王麗娜，王　珍，彭建龍，王建兵，楊柯林，束　剛，王松波，朱曉彤，高　萍，江青艷

(華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，國家生豬種業(yè)工程技術研究中心，廣州 510642)

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表沒食子兒茶素沒食子酸酯對育肥豬骨骼肌纖維類型的影響

王麗娜，王珍，彭建龍，王建兵，楊柯林，束剛，王松波，朱曉彤，高萍，江青艷*

(華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，國家生豬種業(yè)工程技術研究中心，廣州 510642)

本試驗主要研究在飼糧中添加表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)對育肥豬肌纖維類型的影響。試驗選用156日齡“杜×長×大”三元雜交育肥豬180頭，平均體重為(85.02±1.15) kg，按組間體重、性別比例一致的原則，將育肥豬隨機分成3組，每組6個重復，每個重復10頭豬(5公5母)。對照組飼喂基礎飼糧，試驗組飼喂在基礎飼糧上分別添加0.025%、0.05% EGCG的試驗飼糧。研究結果表明：1)育肥豬飼糧中添加0.025%的EGCG，能顯著下調背最長肌乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)的活性(P<0.05)，減少MyHCⅠ、PGC-1α和mtTFA蛋白水平和MyHCⅠ、Tnnt1、Cytc和COXⅣmRNA的表達(P<0.05)；顯著下調腰大肌LDH和琥珀酸脫氫酶(Succinate dehydrogenase，SDH)的活性(P<0.05)，顯著上調Ⅰ型肌纖維比例(P<0.05)，顯著下調MyHCⅠmRNA的表達(P<0.05)，而MyHCⅡa、MyHCⅡx、MyHCⅡb 的mRNA顯著上調(P<0.05)。2)育肥豬飼糧中添加0.050%的EGCG，能顯著下調背最長肌LDH和SDH的活性(P<0.05)，降低活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平(P<0.05)，抑制AMPK的磷酸化、下調MyHC Ⅰ、PGC-1α、mtTFA和NRF-1的蛋白和mRNA表達(P<0.05)；顯著下調腰大肌LDH和SDH的活性(P<0.05)，降低ROS水平(P<0.05)，下調MyHC Ⅰ蛋白和mRNA的表達、抑制AMPK的磷酸化和NRF-1的蛋白表達(P<0.05)，顯著上調Ⅰ型肌纖維比例(P<0.05)。綜上，育肥豬飼糧中添加EGCG后，可能通過EGCG清除ROS后引起AMPK活性減弱，降低PGC-1α表達，最終導致線粒體生物合成下降和慢肌纖維形成減少。

EGCG；育肥豬；肌纖維類型；線粒體生物合成

隨著生活水平的不斷提高，人們對肉品質的要求也越來越高。肌纖維類型與肉品質密切相關，直接影響肌肉色澤、嫩度和肌內脂肪含量。根據(jù)不同肌纖維中表達的特有肌球蛋白重鏈亞型可以將哺乳動物骨骼肌纖維類型分為Ⅰ型、Ⅱa、Ⅱx和Ⅱb型，前者為慢肌纖維，后三者為快肌纖維。而骨骼肌具有高度可塑性，機體的自然生長發(fā)育或當機體受到某些生理變化、病理刺激和應激等時，細胞內相關信號通路就會發(fā)生改變，調節(jié)肌纖維特異基因的表達從而誘發(fā)肌纖維類型的轉化[1]。已有研究表明，運動可以促進慢肌纖維的形成，且運動可以產(chǎn)生活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，這揭示著ROS的增多可能促進慢肌纖維的形成[2-3]。并有報道ROS主要是通過激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)從而促進過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活子1α(Peroxisome-proliferators-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)的表達[4-5]，而PGC-1α可以促進線粒體生物合成和慢肌形成[6-7]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)，是茶多酚生物活性的主要成份，具有抗氧化清除自由基的功能，在抗癌和心血管疾病中擔當了重要角色，那么EGCG在清除自由基后對肉品質會不會有影響呢。

本試驗采用飼糧中添加EGCG飼喂“杜×長×大”三元雜交育肥豬來研究EGCG對肌纖維類型的影響，為EGCG改變肉品質提供重要的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

