馬圣明，滕　蔓，余祖華，黨　露，李會(huì)珍，丁　軻，鄧瑞廣，羅　俊*

(1.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，動(dòng)物疫病與公共安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，洛陽(yáng) 471003；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州450002)

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馬立克病病毒超強(qiáng)毒株GX0101感染宿主部分病毒基因表達(dá)水平及致病階段分析

馬圣明1，2，滕蔓2，余祖華1，黨露2，李會(huì)珍3，丁軻1，鄧瑞廣2，羅俊1，2*

(1.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，動(dòng)物疫病與公共安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，洛陽(yáng) 471003；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州450002)

旨在探討馬立克病病毒(MDV)超強(qiáng)毒株GX0101對(duì)宿主的感染過(guò)程及致病階段，即“Cornell模型”，為進(jìn)一步使用該毒株研究MDV的致病或致瘤機(jī)制奠定基礎(chǔ)。用GX0101接種1日齡SPF雞，建立了感染宿主的動(dòng)物模型；然后用RT-qPCR分析10個(gè)具有代表性的MDV蛋白編碼基因在感染不同時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)基因轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，GX0101感染發(fā)病雞的臨床癥狀及剖檢病變與典型的馬立克病一致；MDV編碼的結(jié)構(gòu)蛋白基因gB、gE和UL6、非結(jié)構(gòu)蛋白基因UL42和UL52、立早期基因ICP4、水平傳播相關(guān)基因UL13以及磷酸化蛋白基因pp38具有相似的轉(zhuǎn)錄水平和趨勢(shì)，均在GX0101感染后7 d上升至第一個(gè)峰值，10 d降至低谷，14 d又逐漸升高并在21 d達(dá)到第二個(gè)峰值，30～60 d逐漸下降并處于較低的轉(zhuǎn)錄水平；MDV編碼的原癌基因meq和毒力相關(guān)基因RLORF6在GX0101感染7 d即持續(xù)升高，并在14～60 d的試驗(yàn)周期內(nèi)較長(zhǎng)時(shí)間處于高轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)合作者此前研究及本文結(jié)果分析，GX0101感染宿主的“Cornell模型”：早期增殖性-限制性感染期為1～7 d，潛伏感染期約為10 d前后，晚期溶細(xì)胞性感染及免疫抑制期發(fā)生于14～21 d，而T細(xì)胞轉(zhuǎn)化及淋巴瘤形成階段可能在14 d前后就已經(jīng)開(kāi)始。

馬立克病病毒；超強(qiáng)毒株；GX0101；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；基因表達(dá)；致病階段

雞馬立克病(Marek’s disease，MD)是由馬立克病病毒(Marek’s disease virus，MDV)感染引起的一種腫瘤性免疫抑制性傳染病[1]。MDV是一種嚴(yán)格的細(xì)胞結(jié)合性皰疹病毒，屬于α皰疹病毒亞類的馬立克病病毒屬，該屬成員又分為三個(gè)血清型，即血清1型(MDV-1)、血清2型(MDV-2)和和火雞皰疹病毒(HVT)，在最新的病毒分類中又被重新命名為禽皰疹病毒2型(GaHV-2)、禽皰疹病毒3型(GaHV-3)和火雞皰疹病毒1型(MeHV-1)[2]。三種血清型密切相關(guān)但又各有異同，僅MDV-1具有致病性和致瘤性。根據(jù)毒力及致病性的不同，MDV-1流行毒株又分為溫和MDV(mMDV)、強(qiáng)毒MDV(vMDV)、超強(qiáng)毒MDV(vvMDV)以及特超強(qiáng)毒MDV(vv+MDV)。目前，雖然可以用病毒疫苗較好地預(yù)防MD腫瘤發(fā)生，但伴隨著疫苗免疫壓力及病毒自身進(jìn)化，MDV流行毒株的毒力正不斷增強(qiáng)[3]。近年來(lái)，我國(guó)MD疫情時(shí)有暴發(fā)[4-9]，MDV感染雞群后不僅導(dǎo)致宿主免疫抑制，而且在后期引發(fā)腫瘤及大批雞死亡，長(zhǎng)期給世界養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

