郭　穎，田芝瑜，符　航，孫　黎，劉　芳，羅　強(qiáng)，張林西（河北北方學(xué)院.病理學(xué)教研室、.臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)0級學(xué)生、.醫(yī)學(xué)影像專業(yè)0級學(xué)生、.生命科學(xué)研究中心，河北張家口　075000）

青蒿琥酯誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡與Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)系研究

郭穎1，田芝瑜2，符航3，孫黎4，劉芳4，羅強(qiáng)4，張林西4
（河北北方學(xué)院1.病理學(xué)教研室、2.臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2013級學(xué)生、
3.醫(yī)學(xué)影像專業(yè)2012級學(xué)生、4.生命科學(xué)研究中心，河北張家口075000）

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-4-26 11：06網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160426.1106.044.html

目的研究青蒿琥酯（ART）對人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞增殖的影響和可能的分子機(jī)制。方法采用噻唑藍(lán)實(shí)驗(yàn)（MTT）檢測ART對Lovo細(xì)胞的增殖抑制作用，用流式細(xì)胞術(shù)和電鏡檢測ART對細(xì)胞凋亡的影響，熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒檢測ART對Wnt/β-catenin通路中TCF4/LEF轉(zhuǎn)錄活性的影響，Western blot檢測 ART對細(xì)胞內(nèi)β-catenin、GSK-3β、c-Myc以及凋亡相關(guān)蛋白caspase-3表達(dá)的影響。結(jié)果與對照組相比，ART能抑制Lovo細(xì)胞增殖，72 h、320 μmol·LART的細(xì)胞抑制率高達(dá)（78.99±1.95）%（F=898.301，P =0.000）。ART能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，24 h、160 μmol·L-1ART的細(xì)胞早期凋亡率達(dá)到（19.00±0.05）%，同時(shí)電鏡觀察到細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。ART能降低TCF4/LEF報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性，24 h、160 μmol·L-1ART可使TCF4/LEF報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性降至（0.36±0.30）%（F= 470.954，P＜0.01）；ART處理48 h后，GSK-3β和caspase-3呈濃度依賴性升高（P＜0.01），而β-catenin和c-Myc蛋白水平呈藥物濃度依賴性降低（P＜0.01）。結(jié)論青蒿琥酯能明顯抑制結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡，可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路活化有關(guān)。

青蒿琥酯；結(jié)腸癌細(xì)胞；增殖；凋亡；Wnt/β-catenin通路；TCF4/LEF

青蒿素作為抗瘧藥之一，是從植物青蒿中提取的有過氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯藥物。我國著名科學(xué)家屠呦呦也因此獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，并在頒獎(jiǎng)禮上告訴全世界“青蒿素是傳統(tǒng)中醫(yī)給世界的禮物”。而青蒿琥酯（artesunate，ART）作為青蒿素的衍生物之一，已在臨床普遍應(yīng)用于抗瘧治療，其藥理作用較為安全穩(wěn)定。國內(nèi)外報(bào)道青蒿琥酯對多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用，但對結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用機(jī)制尚未明確［1］。而阻斷結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號通路的活化，能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡［2］。對于青蒿琥酯誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡是否通過Wnt/β-catenin信號通路，目前尚不明確。本研究將針對細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵因子β-catenin、GSK-3β、TCF4/LEF及靶基因c-Myc為研究方向，探索青蒿琥酯誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制。

1　材料與方法

1.1試劑與細(xì)胞培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞Lovo購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源中心。青蒿琥酯購自桂林南藥股份有限公司（批號H10930195）。Annexin V/PI凋亡試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司，蛋白提取和BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，所有抗體和ECL發(fā)光試劑盒均購自Santa Cruz Biotechnology公司，熒光素酶報(bào)告基因試劑盒購自New England Biolabs（Beijing）公司。Lovo細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基（購自Sigma Aldrich公司），在5%CO2、37℃溫箱中培養(yǎng)。

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組分為對照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組用 ART處理，設(shè)立20、40、80、160、240、320 μmol·L-16個(gè)濃度梯度；對照組的處理是相同體積的DMSO。