試驗所用EGCG純度99%，購自美國Sigma公司；Trizol、M-MLV Reverse Transcriptase、SYBR Green Realtime PCR Master Mix均購自美國Promega公司；RIPA細胞裂解液購自北京百泰克生物技術有限公司；BCA法總蛋白測定試劑盒購自美國Thermo scientific公司；試驗中所用一抗MyHC Ⅰ購自英國Abcam，MyHC Ⅱ購自美國Millipore，AMPKα、p-AMPK、PGC-1α、NRF-1均購自美國Cell signaling technology，mtTFA購自美國Santa Cruz Biotechnology；二抗有羊抗兔、兔抗羊、羊抗鼠抗體，均購自北京博奧森生物技術有限公司；引物合成由美國life technology公司合成。ROS、己糖激酶(Hexokinase，HK)、乳酸脫氫酶(Lactic dehydrogenase，LDH)、琥珀酸脫氫酶(Succinatedehydrogenase，SDH)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2試驗設計

試驗采用單因素完全隨機設計，選用156日齡三元雜交育肥豬180頭，平均體重為(85.02±1.15) kg，按組間體重、性別比例一致的原則，將育肥豬分成3組，每組6個重復，每個重復10頭豬(5公5母)。其中第1組為對照組，飼喂基礎飼糧；第2組為0.025% EGCG組，飼喂每千克基礎飼糧中添加了0.25 g EGCG的試驗飼糧；第3組為0.05% EGCG組，飼喂每千克基礎飼糧中添加了0.5 g EGCG的試驗飼糧。飼喂基礎飼糧3 d后開始試驗，正式試驗期為35 d?；A飼糧組成和營養(yǎng)水平見表1。

1.3試驗管理

試驗豬全期按豬場生產(chǎn)管理規(guī)程進行，保持各試驗組管理與環(huán)境條件一致。按照豬場要求進行常規(guī)防疫，飼養(yǎng)欄舍為封閉、漏縫地板式豬舍。試驗期間記錄投料量，觀察豬只健康。每個重復10頭育肥豬飼養(yǎng)于同一欄中，每天定時喂料，自由采食及飲水。

表1基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

Table 1Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

%

1).每千克預混料含有：VA 5 300 IU，VD 1 500 IU，VE 24 mg，VK 1.16 mg，VB11.16 mg，泛酸5.6 mg，煙酸11.6 mg，VB61.68 mg，葉酸0.56 mg，生物素0.15 mg，VC 200 mg，膽堿600 mg，Mn 20 mg，Zn 52 mg，F(xiàn)e 56 mg，Cu 36 mg，I 0.36 mg，Se 0.2 mg。2).消化能為計算值，其余均為實測值

1).Contained the following per kg of premix：VA 5 300 IU，VD 1 500 IU，VE 24 mg，VK 1.16 mg，VB11.16 mg，pantothenic acid 5.6 mg，nicotinic acid 11.6 mg，VB61.68 mg，folic acid 0.56 mg，biotin 0.15 mg，VC 200 mg，choline 600 mg，Mn 20 mg，Zn 52 mg，F(xiàn)e 56 mg，Cu 36 mg，I 0.36 mg，Se 0.2 mg.2).DE was a calculated value，while the others were measured values

1.4檢測指標

1.4.1樣品采集試驗結束，在每個重復中挑選1或者2個接近每組平均體重的個體頸靜脈放血處死。固定部位采集背最長肌和腰大肌的肌肉樣品，-80 ℃保存，用于組織切片ATPase染色、基因mRNA和蛋白表達水平檢測、活性氧(ROS)水平和酶活性測定。

1.4.2ROS水平及糖代謝相關酶活性的測定背最長肌和腰大肌中ROS水平及己糖激酶、乳酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶的活性檢測按南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書，在多功能酶標儀上進行測定。

1.4.3肌纖維分型(ATPase染色)將在-80 ℃保存的肌肉樣品先置于冰凍切片的恒溫箱內(-20 ℃)平衡，待樣品溫度平衡至-20 ℃時，垂直于肌纖維走向將組織塊修成1 cm × 1 cm × 0.5 cm的整齊樣品塊。用包埋劑將組織塊粘貼于組織樣品冷凍頭(切面與纖維走向垂直)，按照10 μm的厚度切片。制備好的切片分別經(jīng)過酸性和堿性預孵后，依次進行SDH和ATP孵育，最后經(jīng)CoCl2置換后用硫化銨顯色，蘇木精復染后脫水封片。

