洛克公豬的精囊腺和尿道球腺進(jìn)行組織學(xué)觀察；并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)精漿蛋白mRNA的表達(dá)進(jìn)行分析。270日齡梅山公豬與75日齡梅山公豬相比，精囊腺的腺小葉增多，小葉間結(jié)締組織減少；270日齡杜洛克公豬精囊腺較270日齡梅山公豬有更多的腺泡黏膜褶皺和小葉間結(jié)締組織。梅山公豬和杜洛克公豬尿道球腺被結(jié)締組織分隔成小葉，腺泡密集且腺腔?。幻飞截i在成年時(shí)尿道球腺腺小葉增大，小葉間結(jié)締組織變少；270日齡杜洛克公豬尿道球腺腺小葉比270日齡梅山公豬小，而腺泡較大，且結(jié)締組織更多。精漿蛋白PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ在精囊腺中高表達(dá)，在成熟的杜洛克和梅山公豬精囊腺中其mRNA表達(dá)水平相近(P>0.05)。但隨著日齡的增長(zhǎng)，梅山公豬PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。杜洛克公豬更多的精囊腺黏膜褶皺和更大的尿道球腺腺泡，增加了上皮分泌面積，有助于增加精漿體積，提高精子代謝率和存活率。另外，性成熟公豬中精漿蛋白PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ的高表達(dá)可能參與維持精子的代謝和活力等生理過(guò)程。

豬；副性腺；組織學(xué)；PSP-Ⅰ；PSP-Ⅱ

副性腺是雄性生殖系統(tǒng)的重要組成部分，主要包括精囊腺、前列腺和尿道球腺等，其各自分泌的特異性液體是精液的組成部分，對(duì)于精子的運(yùn)送、保護(hù)及存活都有一定意義[1]。精囊腺為一對(duì)蟠曲的囊狀結(jié)構(gòu)，與性功能的調(diào)控有關(guān)[2]。精囊腺分泌物構(gòu)成精漿的大部分，為精子提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量，有助于提高精子活力、刺激子宮蠕動(dòng)、促進(jìn)精子在雌性生殖道內(nèi)運(yùn)動(dòng)[3-5]。如精囊腺上皮細(xì)胞分泌的PSP-Ⅰ(Porcine seminal protein-Ⅰ)和PSP-Ⅱ(Porcine seminal protein-Ⅱ) 的含量約占精漿總蛋白的50%，在精液中主要以非共價(jià)異源二聚體形式存在，是精子粘附家族的重要成員，參與體內(nèi)多種生物學(xué)功能，能夠維持精子膜的完整性、精子能動(dòng)性和精子線粒體的活性等[6-8]。尿道球腺是由具有分泌功能的腺泡構(gòu)成的，其主要功能是分泌尿道球腺液，而尿道球腺液也是精液的組成成分之一，可保護(hù)精子免受陰道不利環(huán)境的影響及防止精液倒流，公豬尿道球腺液中的糖復(fù)合物可能參與精子代謝過(guò)程[9-10]。

梅山豬以性成熟早、繁殖性能高聞名于世，而杜洛克豬在雜交育種中常作為終端父本。梅山公豬初情期為56～84日齡，而杜洛克、大白公豬等外來(lái)豬種的初情期一般為120～180 日齡，且梅山公豬精子發(fā)生時(shí)間較早，但每次射精量、睪丸日產(chǎn)精量等一般低于杜洛克公豬[11-14]，這可能也與副性腺液的產(chǎn)量和組成相關(guān)。因此，本研究對(duì)杜洛克和梅山公豬精囊腺和尿道球腺進(jìn)行石蠟切片制作及蘇木精-伊紅染色法(Haematoxylin-eosin，HE)染色觀察，闡述其結(jié)構(gòu)特征和差異性，并對(duì)精囊腺中高表達(dá)的精漿蛋白PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，研究杜洛克和梅山公豬精囊腺和尿道球腺的組織結(jié)構(gòu)特征及精漿蛋白mRNA的表達(dá)，探索杜洛克公豬和梅山公豬精子產(chǎn)量、精子活力等性狀差異的基礎(chǔ)，為公豬繁殖性狀的評(píng)價(jià)與改良奠定基礎(chǔ)，為中國(guó)地方豬種優(yōu)異種質(zhì)資源的進(jìn)一步開發(fā)與利用提供新思路。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