1.3MTT法評估細(xì)胞增殖將細(xì)胞按1×104密度種于96孔板，用不同濃度ART（20、40、80、160、240、320 μmol·L-1）處理，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，分別處理24、48、72 h后，加入MTT染液，4 h后棄上清，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）100 μL，溫箱放置15 min，用酶標(biāo)儀檢測570 nm波長處的OD值。細(xì)胞增殖抑制率/%=（1-實(shí)驗(yàn)孔OD值/對照孔OD值）×100%。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡處于對數(shù)生長期的細(xì)胞待貼壁后，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入不同濃度ART （20、80、160 μmol·L-1），24 h后收集細(xì)胞，先用預(yù)冷PBS清洗2遍，然后分別滴加Annexin-V FITC和PI處理細(xì)胞（按試劑盒說明進(jìn)行），最后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡檢測。

1.5透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及凋亡情況將不同濃度藥物作用細(xì)胞48 h，PBS沖洗后，用2.5%戊二醛、1%鋨酸固定細(xì)胞，常規(guī)制作透射電鏡樣本，觀察各組細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)變化。

1.6熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒檢測Wnt通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的變化將處于對數(shù)生長狀態(tài)的細(xì)胞鋪于T25培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后，用Lipofectamine轉(zhuǎn)染LEF/TCF4報(bào)告質(zhì)粒（pTOP-Luc）3 μg，4 h后換液。12 h后將細(xì)胞消化并重新種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入不同濃度ART（20、80、160 μmol· L-1）進(jìn)行處理。24 h后，裂解細(xì)胞，收集裂解液，并按試劑盒操作說明進(jìn)行熒光素酶活性測定。用BCA法測定總蛋白濃度，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.7Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白及Wnt通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)將對數(shù)生長期的細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入不同濃度ART（20、80、160 μmol·L-1）進(jìn)行處理，藥物作用48 h后，提取各組蛋白。采用8%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、二抗、洗膜、顯影、定影、成像，上機(jī)檢測，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2　結(jié)果

2.1ART對Lovo細(xì)胞增殖的影響經(jīng)20、40、80、160、240、320 μmol·L-1青蒿琥酯處理Lovo細(xì)胞24、48、72 h后增殖抑制率比較，不同濃度間存在差別（F=464.922，P=0.000），兩兩比較采用Bonferroni法，240、320 μmol·L-1組差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.191），其余任兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同時(shí)相的抑制率也存在差別（F= 543.781，P=0.000）；不同濃度與不同時(shí)間的抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.675，P=0.000），說明在不同濃度下不同時(shí)間變化的趨勢不同，提示ART能抑制Lovo細(xì)胞增殖，并在一定范圍內(nèi)呈時(shí)間和劑量依賴性（Fig 1）。

2.2ART對Lovo細(xì)胞凋亡的影響用ART按不同濃度（20、80、160 μmol·L-1）處理Lovo細(xì)胞24 h后，流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，細(xì)胞早期凋亡率隨藥物濃度增加而增加（Fig 2A）；電鏡結(jié)果顯示，藥物處理組Lovo細(xì)胞染色質(zhì)濃縮于核膜下，呈新月形、胞質(zhì)空泡化，甚至出現(xiàn)凋亡小體等凋亡特征，提示ART能促進(jìn)Lovo細(xì)胞凋亡（Fig 2B）。

2.3ART對Lovo細(xì)胞TCF4/LEF報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄活性的影響與陰性對照組（1.00±0.00）比較，20、80、160 μmol·L-1青蒿琥酯組TCF4/LEF活性（0.75±0.26）%、（0.53±0.15）%、（0.36± 0.30）%，呈逐漸降低的趨勢，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=470.954，P＜0.01）。青蒿琥酯可明顯抑制TCF4/LEF報(bào)告質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性，且隨藥物濃度升高，其抑制作用也依賴性增加，表明青蒿琥酯可明顯抑制Wnt/β-catenin通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