分型后的切片在40倍鏡下拍照，每張切片4個視野。采用Motic Images Advanced 3.2軟件分別計算MyHC Ⅰ、MyHC Ⅱa和MyHC Ⅱb型肌纖維數(shù)量的相對百分比。

1.4.4qPCR檢測采用Trizol法提取背最長肌和腰大肌的總RNA，采用M-MLV及隨機引物反轉錄成cDNA，用于后續(xù)的實時熒光定量PCR(Real-time qPCR)檢測并計算各基因mRNA表達豐度。具體反轉錄和Real-time qPCR的步驟：

反轉錄：2 μg消化后總RNA、3.0 μL 5 μmol·L-1的Oligo d(T)-18，加入DEPC水至15.0 μL，70 ℃預變性5 min，迅速取出并立即冰浴5 min。分別加入5.0 μL 5×Buffer、1.0 μL 200 U·mL-1M-MLV反轉錄酶、0.625 μL 40 U·μL-1Ribonuclease inhibitor、1.25 μL 10 mmol·L-1dNTP，加入DEPC水至25.0 μL；42 ℃反應60 min，70 ℃ 10 min。

Real-time qPCR：根據(jù)NCBI中GenBank發(fā)表的基因序列，采用Primer Primier 5.0軟件設計各基因的上、下游引物(表2)。反應體系：1.0 μL 反轉錄產(chǎn)物、0.8 μL 5 μmol·L-1引物、10.0 μL 2×SYBR Green I Mix，加入去離子水至20.0 μL。反應條件：94 ℃ 預變性1 min；94 ℃ 15 s，53～62 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s，40個循環(huán)。獲得各基因Ct值，以GAPDH為內參，采用2-△Ct法計算樣品中各基因mRNA表達豐度。

表2基因引物序列

Table 2Primer sequences of the target genes

序列號GenBankNo.基因Gene引物序列(5'-3')Primersequence產(chǎn)物大小/bpProductsize退火溫度/℃AnnealingtemperatureNM_213855MyHCⅠSense:AAGGGCTTGAACGAGGAGTAGAAntisens:TTATTCTGCTTCCTCCAAAGGG11458NM_214136MyHCⅡaSense:GCTGAGCGAGCTGAAATCCAntisense:ACTGAGACACCAGAGCTTCT13758NM_001104951MyHCⅡxSense:AGAAGATCAACTGAGTGAACTAntisense:AGAGCTGAGAAACTAACGTG14955NM_001123141MyHCⅡbSense:ATGAAGAGGAACCACATTAAntisense:TTATTGCCTCAGTAGCTTG16652NM_213963PGC-1αSense:GTCCTTCCTCCATGCCTGACAntisense:TGGTTTGCATGGTTCTGGGT14560AY923074mtTFASense:GGTCCATCACAGGTAAAGCTGAAAntisense:ATAAGATCGTTTCGCCCAACTTC16754AY496013NRF-1Sense:TCCCTGGTGGTTCAGTAAGTAntisense:CAGAACAAGTAAGGGAGGACA26858BC049623COXⅣSense:CCAAGTGGGACTACGACAAGAACAntisense:CCTGCTCGTTTATTAGCACTGG13155NM_001129970CytcSense:CGACTCGTCCAAACCTCCAAntisense:CTTCGCTTTCTCCCTTCTTCTTA19858NM_213748Tnnt1Sense:ACAGGGCGTGAGATGAAACAntisense:GTGGCTGATGCGGTTGTA20458NM_001001863Tnnt3Sense:CCCAAACTCACTGCTCCTAAGAntisense:AACTCTGCTGCTCGGCTCT20558AF043486GAPDHSense:ATTCCACGGCACAGTCAAntisense:GGACTCCACGACATACTCAG13058