MDV-1早期感染雛雞后，可在宿主體內(nèi)建立持續(xù)性感染并終身帶毒，發(fā)病后期導(dǎo)致內(nèi)臟多發(fā)性腫瘤。美國(guó)康奈爾大學(xué)的學(xué)者早期研究認(rèn)為，MDV-1對(duì)易感宿主的致病過(guò)程(后來(lái)亦被稱為“Cornell模型”)一般包括4個(gè)階段[10-11]：早期增殖性-限制性感染(2～7 d)、潛伏感染(7～10 d)、第二次溶細(xì)胞性感染免疫抑制期(18 d～)和淋巴瘤形成階段(28 d～)。此后相關(guān)研究表明，MDV-1不同流行毒株感染宿主的“Cornell模型”可能存在明顯差異，如vvMDV毒株RB1B在雞胸腺組織的潛伏感染建立約在14 d左右，第二次溶細(xì)胞感染階段則可能為21～28 d[12]。這表明MDV的感染及致病不僅過(guò)程復(fù)雜，而且不同毒株之間也可能存在較大差異。MDV基因組較為龐大，全長(zhǎng)約180 kb、編碼200個(gè)左右的潛在開(kāi)放閱讀框(ORF)，但已知病毒蛋白及功能較為清楚的僅有數(shù)十種。進(jìn)一步深入研究MDV編碼的基因及功能，對(duì)于MD的有效防控具有重要意義。因此，選擇具有代表性的MDV毒株并明確其感染致病的“Cornell模型”，對(duì)于后續(xù)針對(duì)關(guān)鍵時(shí)間節(jié)點(diǎn)開(kāi)展MDV致病機(jī)制研究來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。

GX0101是我國(guó)學(xué)者從臨床發(fā)病雞體內(nèi)分離到的第一個(gè)含有禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(reticuloendothelial hyperplasia virus，REV)長(zhǎng)末端重復(fù)序列(long terminal repeat，LTR)的重組野毒株，該毒株是一個(gè)vvMDV毒株，在致病性及水平傳播等方面都具有獨(dú)特的生物學(xué)特征[13-14]。此前，GX0101毒株已經(jīng)被成功地構(gòu)建成為具有感染性的細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome，BAC)病毒克隆[15]，并在此基礎(chǔ)上研究發(fā)現(xiàn)REV—LTR的重組插入顯著增強(qiáng)了GX0101的水平傳播能力[16]，同時(shí)利用BAC克隆還對(duì)GX0101病毒全基因組的序列進(jìn)行了測(cè)定分析[17-18]。這是目前國(guó)內(nèi)學(xué)者完成的第一個(gè)vvMDV全基因組測(cè)序的中國(guó)分離株，同時(shí)也是少數(shù)幾個(gè)國(guó)際上全基因組序列已知的vvMDV毒株之一。最近幾年，以GX0101為親本毒株，我們已對(duì)MDV編碼的病毒miRNA的基因表達(dá)及功能進(jìn)行了系列研究，并發(fā)現(xiàn)部分miRNA在MDV-1致病、致瘤過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[19-23]。為了進(jìn)一步應(yīng)用GX0101開(kāi)展MDV的轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因功能、感染致病以及致瘤機(jī)制等相關(guān)研究，有必要首先了解該毒株感染宿主的“Cornell模型”。

在MDV編碼的病毒基因與蛋白中，功能較為清楚的結(jié)構(gòu)蛋白如糖蛋白gB主要參與細(xì)胞的吸附和病毒侵入[24]，gE主要參與病毒在細(xì)胞之間的傳播[25]，UL6作為次要衣殼蛋白主要參與DNA包裝等過(guò)程。非結(jié)構(gòu)蛋白中UL42是MDV病毒復(fù)制必須的DNA聚合酶，UL52主要發(fā)揮DNA解旋酶的功能[26]。ICP4作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，主要參與激活其他病毒基因的功能并在MDV的潛伏感染和細(xì)胞轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用[27]。MDV025編碼的UL13主要與MDV的水平傳播相關(guān)[28]，磷酸化蛋白pp38則與MDV的溶細(xì)胞感染相關(guān)并調(diào)節(jié)雙向啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄[29]。meq是MDV編碼的病毒原癌基因，是目前已知參與MD腫瘤形成最重要的病毒基因[30]。此外，MDV編碼的RLORF6與病毒的毒力相關(guān)[31]。因此在本研究中，作者首先通過(guò)1日齡SPF來(lái)杭雞人工攻毒試驗(yàn)，建立GX0101感染宿主的動(dòng)物模型，然后用RT-qPCR分析上述10個(gè)MDV代表基因在病毒感染后不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)合前期研究結(jié)果，探討GX0101感染宿主后的各個(gè)病程階段，為后續(xù)研究奠定重要的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1毒株、雞胚及動(dòng)物