Fig 1　Proliferation inhibitory effect of artesunate on Lovo cells

2.4ART對凋亡關(guān)鍵蛋白caspase-3及通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，ART（20、80、160 μmol·L-1）作用48 h后，與陰性對照組比較，caspase-3由（0.63±0.07）上調(diào)至（1.07±0.04）（F=178.884，P＜0.01），GSK-3β（0.72±0.02）上調(diào)至（1.29±0.02）（F=674.568，P＜0.01），而βcatenin由（0.90±0.06）下調(diào)至（0.44±0.04）（F= 89.619，P＜0.01），c-Myc由（0.64±0.12）下調(diào)至（0.35±0.02）（F=57.240，P＜0.01）（Fig 3）。提示ART誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能與抑制Lovo細(xì)胞Wnt/βcatenin通路有關(guān)。

3　討論

結(jié)腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，2012年全球約有14萬結(jié)腸癌新發(fā)病例，占所有惡性腫瘤的10%［3］，死亡率占世界惡性腫瘤第4位［4］。雖然目前對結(jié)腸癌的診斷和治療技術(shù)有了較大提高，但結(jié)腸癌的預(yù)后仍不容樂觀。而傳統(tǒng)植物來源的藥物在治療各種腫瘤中發(fā)揮著重要作用［5］。

青蒿素（artmisinin）是我國科學(xué)家屠呦呦在1971年首次從菊科植物黃花蒿（Aremisia annua Linn）提取的新型結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯化合物。它不僅是一種高效、低毒的抗瘧藥物，同時(shí)也具有抗腫瘤、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等應(yīng)用價(jià)值［6］。ART是青蒿素的衍生物之一，已有報(bào)道ART等青蒿素衍生物能對70余種腫瘤細(xì)胞有抑制作用［7-8］。結(jié)合ART毒副作用低、不產(chǎn)生交叉耐藥等特點(diǎn)，與其他化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，有望在腫瘤治療中提高化療藥物的療效［9］。本研究表明，ART對人Lovo細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，且能誘導(dǎo)Lovo細(xì)胞早期凋亡，電鏡結(jié)果顯示經(jīng)ART處理48 h后的Lovo細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡典型變化，而誘導(dǎo)凋亡可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。

Fig 2　Effects of artesunate on apoptosis in Lovo cells

Fig 3　Effects of artesunate on different kinds of proteins in Lovo cells after 48 h

Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵的正性調(diào)控因子是β-catenin（β-cat），在生理狀態(tài)下主要在細(xì)胞膜上表達(dá)，介導(dǎo)同型細(xì)胞之間的黏連。磷酸化肌醇3激酶β（glycogen synthase 3 kinase-β，GSK3β）是Wnt信號通路的重要負(fù)性調(diào)控因子，與胞質(zhì)內(nèi)Axin、APC等結(jié)合成“破壞復(fù)合體”（destruction complex），與βcat結(jié)合，并促進(jìn)其磷酸化，使β-cat很快被蛋白酶體降解，維持細(xì)胞內(nèi)β-cat的低水平狀態(tài)。腫瘤細(xì)胞內(nèi)Wnt信號通路被異常激活，致β-cat不能及時(shí)降解，而由胞膜向胞質(zhì)、胞核轉(zhuǎn)移，激活下游靶基因c-Myc、Cyclin D1、MMP-7等，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［10-11］。有研究發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素可通過Wnt信號通路抑制骨肉瘤細(xì)胞系體外增殖和遷移［12］，青蒿琥酯可通過Wnt信號通路抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲［13］，也能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長［14］，但影響機(jī)制尚需探討。