1.4.5Western Blot檢測根據(jù)RIPA裂解組織樣品的說明書裂解背最長肌和腰大肌肌肉樣品，提取出總蛋白，并按BCA試劑盒說明書進行蛋白濃度測定，按20 μg單管分裝樣品，用于Western Blot的檢測。使用5%濃縮膠和10%分離膠90 V電壓電泳分離上述制備好的蛋白樣品100 min，隨后110 V電壓將蛋白轉移至PVDF膜上，目的條帶用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，之后按照如下稀釋比例用TBST稀釋一抗，將膜在相應的一抗稀釋液中4 ℃過夜孵育：MyHC Ⅰ(1∶2 000)、MyHC Ⅱ(1∶2 000)、PGC-1α(1∶2 000)、NRF-1(1∶2 000)、mtTFA(1∶500)、AMPKα(1∶2 000)、p-AMPK(1∶2 000)，接著用TBST洗5次，一次3～5 min，使用對應的二抗孵育1～2 h，并在多色熒光成像系統(tǒng)掃描拍照，最后使用蛋白灰度分析軟件掃描灰度，統(tǒng)計各目的蛋白的表達結果。

1.4.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析采用 SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，應用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行差異顯著性分析，采用LSD法進行多重比較，結果以“平均值±標準誤(Mean±S.E.)”表示。

2　結　果

2.1飼糧中添加EGCG對育肥豬背最長肌和腰大肌ROS水平的影響

由圖1可知，與對照組相比，0.05% EGCG組的背最長肌和腰大肌中的ROS水平均顯著降低(P<0.05)，而0.025% EGCG組的背最長肌和腰大肌中的ROS水平均無顯著變化(P>0.05)。

2.2飼糧中添加EGCG對育肥豬背最長肌和腰大肌糖代謝相關酶活的影響

由圖2A、2B、2C可知，與對照組相比，0.05% EGCG組的背最長肌琥珀酸脫氫酶和乳酸脫氫酶的活性顯著降低(P<0.05)。0.025% EGCG組中，乳酸脫氫酶活性也顯著降低(P<0.05)，而己糖激酶活性無顯著變化(P>0.05)。從圖2D、2E、2F可知，0.025% EGCG組和0.05% EGCG組的腰大肌琥珀酸脫氫酶和乳酸脫氫酶的活性顯著降低(P<0.05)，而己糖激酶活性無顯著變化(P>0.05)。

2.3飼糧中添加EGCG對背最長肌和腰大肌肌纖維類型的影響

由圖3可知，與對照組相比，0.025% EGCG組和0.05% EGCG組背最長肌中肌纖維分型均無顯著變化(P>0.05)。而在0.025% EGCG組和0.05% EGCG組腰大肌中Ⅰ型肌纖維比例均顯著高于對照組(P<0.05)，而腰大肌中Ⅱa和Ⅱb型肌纖維的比例在3組中均無顯著差異(P>0.05)。

A和B分別為背最長肌和腰大肌的ROS水平，無相同字母代表組間差異顯著(P<0.05)A and B are the level of ROS in longissimus dorsi and psoas major，respectively，columns not sharing common letter are significantly different (P<0.05)圖1　EGCG對育肥豬背最長肌和腰大肌ROS水平的影響(n=8)Fig.1　Effect of EGCG on the level of ROS in longissimus dorsi and psoas major in pigs (n=8)

A、B、C.背最長肌中HK、LDH和SDH的酶活性；D、E、F.腰大肌中HK、LDH和SDH的酶活性。無相同字母代表組間差異顯著(P<0.05)A,B,C.The activity of HK，LDH and SDH in longissimus dorsi；D,E,F.The activity of HK，LDH and SDH in psoas major.Columns not sharing common letter are significantly different (P<0.05)圖2　EGCG對育肥豬背最長肌和腰大肌糖代謝相關酶活的影響(n=8)Fig.2　Effect of EGCG on glycometabolism related enzyme activity in longissimus dorsi and psoas major in pigs (n=8)

A.背最長肌和腰大肌的ATP酶染色圖(400×)；B.背最長肌和腰大肌的肌纖維類型切片染色統(tǒng)計圖。無相同字母代表組間差異顯著(P<0.05)A.The ATPase staining of longissimus dorsi and psoas major(400×)；B.The statistics of muscle fiber types in longissimus dorsi and psoas major.Columns not sharing common letter are significantly different (P<0.05)圖3　EGCG對育肥豬背最長肌和腰大肌肌纖維類型分布的影響(n=4)Fig.3　Effect of EGCG on muscle fiber types distribution of longissimus dorsi and psoas major in pigs (n=4)