由于梅山公豬初情期僅為56～84日齡，早于杜洛克公豬(初情期為120～180日齡)，因此在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)精品豬場(chǎng)分別選用健康的已達(dá)初情期的75日齡梅山公豬(體重分別為18、21、和23 kg)、已性成熟的270日齡的梅山公豬(115、119和125 kg)和杜洛克公豬(體重分別為184、192和196 kg)各3頭實(shí)施手術(shù)，采集精囊腺和尿道球腺組織后，生理鹽水漂洗、剔除結(jié)締和脂肪組織，切成0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm小塊，一部分用于組織切片制作和HE染色觀察，另一部分經(jīng)液氮速凍置-80 ℃保存，用于RNA提取。

1.2石蠟切片制作及HE染色觀察

用0.01 mol·L-1PBS (pH7.4) 洗滌多聚甲醛緩沖液(4.0%)固定的組織塊3次，然后用梯度酒精脫水、二甲苯或水楊酸甲酯透明處理及60 ℃浸蠟后進(jìn)行包埋，采用萊卡切片機(jī)(RM2235，Leica)切片，制作5 μm厚的石蠟切片。將已經(jīng)切好的組織放入40 ℃溫水中展開，選擇完整、無(wú)皺褶的組織黏貼于干凈的載玻片上，作好標(biāo)記，然后置于漂烘儀(TEC-2500，常州)上40 ℃烘片1 h左右，待水分烘干后置于60 ℃烘箱過(guò)夜，次日用二甲苯脫蠟；再用梯度酒精置換二甲苯；蒸餾水洗去酒精后用蘇木素染液染色8 min；1.0%鹽酸酒精分化1 min，然后蒸餾水洗2 s；梯度酒精脫水各2 min；伊紅染液染色2 min；再用梯度酒精脫水各2 min；二甲苯透明后滴加適量中性樹膠封片，用Olympus-BX51顯微鏡觀察拍照[15-16]。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用SYBR Green I染料法，反應(yīng)在Bio-Bio Rad CFX384TMReal-Time PCR Systems上進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,40個(gè)循環(huán)；4 ℃保存。qRT-PCR的反應(yīng)體系為10 μL：CWBIO 2×Es Taq Master Mix 5 μL，上下游引物(72.5 μmol·L-1)各0.15 μL，cDNA模板為0.5 μL，加滅菌去離子水至10 μL。基因引物設(shè)計(jì)采用Primer premier 5.0，各引物序列見表1，退火溫度為60 ℃。

表1實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

Table 1Primers for real-time PCR

目的基因Targetgenes引物序列(5'-3')Primersequence產(chǎn)物大小/bpProductslengthPSP-ⅠF:GGAGCCCCAGGATCTAAGAG,R:GTGGAAGATCACGCTCATCA211PSP-ⅡF:AATCTGTGCACCTGGACCAT,R:AAAAGACAATCGCTGCACCT163β-actinF:CCAGGTCATCACCATCGG,R:CCGTGTTGGCGTAGAGGT158

1.4數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行整理，利用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，P>0.05表示差異不顯著；P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。n=3。結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。運(yùn)用作圖軟件GraphPad Prism進(jìn)行圖的繪制。所有組織的PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ mRNA表達(dá)量均是以β-actin為內(nèi)參基因。