MDV超強(qiáng)毒株GX0101[13-14]，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院崔治中教授饋贈(zèng)。8～10日齡SPF雞胚、1日齡SPF白來(lái)杭雞，均購(gòu)自山東濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司。

1.2主要試劑

TRIzol Reagent，購(gòu)自Invitrogen公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)、RNA Loading Buffer(+EB)，均購(gòu)自TaKaRa公司；10 × MOPS RNA 電泳緩沖液，購(gòu)自Solarbio公司。

1.3引物設(shè)計(jì)與合成

綜上，通過(guò)科學(xué)校核各項(xiàng)檢測(cè)設(shè)備、規(guī)范檢測(cè)報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)、健全工程質(zhì)量檢測(cè)管理體系等等，能夠保證水利工程質(zhì)量檢測(cè)管理效果得到更好提升，降低水利工程質(zhì)量檢測(cè)設(shè)備出現(xiàn)運(yùn)行故障的概率。對(duì)于工程質(zhì)量檢測(cè)管理人員而言，要大力學(xué)習(xí)國(guó)內(nèi)外先進(jìn)的水利工程質(zhì)量檢測(cè)管理知識(shí)，提高自身的管理能力，在保證水利工程質(zhì)量檢測(cè)管理工作順利進(jìn)行的基礎(chǔ)之上，推動(dòng)我國(guó)水利工程的穩(wěn)定發(fā)展。

根據(jù)編碼蛋白的功能，選取10個(gè)具有代表性的MDV基因(表1)，參照GX0101全基因組序列(GenBank Acc.No.JX844666.1)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)基因的特異性引物對(duì)(表2)。上述引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表110個(gè)代表性MDV蛋白編碼基因的分類及功能

Table 1Classification and function of 10 representative viral protein-coding genes of MDV

分類Classification編號(hào)No.基因Gene座位(5'-3')*Position(5'-3')長(zhǎng)度/ntLength(nt)功能Function結(jié)構(gòu)蛋白MDV040gB59785-623822597與細(xì)胞吸附和病毒的進(jìn)入相關(guān)MDV096gE162471-1639641493參與病毒在細(xì)胞之間的傳播MDV018UL624043-262112168次要衣殼蛋白,參與DNA包裝非結(jié)構(gòu)蛋白MDV055UL4298158-992671109DNA聚合酶MDV066UL52113257-1164813224DNA解旋酶立早期基因MDV084ICP4142776-1497416965轉(zhuǎn)錄調(diào)控子,激活其他病毒基因的功能,及參與潛伏感染和轉(zhuǎn)化蛋白激酶MDV025UL1335069-366101541水平傳播磷酸化蛋白MDV073pp38125654-126526872與溶細(xì)胞感染相關(guān),調(diào)節(jié)雙向啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄原癌蛋白MDV076meq133603-1346221019參與腫瘤的形成及免疫抑制毒力基因MDV077.5RLORF6134075-134692617與病毒毒力相關(guān)

*MDV參考毒株GX0101(GenBank Acc.No.JX844666.1)

*The reference MDV strain GX0101 (GenBank Acc.No.JX844666.1)

1.4動(dòng)物試驗(yàn)