由圖4A可知，與對照組相比，0.025% EGCG組和0.050% EGCG組的背最長肌MyHC Ⅰ的蛋白表達均顯著降低(P<0.05)，而MyHC Ⅱ的蛋白表達無顯著差異(P>0.05)。由圖4B可知，與對照組相比，0.05% EGCG組背最長肌中MyHCⅠ、MyHCⅡb和Tnnt1的mRNA表達均顯著降低(P<0.05)，且MyHCⅠ和Tnnt1在0.025% EGCG組mRNA表達也顯著降低(P<0.05)。而飼糧中添加EGCG對背最長肌中MyHCⅡa、MyHCⅡx和Tnnt3的表達均無顯著影響(P>0.05)。 由圖4C可知，與對照組相比，0.050% EGCG組腰大肌中MyHC Ⅰ的蛋白表達顯著降低(P<0.05)，而0.025% EGCG組MyHC Ⅰ的蛋白表達無顯著變化(P>0.05)，各組MyHC Ⅱ的蛋白水平無顯著差異(P>0.05)。

由圖4D可知，與對照組相比，0.025% EGCG組和0.050% EGCG組腰大肌中MyHCⅠ的mRNA表達顯著降低(P<0.05)，0.025% EGCG組腰大肌中MyHCⅡa、MyHCⅡx和MyHCⅡb 的mRNA表達均顯著升高(P<0.05)；而飼糧中添加EGCG對腰大肌中Tnnt1和Tnnt3的表達均無顯著影響(P>0.05)。

2.4飼糧中添加EGCG對育肥豬背最長肌和腰大肌線粒體合成相關基因的影響

由圖5A可知，0.05% EGCG組背最長肌中pAMPK/AMPK、mtTFA、PGC-1α和NRF-1的蛋白表達均顯著降低(P<0.05)，而0.025% EGCG組背最長肌中只有PGC-1α和mtTFA的蛋白表達顯著降低(P<0.05)。 由圖5B可知，與對照組相比，只有0.050% EGCG組腰大肌中pAMPK/AMPK和NRF-1的蛋白表達顯著降低(P<0.05)。而飼糧中添加EGCG對腰大肌中PGC-1α和mtTFA的蛋白表達均無顯著影響(P>0.05)。由圖5C可知，與對照組相比，0.050% EGCG組背最長肌中PGC-1α、mtTFA、NRF-1、Cytc和COXⅣ的mRNA表達均顯著降低(P<0.05)，且Cytc和COXⅣ在0.025% EGCG組背最長肌中mRNA表達也顯著降低(P<0.05)。由圖5D可知，與對照組相比，0.050% EGCG組腰大肌中Cytc和COXⅣ的mRNA表達顯著降低(P<0.05)，0.025% EGCG組腰大肌中Cytc和COXⅣ的mRNA表達無顯著差異(P>0.05)。而飼糧中添加 EGCG對腰大肌中PGC-1α、mtTFA和NRF-1的表達均無顯著影響(P>0.05)。

A.背最長肌中MyHC Ⅰ和MyHC Ⅱ的蛋白條帶圖和蛋白統(tǒng)計圖；B.背最長肌中MyHC Ⅰ、MyHC Ⅱa、MyHC Ⅱx、MyHC Ⅱb、Tnnt 1、Tnnt 3的mRNA表達統(tǒng)計圖；C.腰大肌中MyHC Ⅰ和MyHC Ⅱ的蛋白條帶圖和蛋白統(tǒng)計圖；D.腰大肌MyHC Ⅰ、MyHC Ⅱa、MyHC Ⅱx、MyHC Ⅱb、Tnnt1、Tnnt3的mRNA表達統(tǒng)計圖。無相同字母代表組間差異顯著(P<0.05)A.The protein expression of MyHC Ⅰ and MyHC Ⅱ in longissimus dorsi；B.The mRNA expression of MyHC Ⅰ，MyHC Ⅱa，MyHC Ⅱx，MyHC Ⅱb，Tnnt 1 and Tnnt 3 in longissimus dorsi；C.The protein expression of MyHC Ⅰ and MyHC Ⅱ in psoas major；D.The mRNA expression of MyHC Ⅰ，MyHC Ⅱa，MyHC Ⅱx，MyHC Ⅱb，Tnnt 1 and Tnnt 3 in psoas major.Columns not sharing common letter are significantly different (P<0.05)圖4　EGCG對育肥豬背最長肌和腰大肌肌纖維分型的影響(n=4)Fig.4　Effect of EGCG on muscle fiber types of longissimus dorsi and psoas major in pigs (n=4)