2　結(jié)　果

2.1杜洛克與梅山公豬精囊腺組織學(xué)形態(tài)觀察

75日齡、270日齡梅山公豬以及270日齡杜洛克公豬的精囊腺組織結(jié)構(gòu)結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示杜洛克和梅山公豬精囊腺為分葉腺，包含有多個(gè)大的腺小葉，小葉間以疏松的結(jié)締組織相連接，腺黏膜伸出一系列皺褶，黏膜皺褶突入腔內(nèi)，使黏膜呈蜂窩狀，黏膜泡內(nèi)可見大量的精囊腺分泌物。品種內(nèi)相比，梅山公豬從75～270日齡腺小葉增多，且更加密集緊致，小葉間結(jié)締組織減少。品種間相比，270日齡梅山公豬與杜洛克公豬腺小葉數(shù)目類似，但其腺泡黏膜褶皺少于270日齡杜洛克公豬，且其小葉間結(jié)締組織隔膜比270日齡杜洛克公豬稀疏。

2.2杜洛克與梅山公豬尿道球腺組織學(xué)形態(tài)觀察

75日齡、270日齡梅山公豬以及270日齡杜洛克公豬的尿道球腺組織結(jié)構(gòu)結(jié)果見圖2，結(jié)果顯示梅山公豬和杜洛克公豬尿道球腺被纖維結(jié)締組織分隔成小葉。尿道球腺腺泡密集成小圓形，且腺腔小。品種內(nèi)相比，270日齡梅山公豬比75日齡的腺泡更加密集緊實(shí)，腺小葉更大，小葉間結(jié)締組織稀少。而品種間相比，270日齡杜洛克公豬有更大的腺泡，且小葉間結(jié)締組織更多，但其腺小葉卻小于270日齡梅山公豬。

2.3豬PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ mRNA表達(dá)量的檢測(cè)

由圖3可以看出，PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ在75日齡梅山公豬、270日齡的杜洛克和270日齡梅山公豬精囊腺中表達(dá)量均極顯著高于尿道球腺(P<0.01)。品種內(nèi)，270日齡的梅山公豬精囊腺和尿道球腺中PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ mRNA表達(dá)量均顯著高于75日齡梅山公豬(P<0.05)；品種間，270日齡梅山公豬和杜洛克公豬精囊腺和尿道球腺PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ mRNA表達(dá)量均相近(P>0.5),但其蛋白水平是否存在差異需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

3　討　論

副性腺分泌物是精漿的重要組成成分，其主要功能是作為精子的運(yùn)載介質(zhì)，幫助精子運(yùn)動(dòng)，防止自然交配時(shí)，精液倒流。豬精囊腺和尿道球腺都特別發(fā)達(dá)，且精漿大部分成分來(lái)自精囊腺和尿道球腺，這可能是公豬射精量遠(yuǎn)高于其他家畜的原因之一[17-18]。研究75、270日齡梅山公豬和270日齡杜洛克公豬的精囊腺和尿道球腺為公豬生精能力的差異奠定基礎(chǔ)。公豬精囊腺是呈分葉狀的腺體，位于輸精管壺腹外側(cè)。圖1顯示270日齡的梅山公豬精囊腺比75日齡的梅山公豬有更加密集的腺小葉和更深更多的黏膜褶皺。由于精囊腺分泌物中碳酸氫鹽能夠增強(qiáng)精子活力[19]，性成熟梅山公豬較多的黏膜褶皺能夠分泌較多的精囊腺分泌物，因此這可能也是性成熟的梅山公豬精子活力高于初情期的梅山公豬的原因之一[11]。另外，270日齡杜洛克公豬與270日齡的梅山公豬相比，其精囊腺腺泡上皮的黏膜褶皺更多，黏膜褶皺擴(kuò)大了分泌面積并有利于分泌物的貯存和腺體的擴(kuò)張。因此性成熟的杜洛克公豬可比梅山公豬分泌更多的精囊腺分泌物以及具有更強(qiáng)的排出分泌物的能力。更多的精囊腺分泌物增加精液中精漿的量以及對(duì)精子的營(yíng)養(yǎng)和能源供給，且精囊腺分泌物能夠提高精子核染色質(zhì)的穩(wěn)定性和抑制雌性生殖道對(duì)精子的免疫反應(yīng)[19-21]，這也可能是兩品種在日產(chǎn)精量、精子活力等繁殖性狀方面存在差異的原因之一。

