彭志鋒，高冬生，劉紅英，楊　霞，趙　軍，王新衛(wèi)，李永濤，陳　陸，常洪濤，王川慶

(河南農(nóng)業(yè)大學禽病研究所，鄭州 450002)

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鴨源雞桿菌整合子及其與耐藥性的相關(guān)性分析

彭志鋒#，高冬生#，劉紅英，楊霞，趙軍，王新衛(wèi)，李永濤，陳陸，常洪濤，王川慶*

(河南農(nóng)業(yè)大學禽病研究所，鄭州 450002)

為了解鴨源雞桿菌的整合子及其與耐藥性之間的關(guān)系，運用PCR方法檢測鴨源雞桿菌分離株攜帶1、2、3類整合子的情況，采用K-B法測定61株鴨源雞桿菌對13種抗菌藥的敏感性，并分析其整合子與耐藥性的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果顯示，所有參試菌株對克林霉素、諾氟沙星、鏈霉素有耐藥性的菌株比例均不低于88.52 %(54/61)。19株鴨源雞桿菌攜帶1類整合子，陽性率為31.15%，且此類菌株的耐藥種數(shù)均≥3；在耐藥種數(shù)≥5的菌株中，整合子陽性菌的比例(78.95%)顯著高于整合子陰性菌的比例(28.57%，P<0.01)。本試驗首次研究了鴨源雞桿菌中整合子的分布情況。參試菌株僅攜帶1類整合子，且普遍存在多重耐藥性；1類整合子可能在鴨源雞桿菌多重耐藥性的形成中發(fā)揮一定作用。

鴨源雞桿菌；整合子；耐藥性

雞桿菌屬是巴氏桿菌科中相對較新的屬[1]，該屬包括數(shù)個種[2]。然而似乎只有溶血性鴨源雞桿菌(Gallibacteriumanatis，G.anatis)在家禽中普遍流行，其感染往往造成蛋雞的輸卵管炎和腹膜炎[3-4]。隨著細菌耐藥性的不斷增加，導致抗生素臨床治療效果不佳。研究顯示巴氏桿菌科細菌存在普遍的耐藥性[5-6]，而鴨源雞桿菌耐藥性的報道尚不多見[7-8]。

細菌整合子是具有捕獲和表達外源基因功能的遺傳單位，在常見病原菌中普遍存在，且與多重耐藥性關(guān)系密切[9-11]。包括鴨源雞桿菌在內(nèi)的巴氏桿菌科細菌整合子的研究鮮有報道[12]。為了解鴨源雞桿菌的耐藥性、整合子分布情況以及兩者的關(guān)系，作者首次檢測61株鴨源雞桿菌分離株的整合子，以及對13種抗菌藥的敏感性，并分析鴨源雞桿菌整合子與耐藥性之間的相關(guān)性，旨在了解鴨源雞桿菌的耐藥機制，并為臨床篩選有效抗生素提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌株

61株鴨源雞桿菌來源于河南、陜西、山西、山東四省患腹膜炎、輸卵管炎的蛋雞，由本實驗室分離、保存[13]；質(zhì)控菌ATCC27090和ATCC25922購自廣東微生物菌種保藏中心。

1.2試劑

藥物紙片標準品購自杭州天和藥物技術(shù)開發(fā)公司，包括青霉素(P)、氨芐西林(AM)；諾氟沙星(NOR)、環(huán)丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LVF)；克林霉素(CM)；鏈霉素(S)、妥布霉素(TM)、卡那霉素(KAN)、慶大霉素(GM)；四環(huán)素(TE)；頭孢噻呋(CEF)和利福平(RA)共13種(7類)抗菌藥物；PCR擴增試劑購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3引物

檢測1、2和3類整合酶基因的特異性引物參考以往的報道[14]，預(yù)期擴增產(chǎn)物的大小分別為553、789和600 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.41、2和3類整合酶基因的PCR檢測

煮沸法提取細菌DNA。按文獻[14]所述分別進行三類整合酶基因的擴增，擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

1.5藥物敏感性試驗

采用K-B法測定61株鴨源雞桿菌對13種抗菌藥物的敏感性。由于還沒有針對鴨源雞桿菌的操作標準和判定標準，因此本研究參照NCCLS(2013)中巴氏桿菌的標準進行操作和結(jié)果判斷。