目前β-cat成為治療結(jié)腸癌藥物的重要靶點(diǎn)之一［15］，對Wnt信號通路的研究也多集中于β-cat的積累和入核，對下游轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF知之甚少。而TCF/LEF在Wnt/β-cat信號通路中起著分子開關(guān)的作用，β-cat進(jìn)入細(xì)胞核后，與TCF/LEF結(jié)合形成復(fù)合物，調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)。許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展與 TCF/LEF家族密切相關(guān)［16-18］。研究發(fā)現(xiàn)，在核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF未激活的情況下，APC基因可以激活半胱氨酸家族成員，如caspase-3，然后清除多聚合酶，使得細(xì)胞發(fā)生破碎，從而引起細(xì)胞凋亡。Jeong等［19］研究發(fā)現(xiàn)，TCF4在人多種大腸癌細(xì)胞中高表達(dá)，而正常細(xì)胞表達(dá)很低，通過藥物誘導(dǎo)TCF4低表達(dá)，可以抑制β-cat/TCF4轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的凋亡。周密等［20］用熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒法，研究Lovo細(xì)胞中TCF4/LEF與靶基因c-Myc/Max的轉(zhuǎn)錄活性降低來說明藥物美洛昔康能明顯下調(diào)細(xì)胞Wnt/β-cat通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ART能明顯抑制TCF4/LEF報(bào)告質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性。Western blot研究發(fā)現(xiàn)，隨著ART濃度的升高，GSK-3β表達(dá)上調(diào)，而β-cat和c-Myc表達(dá)下調(diào)，這可能是通過GSK-3β催化活性增強(qiáng)，誘導(dǎo)破壞復(fù)合體Axin-APC-GSK-3β形成，促進(jìn)β-cat降解，減少向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，抑制TCF4/LEF報(bào)告質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性，一方面使下游靶基因c-Myc的表達(dá)減弱；另一方面能促進(jìn)凋亡關(guān)鍵蛋白caspase-3表達(dá)，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。

總之，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)其凋亡，可能通過上調(diào)GSK-3β，下調(diào)β-catenin和c-Myc，抑制Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。通過體外研究我們還發(fā)現(xiàn)，ART能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移［21］，下一步我們將進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，建立結(jié)腸癌動(dòng)物模型，進(jìn)一步研究ART抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。

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Compared with the control group，the inhibitory rate of cell proliferation at 72 h and 320 μmol·L-1ART was （78.99±1.95）% （F=898.301，P=0.000）；the cell apoptotic rate at 24 h and 160 μmol·L-1ART was（19.00±0.05）%and morphological signs of cell apoptosis were found by EM；the transcriptional activity of TCF4/LEF at 24 h and 160 μmol·L-1ART was （0.36±0.30）%（F=470.954，P＜0.01）；the expressions of caspase-3 and GSK-3β were significantly increased，while β-catenin and c-Myc were significantly decreased when treated with different concentrations of ART for 48 h（P＜0.01）.ConclusionART may significantly inhibit proliferation and promote apoptosis of Lovo cells probably by inactivating Wnt/β-catenin pathway.

Study on the relationship between promoting apoptosis effect of artesunate and Wnt/β-catenin pathway in colon cancer cells

GUO Ying1，TIAN Zhi-yu2，F(xiàn)U Hang3，SUN Li4，LIU Fang4，LUO Qiang4，ZHANG Lin-xi4
（1.Dept of Pathology，2.Major of Clinical Medicine，Grade 2013，3.Major of Medical Image，Grade 2012，4.Life Science Research Center，Hebei North University，Zhangjiakou Hebei075000，China）

AimTo investigate the promoting apoptosis effect of artesunate（ART）on human colon cancer Lovo cells and its mechanisms.MethodsMTT assay was performed to determine the anti-proliferative effect of artesunate.Flow cytometry assay and electron microscopy（EM）were used to evaluate the apoptotic effect of artesunate.Luciferase reporter assay was introduced to measure the activation of Wnt/β-catenin pathway. Western blot was used to detect the pathway-related protein levels of β-catenin，GSK-3β，c-Myc and apoptosis-related protein level of casepase-3.Results

artesunate；colon cancer cells；proliferation；apoptosis；Wnt/β-catenin pathway；TCF4/LEF

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.022

A

1001-1978（2016）05-0707-05

R-332；R322.11；R329.24；R542.22；R845.22

2016-01-19，

2016-02-20

河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究青年基金項(xiàng)目（No QN2013 1078）；河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（No ZD20131004）

郭穎（1982-），女，碩士，講師，研究方向：消化道腫瘤病理學(xué)，E-mail：guoyingguo2008@163.com；張林西（1968-），男，博士，教授，研究方向：消化道腫瘤病理學(xué)，E-mail：zlxwx1@163.com