A.背最長肌中p-AMPK、AMPK、PGC-1α、mtTFA和NRF-1的蛋白條帶圖和蛋白表達統(tǒng)計圖；B.腰大肌中p-AMPK、AMPK、PGC-1α、mtTFA和NRF-1的蛋白條帶圖和蛋白表達統(tǒng)計圖；C.背最長肌中PGC-1α、mtTFA、NRF-1、Cytc和COXⅣ的mRNA表達統(tǒng)計圖；D.腰大肌中PGC-1α、mtTFA、NRF-1、Cytc和COXⅣ的mRNA表達統(tǒng)計圖。無相同字母代表組間差異顯著(P<0.05)A.The protein expression of p-AMPK，AMPK，PGC-1α，mtTFA and NRF-1 in longissimus dorsi；B.The protein expression of p-AMPK，AMPK，PGC-1α，mtTFA and NRF-1 in psoas major；C.The mRNA expression of PGC-1α，mtTFA，NRF-1，Cytc and COXⅣ in longissimus dorsi；D.The mRNA expression of PGC-1α，mtTFA， NRF-1，Cytc and COXⅣ in psoas major.Columns not sharing common letter are significantly different (P<0.05)圖5　EGCG對育肥豬背最長肌和腰大肌線粒體生物合成相關基因表達的影響(n=4)Fig.5　Effect of EGCG on the mitochondrial biosynthesis related gene expression in longissimus dorsi and psoas major in pigs (n=4)

3　討　論

3.1飼糧中添加EGCG對育肥豬背最長肌和腰大肌中ROS水平的影響

活性氧(ROS)是生物體有氧代謝過程中的一種副產(chǎn)物，包括氧離子、過氧化物和含氧自由基等。過高的ROS水平會對細胞和基因結構造成損壞[8-9]。然而最近的研究發(fā)現(xiàn)了生理濃度下的ROS在正常細胞的功能中起著一個重要的作用。事實上，ROS能通過細胞信號傳導來調節(jié)細胞的生長、分化、增殖和凋亡[9-12]。已有研究表明，運動可以促進慢肌纖維的形成，且運動可以產(chǎn)生活性氧(ROS)，這揭示著ROS的增多可能促進慢肌纖維的形成[2-3]。而EGCG是一種抗氧化物，能夠清除ROS。本試驗中飼糧添加0.05% EGCG后，能顯著降低育肥豬背最長肌和腰大肌的ROS水平，這與EGCG清除ROS的功能是一致的，也為EGCG逆轉ROS的功能提供了可能。

3.2飼糧中添加EGCG對育肥豬背最長肌和腰大肌糖代謝相關酶活的影響

根據(jù)肌纖維所含的酶系、肌纖維的代謝特性及其活性特點，可將其分為酵解型、中間型、氧化型肌纖維。其中Ⅱb型纖維幾乎完全以糖酵解為主，而Ⅱa型纖維既可以由糖酵解供能，也可以通過糖的有氧氧化供能，Ⅱx型纖維是介于Ⅱb和Ⅱa之間的一種纖維類型，其收縮能力和ATP酶活性也介于Ⅱb和Ⅱa之間。Ⅰ型纖維則是氧化型肌纖維，通過有氧氧化供能。因此，不同類型的肌纖維所含的酶及活力是不同的。己糖激酶(HK)是糖酵解的第一個步驟中重要的酶。乳酸脫氫酶(LDH)是一種糖酵解酶，催化丙酮酸生成乳酸的酶，它的活力能夠反映無氧酵解的程度。琥珀酸脫氫酶(SDH)是線粒體的一種標志酶，由黃素蛋白、鐵硫蛋白和2種膜蛋白亞單位組成，是唯一的同時參與三羧酸循環(huán)和電子傳遞鏈的有氧氧化酶[13]。有研究表明，EGCG能夠減少琥珀酸脫氫酶黃素蛋白亞單位的表達[14]。此外眾多的研究表明抗氧化劑能夠抑制LDH的活性：給大鼠灌服抗氧化劑茶多酚，能夠顯著下調力竭運動后大鼠血清LDH活性[15]；給大鼠飼喂有抗氧化作用的黃芪總苷也能夠降低運動后骨骼肌中的乳酸水平[16]。也有文獻證明，用H2O2處理山羊骨骼肌細胞，能夠上調細胞內的LDH活性[17]。這與本試驗中添加不同濃度的ROS清除劑EGCG在不同程度上抑制背最長肌和腰大肌LDH和SDH的活性(P<0.05)的結果一致。綜合以上結果，飼糧中添加EGCG能夠降低糖酵解酶酶活，同時也降低有氧氧化酶酶活。