A.75日齡梅山公豬精囊腺；B.270日齡梅山公豬精囊腺；C.270日齡杜洛克公豬精囊腺。GL.腺小葉；Ac.腺泡；S.分泌物；ICT.小葉間結(jié)締組織A.Vesicular gland of 75-day-old Meishan boar；B.Vesicular gland of 270-day-old Meishan boar；C.Vesicular gland of 270-day-old Duroc boar.GL.Glandular lobule；Ac.Acinus；S.Secreta；ICT.Interlobular connective tissue圖1　不同日齡杜洛克與梅山公豬精囊腺組織學(xué)觀察(蘇木精-伊紅染色，100×)Fig.1　The histological observation of vesicular gland from Duroc and Meishan boars at different age(Haematoxylin-eosin staining，100×)

A.75日齡梅山豬尿道球腺；B.270日齡梅山豬尿道球腺；C.270日齡杜洛克豬尿道球腺。Ac.腺泡；ICT.小葉間結(jié)締組織；GL.腺小葉A.Bulbourethral gland of 75-day-old Meishan boar；B.Bulbourethral gland of 270-day-old Meishan boar；C.Bulbourethral gland of 270-day-old Duroc boar.Ac.Acinus；ICT.Interlobular connective tissue；GL.Glandular lobule圖2　不同日齡杜洛克與梅山公豬尿道球腺組織學(xué)觀察(蘇木精-伊紅染色，100×) Fig.2　The histological observation of bulbourethral gland from Duroc and Meishan boars at different age (Haematoxylin-eosin staining，100×)

A.PSP-Ⅰ；B.PSP-Ⅱ，不同小、大寫字母分別表示同一組織不同時(shí)期差異顯著和極顯著(P<0.05；P<0.01)，n=3。**表示同一時(shí)期不同組織差異極顯著(P<0.01)A.PSP-Ⅰ；B.PSP-Ⅱ，the different upper and lower case letters indicate significant difference (P<0.05) or highly significant difference (P<0.01) between different periods in the same tissue.** indicate highly significant difference between different tissues in the same period (P<0.01)圖3　PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ在精囊腺和尿道球腺中的表達(dá)Fig.3　Expression level of PSP-Ⅰ and PSP-Ⅱ in seminal vesicle and bulbourethral gland

公豬的尿道球腺為復(fù)合型管泡狀腺體，周圍被致密的結(jié)締組織包圍，在上皮細(xì)胞中分布有大量的分泌顆粒，分泌顆粒中含有大量的中性和羧酸化粘多糖以及少量的硫酸化粘多糖，其分泌物在射精之前釋放，具有清除尿道和潤(rùn)滑陰道的作用，而糖復(fù)合物在精子的代謝過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[10，22-23]。本研究顯示270日齡杜洛克公豬的尿道球腺腺泡較同日齡梅山公豬的大，而梅山公豬隨著性成熟腺小葉增大，腺泡明顯增多，大而多的腺泡含有更多的上皮細(xì)胞，故而有更多的分泌顆粒存在，有利于精子的代謝和存活，這也為兩品種在有關(guān)性狀方面的差異提供了基礎(chǔ)。

公豬精漿中80%～90%的蛋白是由精囊腺上皮細(xì)胞分泌的，而這些蛋白在雌性生殖管道中對(duì)精子起保護(hù)作用[17]。而PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ蛋白占豬精囊腺蛋白的50%以上，主要是由精囊腺上皮分泌，且能夠提高成熟精子的生存力和能動(dòng)性[7，24-25]。本研究中PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ的 mRNA在精囊腺中的高表達(dá)更進(jìn)一步支持了該異質(zhì)體的主要來(lái)源。而PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ在270日齡比75日齡表達(dá)量更高，說(shuō)明公豬性成熟階段精囊腺上皮及尿道球腺分泌PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ的能力顯著增強(qiáng)，從而可能導(dǎo)致性成熟梅山公豬精子存活率和能動(dòng)性高于75日齡的梅山公豬。F.Centurion等[26]研究也表明純化的PSP-Ⅰ/PSP-Ⅱ二聚體對(duì)高倍稀釋的精子具有保護(hù)作用，在體外生理溫度下，該復(fù)合物能在5 h內(nèi)維持精子的活力、運(yùn)動(dòng)能力和線粒體的活性。