1.6DNA序列分析

PCR擴增的整合酶基因片段測序后通過GenBank中Genome BLAST進行基因同源性分析。

1.7統(tǒng)計學分析

分析鴨源雞桿菌整合子與耐藥性的關(guān)系，并用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析。

2　結(jié)　果

2.1整合子檢出情況

僅部分菌株含有1類整合酶基因；所有菌株未發(fā)現(xiàn)2和3類整合子。

1類整合酶基因PCR產(chǎn)物片段大小與預(yù)期相符(圖1)。經(jīng)測序和同源性分析，與GenBank中1類整合酶基因相似性接近或等于100%。61株鴨源雞桿菌中僅19株擴增出1類整合酶基因，陽性率為31.15%。所有參試菌株的2和3類整合酶基因檢測均為陰性。

2.261株鴨源雞桿菌的耐藥表型

K-B法檢測結(jié)果表明參試菌株均表現(xiàn)多重耐藥，未見對所有菌株敏感的藥物；61株鴨源雞桿菌對下列藥物有耐藥性的菌株比例均在80%以上：克林霉素(CM，93.44%)、諾氟沙星(NOR，93.44%)、鏈霉素(S，88.52%)、環(huán)丙沙星(CIP，83.61%)、卡那霉素(KNA，80.33%)；而對慶大霉素(GM，18.03%)、頭孢噻呋(CEF，22.95%)和利福平(RA，11.47%)的耐藥率均低于23%(圖2)。

2.3鴨源雞桿菌1類整合子與耐藥性的關(guān)系

對每類受試藥物逐一繪制參試鴨源雞桿菌的耐藥譜，所分別統(tǒng)計的1類整合子陽性和陰性菌株耐藥譜分布情況見圖3。結(jié)果顯示61株鴨源雞桿菌普遍存在耐藥性；1類整合子陽性菌株的耐藥種數(shù)為3～7，其中78.95%(14/19)的菌株耐藥5～7種。1類整合子陰性菌株的耐藥種數(shù)為1～6，其中僅28.57%(12/42)菌株耐藥5～6種，遠低于整合子陽性菌株的比例，兩者差異極顯著(P<0.01)。在耐藥種數(shù)≥5的菌株中，整合子陽性菌株所占比例遠高于整合子陰性菌株(圖3)。耐藥種數(shù)≥4的鴨源雞桿菌共43株(70.5%)，其中整合子陽性菌7株。耐藥種數(shù)≤3的鴨源雞桿菌共18株(29.5%)，其中整合子陽性菌株2株。隨著整合子陽性菌株比例的降低，參試菌株的耐藥種數(shù)也相應(yīng)減少，其差異極顯著(P<0.01)。

M．DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標準；+.陽性對照；-.陰性對照；1～61.鴨源雞桿菌1類整合酶基因PCR產(chǎn)物M．DL2000 DNA marker；+.Positive control；-.Negative control；1-61.PCR products of intI1 gene of G.anatis isolates圖1　61株鴨源雞桿菌1類整合酶基因PCR擴增產(chǎn)物電泳Fig.1　The results of PCR amplification of intI1gene of 61 G.anatis isolates

AM.氨芐西林；CIP.環(huán)丙沙星；CM.克林霉素；P.青霉素；NOR.諾氟沙星；KAN.卡那霉素；GM.慶大霉素；S.鏈霉素；TM.妥布霉素；TE.四環(huán)素；LVF.左氧氟沙星；CEF.頭孢噻呋；RA.利福平AM.Ampicillin；CIP.Ciprofloxacin；CM.Clindamycin；P.Penicillin；NOR.Norfloxacin；KAN.Kanamycin；GM.Gentamicin；S.Streptomycin；TM.Tobramycin；TE.Tetracycline；LVF.Levofloxacin；CEF.Cephalothin；RA.Rifampicin圖2　61株鴨源雞桿菌耐藥率分析Fig.2　Drug resistance rate of G.anatis strains(n=61)