3.3飼糧中添加EGCG對育肥豬背最長肌和腰大肌肌纖維類型的影響

以往有報道證明，ROS可以調控心肌細胞中β-MyHC的表達[18]，但對骨骼肌細胞中各種類型的MyHC的表達是否有調控作用并未見報道。本研究采用ATP酶染色、qPCR和Western Blot的方法從代謝和MyHC基因表達的角度探討了EGCG對骨骼肌肌纖維類型的影響。ATPase染色結果表明，飼糧中添加0.025%、0.050%的EGCG僅能顯著提高腰大?、裥图±w維的比例(P<0.05)。然而，從背最長肌肌球蛋白重鏈(Myosin heavy chain，MyHC)蛋白及mRNA表達結果表明，飼糧中添加0.025%、0.05%的EGCG能顯著降低背最長肌MyHC Ⅰ的表達(P<0.05)，同時慢骨骼肌肌鈣蛋白(Troponin T type 1，Tnnt1)mRNA表達也顯著降低(P<0.05)。飼糧中添加0.050%的EGCG能顯著降低MyHC Ⅰ蛋白及mRNA表達(P<0.05)，但對MyHC Ⅱ蛋白表達無顯著影響(P>0.05)。以上ATP酶染色結果與MyHC基因表達不一致，可能與檢測的方法有關。ATP酶染色的方法得出的是單位面積各種類型肌纖維所占的比例，其結果受到肌纖維數(shù)目和肌纖維直徑的影響，處理組Ⅰ型纖維比例的上調也可能是肌纖維直徑較大，導致單位面積Ⅰ型纖維比例上調。而MyHC蛋白表達的結果與mRNA定量結果一致。綜合以上結果，我們認為飼糧中添加EGCG主要減少Ⅰ型肌纖維的含量，而對Ⅱ型肌纖維的影響較小，同時，飼糧添加EGCG對背最長肌肌纖維類型的影響大于腰大肌。

3.4飼糧中添加EGCG對育肥豬背最長肌和腰大肌肌纖維類型影響的機制

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，是肌肉能量代謝的主要調節(jié)物，被稱為“細胞能量調節(jié)器”[19]。過氧化物酶體增殖物激活受體PPARγ輔激活物1α(PGC-1α)是一種轉錄輔激活物，調節(jié)線粒體基因表達的關鍵因子。PGC-1α的過表達可以提高MyHC Ⅰ的表達[5]，PGC-1α的基因敲除可以促使Ⅱa型纖維向Ⅱx和Ⅱb轉化[20]。AMPK的激活或抑制，可以影響PGC-1α的表達[21]，也可以影響MyHC基因表達和肌纖維類型特性[22]。AMPK被激活，PGC-1α的表達升高，MyHC的表達也升高。反之AMPK被抑制時，PGC-1α和MyHC的表達降低。已有研究報道，ROS能促進AMPK活性增強和PGC-1α表達升高[4]。而本研究已證明在育肥豬飼糧中添加0.05%EGCG能夠顯著下調肌肉中ROS水平。同時，蛋白定量結果表明背最長肌和腰大肌中AMPKα的活性也被顯著抑制(P<0.05)，背最長肌中PGC-1α的表達顯著下調(P<0.05)。綜上，飼糧中添加EGCG可能通過清除ROS從而降低AMPKα的活性，并降低PGC-1α的表達，進而調控MyHC的表達，影響肌纖維類型。