取8～10日齡SPF雞胚制備原代CEF細(xì)胞，用于GX0101的增殖和病毒滴度定量。1日齡SPF來(lái)杭雞160只，攻毒組和對(duì)照組各取80只，攻毒組每只腹腔接種0.2 mL GX0101病毒液(2 000 PFU·只-1)、對(duì)照組每只腹腔接種等量空白CEF活細(xì)胞作為陰性對(duì)照，分別飼養(yǎng)于帶負(fù)壓過(guò)濾空氣的SPF隔離器中。分別于病毒接種后3、7、10、14、21、30、45和60 d各隨機(jī)取雞6只、稱重后處死，分別采脾、胸腺和法氏囊組織樣品，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。統(tǒng)計(jì)攻毒組和對(duì)照組試驗(yàn)雞各不同時(shí)間點(diǎn)的體重、囊重比及胸腺指數(shù)，并進(jìn)行差異顯著性分析。

1.5RNA制備及cDNA合成

按照TRIzol RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別提取各不同時(shí)間點(diǎn)采集的GX0101攻毒雞脾總RNA，用Nanodrop-2000全波長(zhǎng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及純度，然后用1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量，-80 ℃保存?zhèn)溆?。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別對(duì)提取的RNA樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6qPCR

以雞內(nèi)源性基因GAPDH為內(nèi)參基因，用SYBR GREEN Ⅱ qPCR法，分析MDV各代表基因(表1)在GX0101感染后不同時(shí)間點(diǎn)雞脾中的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。20 μL的qPCR反應(yīng)體系包括：2 × SYBR?Premix ExTaqⅡ 10 μL；10 μmol·L-1的上、下游引物對(duì)(表2)各0.8 μL；50 × ROX Reference Dye Ⅱ。0.4 μL；cDNA模板2 μL；ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃2 min；95 ℃15 s；60 ℃40 s，共40個(gè)循環(huán)，熔解曲線程序?yàn)?5 ℃15 s；60 ℃15 s，1.75 ℃·min-1升溫至95 ℃，維持15 s，升溫過(guò)程通過(guò)連續(xù)采集熒光信號(hào)生成熔解曲線。試驗(yàn)對(duì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集的脾樣本均使用6個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每份重復(fù)樣品各設(shè)3個(gè)qPCR反應(yīng)并取平均值。最后以3 d樣本試驗(yàn)結(jié)果為對(duì)照，采用2-ΔΔCT法計(jì)算MDV目的基因在7～60 d各不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。

表2RT-qPCR分析MDV基因相對(duì)表達(dá)水平的引物對(duì)

Table 2Primers used for analyzing the relative expression levels of MDV genes by RT-qPCR

編號(hào)No.基因Gene引物Primer序列(5'-3')Sequence(5'-3')擴(kuò)增長(zhǎng)度/bpAmplicon/bp1gBgB-FgB-RTCTAGGGCATGGCACACGACGAATACGGAAACACAGAGCGG1252gEgE-FgE-RTACACCGAGACGTGGACATGGGACGATTTCATCCGCATACCTC1353UL6UL6-FUL6-RGAATTCGATGTCGGCAGTAAGCTACATTCCCCACGCTCACCAC1164UL42UL42-FUL42-RTTCGTCAGCCCTCATCGTGAAATGCGTTAGTATCTTCCAGTGC1155UL52UL52-FUL52-RAATGGGTTATCTCTGAAGGGTCGAGTCAGACCTCGTTTACCCCTTG1116ICP4ICP4-FICP4-RGCACTGCATTCCGAGAGTCATTTGGGAATTTGGAGGGCG1617UL13UL13-FUL13-RACCCTCGGTGACGTTAACAAAGTTCATGGATCTCGGCAAAGC1028pp38pp38-Fpp38-RCCGAAAGACAAAACCCAAATATGTAACCAGCATATAAGAACGC1299meqmeq-Fmeq-RCGCAGGAAGCAGACGGACTACCATAGGGCAAACTGGCTCAT15710RLORF6RLORF6-FRLORF6-RAATGCGGATCATCAGGGTCTCGAGAGGCTTTATGCTCGTCTTACC14011GAPDHGAPDH-FGAPDH-RAAGTCCCTGAAAATTGTCAGCAATATGGCATGGACAGTGGTCATAAG119