虛線框顯示耐藥種數(shù)≥5時，1類整合子陽性菌(n=19)的耐藥菌株比例均大于整合子陰性菌(n=42)The dotted box indicated when the number of antibiotic category≥5，Drug resistance rates of class 1 integron positive strains (n=19) are greater than that of class 1 integron negative strains (n=42)，respectively圖3　鴨源雞桿菌多重耐藥及其1類整合子分布Fig.3　Multidrug resistance and class 1 integron distribution of G.anatis isolates

除了頭孢噻呋和利福平以外，61株鴨源雞桿菌對其他11種抗菌藥物的耐藥性菌株比例均為1類整合子陽性菌株高于陰性菌株，但只有對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥性，1類整合子陽性和陰性鴨源雞桿菌的差異顯著(P<0.01)(表1)。

表161株鴨源雞桿菌耐藥性與1類整合子的關(guān)系

Table 1Association between antibiotic resistance and class 1 integron in 61G.anatisstrains

抗菌藥物Antibacterialagents耐藥菌株比例/%Rateofresistancestrains整合子陽性菌株Integronpositivestrains整合子陰性菌株IntegronnegativestrainsP值Pvalue環(huán)丙沙星CIP100(19)76.19(32)<0.05諾氟沙星NOR100(19)90.48(38)>0.05左氧氟沙星LVF78.95(15)9.52(4)<0.01卡那霉素KAN94.74(18)73.81(31)>0.05慶大霉素GM26.32(5)14.29(6)>0.05鏈霉素S94.74(18)85.71(36)>0.05妥布霉素TM47.37(9)33.33(14)>0.05氨芐西林AM84.21(16)64.29(27)>0.05青霉素P89.47(17)73.81(31)>0.05頭孢噻呋CEF15.79(3)26.19(11)>0.05利福平RA10.53(2)11.90(5)>0.05克林霉素CM100(19)90.48(38)>0.05四環(huán)素TE78.95(15)54.76(23)>0.05

整合子陽性菌株總數(shù)為19，整合子陰性菌株總數(shù)為42

The amounts of integron positive strains and integron negative strains are 19 and 42，respectively

3　討　論

3.1隨著抗生素的大量使用，細菌耐藥性造成細菌感染的治療越來越復雜。本研究中，作者選取了禽類生產(chǎn)中經(jīng)常用到的13種抗菌藥物，并檢測了61株鴨源雞桿菌對其耐藥情況，而且首次鑒定了整合子在鴨源雞桿菌中的分布情況，并分析了其與多重耐藥性的關(guān)系。本研究參試菌株普遍存在多重耐藥性，以往的研究中也有類似結(jié)果[7-8]。鴨源雞桿菌對克林霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星和卡那霉素的多重耐藥性提示，使用這些藥物治療該菌引起的雞輸卵管炎、腹膜炎可能不會收到預(yù)期效果。高耐藥率可能與臨床大量使用這些藥物有直接關(guān)系[15]；因此建議使用耐藥率較低的慶大霉素和頭孢噻呋等藥物防治該病，同時勿過量使用抗生素，以減緩細菌耐藥性的產(chǎn)生[16]。本文參試菌株耐藥譜與巴氏桿菌科其他細菌的情況不盡相同[17-18]，這可能與不同地區(qū)的用藥習慣不同有關(guān)。本研究為防治該病的臨床合理用藥提供了科學依據(jù)。

3.2整合子是具有捕獲和表達外源基因功能的遺傳單位，存在于細菌質(zhì)?；蛉旧w上，通過自身編碼的整合酶來獲取外源基因并使之表達[19]。整合子捕獲、整合和表達耐藥盒，引起耐藥基因在同種或不同菌屬間傳播，從而使細菌耐藥性得以廣泛擴散[20-21]。革蘭陰性菌中研究比較多的是1、2、3類整合子，其中以1類整合子最為常見[10，22-23]。目前，有關(guān)巴氏桿菌科細菌整合子的信息極少，本研究首次報道了整合子在鴨源雞桿菌中的分布，并分析了其與多重耐藥的關(guān)系。結(jié)果表明，所有參試菌株均不存在2、3類整合子，31.15%的菌株含有1類整合子。由于參試菌株數(shù)量限制，需要進一步檢測更多菌株，才能確定2、3類整合子在鴨源雞桿菌中的存在狀態(tài)。