此外，PGC-1α也可以通過誘導核呼吸因子1(Nuclear respiratory factor 1，NRF-1)的表達，從而促進線粒體的生物合成和氧化代謝[7]。而NRF-1能夠提高線粒體轉錄因子A(Mitochondrial transcription factor a，mtTFA)的表達，mtTFA是調控線粒體DNA合成的一種蛋白[23]。細胞色素c(Cytochrome c，Cytc)是有氧氧化過程中的電子傳遞體，線粒體細胞色素c氧化酶(Cytochrome c oxidase，COXⅣ)是與線粒體電子傳遞相關的一種酶。在人的骨骼肌細胞中，過表達PGC-1α增加了COXⅣ和mtTFA的mRNA及蛋白表達[24]。也有一些研究報道，ROS可能通過升高NRF-1、mtTFA和PGC-1α的表達來影響線粒體生物合成[25-27]。本試驗也得到類似的結果，飼糧中添加EGCG能在不同程度上抑制背最長肌和腰大肌mtTFA、NRF-1和COXⅣ的表達(P<0.05)。綜上，飼糧添加EGCG時，與線粒體的生物合成有關的蛋白mtTFA、 NRF-1和COXⅣ表達都減少了，這與前面糖代謝酶活結果一致。

4　結　論

育肥豬飼糧中添加EGCG后，能夠在不同程度上降低肌肉中乳酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶活性，降低慢肌相關基因的表達，可能是通過清除肌細胞內ROS，抑制AMPK活性，從而抑制PGC-1α表達，導致線粒體生物合成下降和慢肌纖維形成減少。

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(編輯郭云雁)

Effects of EGCG on Muscle Fiber Types of Finishing Pigs

WANG Li-na，WANG Zhen，PENG Jian-long，WANG Jian-bing，YANG Ke-lin，SHU Gang，WANG Song-bo，ZHU Xiao-tong，GAO Ping，JIANG Qing-yan*

(NationalEngineeringResearchCenterForBreedingSwineIndustry，CollegeofAnimalScience，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China)

The aim of this study was to investigate the effects of Epigallocatechin Gallate (EGCG) on muscle fiber types of finishing pigs.One-hundred eighty crossbred finishing pigs (Duroc × Yorkshire × Landrace，156-day-old) with an average body weight of (85.02 ± 1.15) kg were selected for this study.According to the consistent principle of weight and sex ratio between groups，pigs were randomly divided into 3 groups，and each group with 6 repeats (10 pigs/repeat(5 male，5 female)).Control group was fed with basal diet，treatment groups were fed with basal diet supplemented with 0.025% and 0.05% EGCG，respectively.The results showed that：1) 0.025% EGCG could significantly decrease the activity of LDH，the protein level of MyHCⅠ，PGC-1α，mtTFA and mRNA expression ofMyHCⅠ，Tnnt1，CytcandCOXⅣ in pigslongissimusdorsi(P<0.05)；inpsoasmajormuscle，the activity of LDH and SDH and mRNA expression ofMyHCⅠwas reduced，the proportion of typeⅠmuscle fiber and mRNA expression ofMyHCⅡa，MyHCⅡx，MyHCⅡb were upregulated (P<0.05).2) Inlongissimusdorsi，0.05% EGCG treatment could significantly decrease the activity of LDH and SDH (P<0.05)，the level of ROS (P<0.05)，and activity of AMPK，the level of protein and mRNA expression of MyHCⅠ，PGC-1α，mtTFA and NRF-1 (P<0.05).While，inpsoasmajormuscle，0.050% EGCG treatment reduced the activity of LDH and SDH (P<0.05)，the level of ROS (P<0.05)，and the protein level and mRNA expression of MyHCⅠ，inhibited the phosphorylation of AMPK and protein expression of NRF-1 (P<0.05)，but the proportion of typeⅠmuscle fiber was upregulated.In conclusion，the effect of EGCG onlongissimusdorsiandpsoasmajorof pigs might be completed by reducing ROS level，thus decreasing the AMPK activity and the expression of PGC-1α，eventually reducing the formation of slow-twitch muscle fibers and mitochondria biosynthesis.

EGCG；finishing pigs；muscle fiber types；mitochondria biosynthesis

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.008

2015-09-06

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(2012CB124701)；國家自然科學基金青年基金(31101780)；博士點基金新教師類(20114404120001)

王麗娜(1982)，女，山西太谷人，講師，碩士生導師，主要從事動物營養(yǎng)生理研究，E-mail：wanglina@scau.edu.cn

江青艷，教授，博士生導師，E-mail：qyjiang@scau.edu.cn

S828；S821.2

A

0366-6964(2016)08-1581-11