2　結(jié)　果

1日齡SPF來(lái)航雞在GX0101感染后7 d內(nèi)采食量及精神狀態(tài)基本正常，此后部分感染雞陸續(xù)出現(xiàn)精神萎頓、羽毛蓬松以及采食量下降等癥狀。14～21 d有少量雞發(fā)病死亡，對(duì)病死雞及采樣處死雞進(jìn)行剖檢，個(gè)別雞脾在21 d左右可觀察到小的腫瘤灶，至30 d病死雞腫瘤明顯，60 d時(shí)GX0101感染雞的累計(jì)死亡達(dá)到48只，累計(jì)死亡率為60%，腫瘤發(fā)生率為23%。在整個(gè)動(dòng)物試驗(yàn)周期內(nèi)，CEF陰性對(duì)照組試驗(yàn)雞生長(zhǎng)正常，未發(fā)生病理性死亡。對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)雞的體重統(tǒng)計(jì)及差異顯著性分析結(jié)果顯示(表3)，GX0101攻毒后3～10 d，感染組與CEF陰性對(duì)照組相比差異不顯著，而攻毒后14～30 d感染雞的體重顯著低于CEF對(duì)照組(P<0.05)，此后兩組之間的差異分析不顯著。與體重統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果相似，兩組試驗(yàn)雞的囊重比和胸腺指數(shù)在3～10 d無(wú)顯著差異，但在GX0101攻毒后14～21 d感染組的囊重比和胸腺指數(shù)均顯著低于CEF對(duì)照組(P<0.01)(表4)。上述結(jié)果表明，GX0101在感染SPF雞后2周左右，開(kāi)始對(duì)宿主產(chǎn)生顯著的免疫抑制。

2.2RNA提取鑒定

用TRIzol Reagent提取GX0101感染雞脾總RNA，Nanodrop-1000測(cè)定總RNA OD260 nm/OD280 nm和OD260 nm/OD230 nm分別介于1.90～2.20和2.00～2.30，說(shuō)明RNA的質(zhì)量及純度很好。經(jīng)1%甲醛變性凝膠電泳，結(jié)果顯示所提取的總RNA樣品28S和18S 條帶非常亮，且28S條帶約為18S條帶的2倍，5S條帶相對(duì)較細(xì)(圖1)，說(shuō)明所提取的總RNA質(zhì)量及完整性較好，可用于后續(xù)試驗(yàn)分析。

圖1　GX0101感染后3 d雞脾總RNA樣品電泳分析結(jié)果Fig.1　Agarose gel electrophoresis analysis of total RNAs from GX0101-infected chicken spleens collected at 3 dpi

2.3RT-qPCR條件優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)熔解曲線分析，MDV蛋白編碼基因gB、gE、UL6、UL42、UL52、ICP4、UL13、pp38、meq、RLORF6和宿主內(nèi)參基因GAPDHqPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值分別為82.1、81.5、78.8、81.3、78.4、86.0、79.3、80.1、84.7、82.9和84.8 ℃。在此條件下，各擴(kuò)增產(chǎn)物均為單一峰、無(wú)非特異性產(chǎn)物及引物二聚體的存在(圖2A)；各個(gè)MDV基因的擴(kuò)增曲線間距均一、平行性較好(圖2B)，說(shuō)明目的基因與內(nèi)參基因在擴(kuò)增效率上能夠保持一致。上述結(jié)果表明，各相關(guān)參數(shù)可直接進(jìn)行下一步的qPCR分析。

2.4MDV基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平分析結(jié)果

采用2-ΔΔCT法分析RT-qPCR數(shù)據(jù)，通過(guò)GraphPad Prism軟件處理結(jié)果，分析10個(gè)MDV代表基因在GX0101感染雞脾中不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。如圖3所示，MDV結(jié)構(gòu)蛋白基因gB、gE和UL6、非結(jié)構(gòu)蛋白基因UL42和UL52、立早期基因ICP4、與病毒水平傳播相關(guān)基因UL13以及磷酸化蛋白pp38具有相似的表達(dá)趨勢(shì)，均在GX0101感染后7 d上升至第一個(gè)峰值，10 d降至低谷，14 d又逐漸升高并在21 d達(dá)到第二個(gè)峰值，此后逐漸下降至60 d并處于較低的轉(zhuǎn)錄水平(圖3a～h)。與上述病毒基因不同，MDV編碼的原癌蛋白基因meq和毒力相關(guān)基因RLORF6在GX0101感染7 d即持續(xù)升高，并在感染后14～60 d的試驗(yàn)周期內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間處于較高轉(zhuǎn)錄水平(圖3i～j)。