綜合本研究的各項數(shù)據(jù)可以看出，整合子與鴨源雞桿菌的多重耐藥有一定的關(guān)系。整合子陽性菌的耐藥種數(shù)為3～7，且耐藥5～7種的菌株比例為78.95%(14/19)；整合子陰性菌的耐藥種數(shù)為1～6，且耐藥5～6種的菌株僅28.57%(12/42)，兩者差異極顯著(P<0.01)；耐藥種數(shù)為5、6和7時，整合子陽性菌株的耐藥率均高于整合子陰性菌株(圖3)。特別是在耐藥種數(shù)為5的所有菌株中，其整合子陽性菌株比例明顯高于陰性菌株比例且具有統(tǒng)計學意義，提示整合子可能與鴨源雞桿菌多重耐藥存在一定的關(guān)聯(lián)性。這與某些學者對其他細菌的研究結(jié)果一致[10，24-25]。

3.361株鴨源雞桿菌對11種抗菌藥物的耐藥率，均為整合子陽性菌株高于陰性菌株，但只有對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥性差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，這表明鴨源雞桿菌對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的抗性可能與整合子的出現(xiàn)直接相關(guān)；對其他9種抗菌藥的耐藥率差異不顯著(P>0.05)，暗示參試細菌對此9種抗菌藥的耐藥表型差異與整合子無直接相關(guān)性。出現(xiàn)這一結(jié)果可能因為耐藥表型差異不完全是由整合子主導的，而是由其他未檢測的耐藥因素共同作用的結(jié)果[7-8]。整合子與細菌多重耐藥性的確切關(guān)系有待后續(xù)鑒定耐藥基因后，統(tǒng)計分析其與耐藥表型的相關(guān)性來確定。

4　結(jié)　論

河南、陜西、山西、山東鴨源雞桿菌分離株攜帶1類整合子；鴨源雞桿菌普遍存在多重耐藥性，且1類整合子可能在其多重耐藥性的形成中發(fā)揮一定作用。

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(編輯白永平)

GallibacteriumanatisIntegron and Its Correlation with the Drug Resistance

PENG Zhi-feng#，GAO Dong-sheng#，LIU Hong-ying，YANG Xia，ZHAO Jun，WANG Xin-wei，LI Yong-tao，CHEN Lu，CHANG Hong-tao，WANG Chuan-qing*

(InstituteofPoultryDiseases，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China)

The aim of the present study was to confirm existence of the integrons inGallibacteriumanatis(G.anatis)isolates and the role of integrons in multidrug resistance.The integrons class 1，2 and 3 inG.anatisisolates were detected by PCR amplification for the first time.The sensitivity of 61G.anatisstrains was tested against 13 kinds of antibiotics by Kirby-Bauer method.The correlation between multidrug resistance and integrons was analyzed.The results showed that drug resistance rates of allG.anatisisolates to clindamycin，norfloxacin and streptomycin were above 88.52%.No less than three kinds of drugs were resisted for 19G.anatisstrains which carrying class 1 integron.Among strains resisting more than five kinds of drugs，the proportion of the class 1 integron positive (78.95%) was significantly higher than that(28.57%)of class 1 integron negative strains(P<0.01).It was the first time，to our knowledge，that the distribution of intergons inG.anatishad been investigated. Only class 1 integron was found and multidrug resistance was very common inG.anatisisolates in this study.Class 1 integron might play an important role in the formation of multiple drug resistance phenotype ofG.anatisstrains.

Gallibacteriumanatis；antibiotic resistance；integrons

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.019

2016-01-21

國家自然科學基金(31302090)；河南省高?？萍紕?chuàng)新團隊與支持計劃資助項目(14IRTSHN015)

彭志鋒(1982-)，男，河南周口人，博士生，主要從事動物傳染病發(fā)病機制及防制研究，E-mail:zfpeng2006@126.com；高冬生，男，(1985-)，河南新密人，碩士，主要從事動物傳染病發(fā)病機制及防制研究。#彭志鋒和高冬生同為第一作者

王川慶，男，教授，博導， E-mail:wchuanq@163.com

S852.612

A

0366-6964(2016)08-1676-06