綜上表明，270日齡杜洛克公豬精囊腺腺泡上皮有更多的黏膜褶皺，擴(kuò)大了分泌面積，使得黏膜泡內(nèi)分泌物增多，也增強(qiáng)了排出分泌物的能力。且杜洛克公豬的尿道球腺腺泡上皮細(xì)胞可釋放更多的分泌物。較多的精囊腺和尿道球腺分泌物會(huì)增加精漿量，提高精子代謝率和在雌性生殖道內(nèi)的存活率。而精漿蛋白PSP-Ⅰ/PSP-Ⅱ在性成熟的公豬精囊腺上皮及尿道球腺中的高表達(dá)可能在精子的代謝和活力維持等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，全面了解PSP-Ⅰ/PSP-Ⅱ的功能，對(duì)于精液體外保存和提高豬的受胎率與體外受精成功率具有重要意義。

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(編輯程金華)

Histological Comparison and mRNA Expression Analysis of Porcine Seminal Protein on Accessory Glands of Duroc and Meishan Boars

DING Hai-sheng1，XU De-quan1，2，3，LUO Yan1，LIU Min1，2*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070，China；2.KeyLaboratoryofSwineGeneticsandBreedingofAgriculturalMinistry，Wuhan430070，China；3.TheCooperativeInnovationCenterforSustainablePigProduction，Wuhan430070，China)

In order to assess the histological features of the vesicular gland and bulbourethral gland，and the mRNA expression of porcine seminal protein in 270-day-old Duroc and 75-，270- day-old Meishan boars，the paraffin sections with HE staining were performed and observed under light microscope，and quantitative real-time PCR was also used.Increased glandular lobules and decreased interlobular connective tissues were found in the vesicular glands of 270-day-old Meishan boars compared to those of 75-day-old Meishan boars.More acinus mucosal folds and interlobular connective tissues were found in the vesicular glands of 270-day-old Duroc boars than those of 270-day-old Meishan boars.The bulbourethral glands were composed of multiple lobules separated by connective tissue，and dense acini with small lumens were found.When Meishan boars reached adult age，the enlarged glandular lobules and decreased interlobular connective tissues were observed in the bulbourethral glands.In addition，larger glandular lobules，smaller acini and less interlobular connective tissues were observed in the bulbourethral glands of 270-day-old Meishan boars than those of 270-day-old Duroc boars.PSP-Ⅰ andPSP-Ⅱ were expressed highly in seminal vesicles，but there was no significant difference between the mature Duroc and Meishan boars (P>0.05).With advancing age，the mRNA expression level ofPSP-Ⅰ andPSP-Ⅱ increased significantly in Meishan boars (P<0.05).Overall，more acinus mucosal folds in vesicular glands and larger acini in the bulbourethral glands of Duroc boars increased the epithelial surface area available for secretion and led to an increase in the semen volume and the rate of sperm metabolism and survival.Moreover，high expression ofPSP-Ⅰ andPSP-Ⅱ in mature boars may play a role in some physiological processes，such as maintaining sperm metabolism and motility.

boar；accessory glands；histology；PSP-Ⅰ；PSP-Ⅱ

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.024

2016-01-29

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(2662015PY014；2662015PY192；26620015PY108)；湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新課題(2011-720)；國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2014BAD20B01)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31201764)；973項(xiàng)目(2014CB138500)；湖北省自然科學(xué)基金(2015CFA101)；武漢市青年科技晨光計(jì)劃(2014070404010204)

丁海生(1987-)，女，甘肅會(huì)寧人，博士生，主要從事動(dòng)物分子生物學(xué)研究，E-mail: dinghs123@163.com

劉敏，博士，副教授，E-mail:liumin23@mail.hzau.edu.cn；Tel: 027-87282091

S852.16+2

A

0366-6964(2016)08-1714-06