3　討　論

MD是家禽最重要的免疫抑制病與腫瘤病之一，近年來(lái)時(shí)有暴發(fā)，伴隨著長(zhǎng)期的疫苗免疫壓力，MDV毒力也在不斷增強(qiáng)[3]，部分流行毒株已在一定程度上突破傳統(tǒng)疫苗免疫保護(hù)[8-9]。此外，MDV與REV等反轉(zhuǎn)錄病毒亦發(fā)生基因重組并形成新的流行毒株，這也不斷加大MD防控的壓力[32]。因此，加強(qiáng)對(duì)MDV流行毒株致病機(jī)制的研究具有重要意義。MDV編碼的蛋白質(zhì)基因約有上百種，但目前功能較為清楚的基因僅有數(shù)十種，進(jìn)一步深入研究未知基因功能、挖掘潛在致病因子的任務(wù)仍十分艱巨。GX0101是國(guó)內(nèi)外首個(gè)從臨床分離的整合REV-LTR的重組野毒株[13]，該毒株是一個(gè)超強(qiáng)毒株[14]，具有水平傳播快[16]、毒力強(qiáng)等特征，可作為代表性毒株用于進(jìn)一步研究MDV的轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因重組以及致病致瘤機(jī)制等。

圖2　SYBR GreenⅡRT-qPCR擴(kuò)增MDV及宿主基因的熔解曲線(A)和擴(kuò)增曲線(B)Fig.2　Melting curves (A) and amplification plots (B) of SYBR Green Ⅱ RT-qPCR for MDV and host genes

此前研究表明，MDV感染宿主的“Cornell模型”一般包括4個(gè)階段：早期增殖性—限制性感染(2～7 d)、潛伏感染(7～10 d)、第二次溶細(xì)胞性感染(18 d～)和淋巴瘤形成階段(28 d～)[10-11]。但是，GX0101入侵宿主、感染及致病的過(guò)程目前尚不清楚。本文中，作者首先建立了GX0101感染SPF雞的宿主動(dòng)物模型，對(duì)感染雞的體重及免疫器官指數(shù)(囊重比和胸腺指數(shù))進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，然后用RT-qPCR分析了10個(gè)具有代表性的MDV基因在感染雞脾中的動(dòng)態(tài)表達(dá)水平。作者研究發(fā)現(xiàn)，GX0101感染后1周左右對(duì)宿主的體重及免疫器官指數(shù)均無(wú)顯著影響，但感染后14 d～21 d對(duì)宿主生長(zhǎng)以及免疫器官產(chǎn)生顯著影響，導(dǎo)致免疫器官的損傷，這與此前的相關(guān)研究結(jié)果基本一致[20-21]。而對(duì)GX0101編碼的部分病毒基因表達(dá)的RT-qPCR分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與MDV病毒復(fù)制、病毒粒子包裝等相關(guān)基因(如gB、gE、UL6、UL42和UL52)以及與MDV感染及水平傳播等相關(guān)基因(如ICP4、UL13和pp38)的表達(dá)水平均在GX0101感染后1～7 d持續(xù)上升，并在10 d降至低谷，14～21 d持續(xù)升高并在21 d達(dá)到峰值，30～60 d逐漸下降并處于較低的表達(dá)水平。但是，與MDV致病及致瘤相關(guān)的毒力基因(如meq和RLORF6)在GX0101感染后即持續(xù)升高，并在整個(gè)動(dòng)物試驗(yàn)周期尤其是感染后期長(zhǎng)時(shí)間處于較高表達(dá)水平。這表明MDV的復(fù)制相關(guān)基因與致病致瘤相關(guān)基因在感染宿主體內(nèi)存在完全不同的表達(dá)模式，并與感染時(shí)間密切相關(guān)。

結(jié)合此前的相關(guān)研究[20，21]及本研究中GX0101對(duì)感染雞的免疫器官指數(shù)的影響以及部分MDV病毒編碼基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)譜，作者分析認(rèn)為GX0101感染宿主的早期增殖性—限制性感染發(fā)生于1～7 d，潛伏感染約為10 d前后，晚期溶細(xì)胞性感染及免疫抑制發(fā)生于14～21 d，而T細(xì)胞轉(zhuǎn)化及淋巴瘤形成可能在14 d前后就已經(jīng)開(kāi)始。與此前已報(bào)道的MDV感染 “Cornell模型”相比[10-11]，GX0101感染宿主后的第二階段的病毒復(fù)制與免疫抑制、以及誘導(dǎo)宿主腫瘤發(fā)生的時(shí)間明顯提前，這很可能與GX0101較強(qiáng)的毒力及水平傳播較快等生物學(xué)特征有關(guān)，其具體機(jī)制仍有待深入研究。

圖3　MDV代表性基因在不同感染時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平Fig.3　Relative transription levels of the MDV representative genes at different days post-infection (dpi)

4　結(jié)　論

建立了GX0101感染宿主的動(dòng)物模型，并較為清晰地確立了其感染及致病的“Cornell模型”，包括：早期增殖性—限制性感染期1～7 d，潛伏感染期10 d前后，晚期溶細(xì)胞性感染及免疫抑制期14～21 d，T細(xì)胞轉(zhuǎn)化及淋巴瘤形成期始于14 d前后，為今后應(yīng)用GX0101研究MDV的轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因重組及致病致瘤機(jī)制等奠定了重要基礎(chǔ)。

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(編輯白永平)

The Viral Gene Expression Profiles and Pathogenic Phases of the Disease Caused by Very Virulent MDV Strain GX0101

MA Sheng-ming1，2，TENG Man2，YU Zu-hua1，DANG Lu2，LI Hui-zhen3，DING Ke1，DENG Rui-guang2，LUO Jun1，2*

(1.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandPublicSafety，CollegeofAnimalScienceandTechnology，HenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang471003，China；2.KeyLaboratoryofAnimalImmunologyoftheMinistryofAgriculture，HenanProvincialKeyLaboratoryofAnimalImmunology，HenanAcademyofAgriculturalSciences，Zhengzhou450002，China；3.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China)

The present work was performed to study the infection phases of Marek’s disease (MD)，namely ‘Cornell Model’，caused by the very virulent (vv) Marek’s disease virus (MDV) strain GX0101.For the first step，one-day-old specific pathogen free (SPF) chickens were challenged by GX0101 to establish the animal model of MD.Then，the kinetic transrption levels of 10 representative MDV protein-coding genes at different days post-infection (dpi) were determined by real-time quantitative PCR (RT-qPCR).The results showed that the onset of clinical symptoms and autopsy lesions of GX0101-infected birds was consistent with the typical MD cases.Some of the MDV protein-coding genes，including the structural protein-coding genes ofgB，gEandUL6，the nonstructural protein-coding genes ofUL42 andUL52，the immediate early infected cell protein 4 gene (ICP4)，the horizontal transmission associated gene ofUL13 and the 38 kD phosphorylated protein gene (pp38)，demonstrated a similar transcription pattern，which increased to a first peak at 7 dpi，fell to a bottom level at 10 dpi，increased again at 14 dpi and reached to a second peak at 21 dpi，and then gradually declined to low levels from 30 to 60 dpi.However，both of the unique MDV oncogenemeqand virulence related geneRLORF6 represented a persistent increasing transcription trend from 7 dpi，and then kept at a higher transcription level from 14 to 60 dpi.Our previous and present data indicates that the ‘Cornell Model’ of MD caused by GX0101 are as blow：the early cytolytic phase occurs at 1-7 dpi，the latent phase establishes at about 10 dpi and the late cytolytic and immunosuppressive phase appears at 14-21 dpi，while the T cell transformation and lymphomagenesis possibly starts at about 14 dpi.

Marek’s disease virus；vvMDV；GX0101；RT-qPCR；gene expression；pathogenic phase

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.014

2016-03-21

國(guó)家自然科學(xué)基金(31372445)；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFD0500802)

馬圣明(1991-)，男，河南羅山人，碩士生，主要從事動(dòng)物病毒分子致病機(jī)制研究，Tel：0371-65756056，E-mail：mashengming66@163.com

羅俊，E-mail：luojun593@aliyun.com

S852.659.1

A

0366-6964(2016)08-1635-10